Extracto
A pesar del reciente avance en la medicina, casi el 50% de los pacientes con cáncer colorrectal espectáculo de recurrencia de la enfermedad. Aunque las razones de la alta recidiva no se entienden completamente, la presencia de células quimio y radioterapia del cáncer resistente a la madre /madre-similares, en los que se upregulated muchos oncomiRs como microARN-21 (miR-21), podría ser uno de los que subyace causas. miR-21 regula los procesos de invasión y metástasis mediante la regulación negativa múltiples genes supresores de tumores metastásicos /incluyendo PTEN (fosfatasa y homólogo de tensina). proteína supresora de tumores PTEN controla la auto-renovación de las células madre. De hecho, nuestros datos actuales demuestran una regulación a la baja marcada de PTEN en xenoinjertos de ratones SCID de miR-21 sobre-expresión de las células de cáncer de colon HCT116. Colonospheres que son altamente enriquecido en madre de cáncer /madre como las células revelan un incremento de miR-21 y la disminución de la expresión de PTEN. curcumina difluorado (CDF), un nuevo análogo de la curcumina ingrediente dietético, que se ha demostrado que inhibe el crecimiento de células de cáncer de colon resistente a 5-fluorouracilo + oxaliplatino, downregulated miR-21 en HCT116 de cáncer de colon quimio-resistentes y las células HT-29 y restaurado los niveles de PTEN, con la consiguiente reducción en la fosforilación de Akt. Resultados similares se observaron también en las células SW620 de cáncer de colon metastásico. Desde PTEN-Akt confiere resistencia a los fármacos a diferentes tumores malignos, incluyendo el cáncer colorrectal, nuestra observación de la normalización de la vía de miR-21-PTEN-Akt por CDF sugiere que el compuesto podría ser un agente terapéutico potencial para el cáncer colorrectal resistente a la quimioterapia.
Visto: Roy S, Yu Y, Padhye SB, Sarkar FH, Majumdar AP (2013) difluorado-curcumina (CDF) Restaura la expresión de PTEN en células de cáncer de colon por abajo de la regulación de miR-21. PLoS ONE 8 (7): e68543. doi: 10.1371 /journal.pone.0068543
Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Marzo, 2013; Aceptado: 30-may de 2013; Publicado: 24 Julio, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas al Dr. Majumdar de los Institutos Nacionales de /Instituto Nacional de la Salud sobre el Envejecimiento (AG014343) y el Departamento de Administración de Veteranos (VA Merit Review). Los fundadores de esta investigación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el desafío emergente en el tratamiento del cáncer colorrectal (CCR), el tercer cáncer más común, es la recaída de la enfermedad. Casi el 50% de los pacientes de CRC muestran recurrencia de la enfermedad. La presencia de la radio-terapia de quimio y madre de cáncer resistentes /células madre similares (los CAC /CSLCs) podría ser una de las causas subyacentes [1]. Estas células son pequeña población de células que inician tumorales indiferenciadas que tienen capacidad de auto renovación infinita y por lo tanto se conocen como células iniciadoras de tumores [2]. PTEN (fosfatasa y homólogo de tensina), un gen supresor de tumores se ha informado a jugar un papel en las células madre de auto-renovación [3]. PTEN actúa como una fosfatasa de lípidos para desfosforilar fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3), antagonizar la vía de la PI3-K /Akt. Regulación a la baja de PTEN en diferentes tumores humanos se ha demostrado que el resultado de la resistencia a la terapia convencional y la recurrencia del cáncer después del tratamiento inicial [4]. La vía de PTEN-Akt confiere resistencia a los medicamentos a diferentes tumores malignos, incluyendo el cáncer colorrectal [5], [6], [7], [8].
PTEN es una de las proteínas diana de miR-21, que es upregulated en muchos tumores malignos, incluyendo el cáncer colorrectal [9]. microRNAs regulan negativamente la expresión de genes diana por escisión de ARNm o a través de la represión de traducción [10]. miR-21 no sólo regula el crecimiento del tumor, sino también la invasión y metástasis por la orientación múltiples /genes supresores de tumores metastásicos, tales como PTEN [11]. Hemos informado que las células HCT116 de cáncer de colon y HT29 [(CR) de quimioterapia resistente a] resistentes 5-fluorouracilo y oxaliplatino (FU-Ox) exhiben enriquecimiento de CSC /CSLCs y niveles elevados de maduro miR-21 y que el miR-21 inducen stemness en células de cáncer de colon [12]. Estas observaciones nos llevó a la búsqueda de agente (s) que modulan los eventos celulares que se asocian con miR-21-inducción de stemness en células de cáncer de colon.
curcumina difluorado (CDF), un análogo no tóxico de la dieta curcumina ingrediente con una biodisponibilidad mucho mayor que el compuesto original [13], [14], es uno de tales compuestos. CDF se ha demostrado que modulan la expresión de miR-21 y PTEN en el cáncer de páncreas [15], [16], [17], [18] y para inhibir el crecimiento de células de cáncer de CR colon, e induce la desintegración de colonospheres que son altamente enriquecida en células madre cancerosas /CSLCs [19]. Además, se encontró CDF para regular la expresión de miR-34 [20], lo que se dice estar regulado por disminución en el cáncer de colon [21]. Para determinar si la inhibición mediada por CDF del crecimiento del cáncer de colon CR podía atribuirse en parte a la restauración del eje-Akt miR-21-PTEN, hemos examinado (a) la relación entre el miR-21 y PTEN y (b) el efecto de CDF en la expresión de miR-21, PTEN y la activación de Akt eje en diferentes células de cáncer de colon.
Materiales y Métodos
líneas celulares y condiciones de cultivo
el colon humano las células de cáncer HCT-116 (p53 de tipo salvaje;
K-ras mutante
), HCT-116 (p53 nula;
K-ras mutante
), HT-29 (p53 mutante;
K-ras
en peso) y SW620 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Se generaron (CR) las células de cáncer de colon quimio-resistentes en nuestro laboratorio como se describe anteriormente [12]. Brevemente, las células HCT116 y HT29 se incubaron con una dosis clínicamente relevante de FU-Ox (25 mM de 5-FU y 0,625 M de oxaliplatino) durante 72 horas. El medio se retiró y las células adherentes, que sobrevivieron a la insulto FU-Ox, se cultivaron en DMEM que contenía 10% de FBS sin los fármacos durante 3 a 4 días. El ciclo FU-Ox Add-Remove se repitió 12 veces. Las células supervivientes se pasaron a continuación, y se expusieron a dosis más altas de combinación de FU-Ox (100 M de 5-FU + 2,5 M de oxaliplatino) durante 2-3 semanas. Finalmente, las células quimio-resistentes se mantuvieron en medio de cultivo normal que contiene 50 mM 5-FU + 1,25 M oxaliplatino. SW620 línea celular de cáncer de colon se mantuvo en RPMI, suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS)
Colonospheres se generaron a partir HCT116 y HT29 líneas celulares parentales utilizando DMEM /F12. (1: 1) suplementado con B27 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), como se informó anteriormente [12] [22]. Brevemente, se permitió que las células de crecer en (medios de células madre) no diferenciar condición en placas de baja fijación de ultra (Corning Inc, Lowell, MA) durante 10-14 días. El medio de células madre fue suplementado con B27 ,, 20 ng /ml EGF (Sigma, St Louis, MO), 10 ng del factor de crecimiento de fibroblastos /ml (Sigma), y antibiótico /antimicótico. Hacia el final de 5 días, las células sólo el tallo-como fueron capaces de sobrevivir en condiciones no adherentes mientras que los no-madre como las células se extinguió. medios de células madre fresca se proporcionó a las células supervivientes cada 5 días. Los esferoides formados se fotografiaron a 10 × magnificación. Las células se pasaron usando 0,05% de tripsina-EDTA (Invitrogen) cuando confluente.
Tratamiento de líneas celulares de cáncer de colon
CDF se disolvió en DMSO. En su caso, CR HCT116, CR HT29 o células SW620 fueron tratados con 100 nM CDF durante 72 horas. Las células de control recibieron 0,05% de DMSO. Después de 72 h, las células fueron sometidas a ADN, ARN y proteínas aislamiento.
muestras de tejido de xenoinjerto
El protocolo de investigación con animales fue aprobado por la Universidad Estatal de Wayne Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) . Xenoinjerto derivado de las células HCT116, transfectadas establemente ya sea con miR-21 o el vector (pCMV), se generaron en ratones SCID como se informó anteriormente [12]. (FFPE) los tejidos de xenoinjerto en parafina fijados con formol se utilizaron para ARN aislado utilizando miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) de ARN se describe anteriormente [20].
Real-time RT-PCR
se aislado a partir de tejidos FFPE utilizando miRNeasy FFPE kit (Qiagen) y a partir de células cultivadas utilizando kit miREasy (Qiagen). Veinte nanogramos de ARN total fueron transcritas invertir en cDNA utilizando universal de síntesis de cDNA Kit (Exiqon, Woburn, MA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para estimar los niveles relativos de PTEN-mRNA, 500 ng de ARN se transcribe de forma inversa en ADNc usando el kit Gene Amp oro RNA PCR (Applied Biosystems). PCR en tiempo real se realizó utilizando cebadores específicos para el miR-21 (Exiqon) y PTEN [23] junto con SYBR
® verdes Reactivos de PCR (Applied Biosystems). La cantidad relativa de miR-21 y PTEN-mRNA se normalizaron a RNU1α (Exiqon) y el gen de β-actina humana, respectivamente.
se realizó análisis de transferencia de Western
análisis de transferencia Western de acuerdo con nuestro nivel Protocolo [22]. En resumen, se lisaron las células; la concentración de proteína se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad). Los lisados se sometieron a electroforesis por SDS-PAGE y las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (difluoruro de polivinilideno) (Millipore) seguido de bloqueo con BSA a temperatura ambiente durante 1 h. Después se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C, posteriormente se lavó y se incubó con anticuerpos secundarios compatibles. Las bandas de proteínas se visualizaron por ECL Western Blot reactivo primer detección (GE Healthcare Biosciences). Las membranas fueron despojados según sea necesario para el sondeo más.
Luciferase Assay
células HCT116-CR fueron transfectadas ya sea con anti-sentido miR-21 o control negativo [NC] (Ambion) junto con el plásmido indicador de luciferasa que tiene la secuencia de PTEN 3'UTR semilla para miR-21 [11] y PMIR-INFORME plásmido de control b-gal ADN (Applied Biosystems) utilizando Lipofectamine
TM 2000, de acuerdo con el protocolo del manufaturer. Seis horas después de la transfección, se cambió el medio y las células transfectadas con NC se incubaron con 100 nM CDF para 24 h. La actividad de luciferasa se determinó utilizando el kit de luciferasa Promega siguiendo el protocolo del manufaturer. β-galactosidasa ensayos se realizaron para normalizar la variabilidad de la transfección. Los datos se presentan como la actividad de luciferasa relativa por microgramo de proteína.
El análisis estadístico
Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. Las comparaciones de las variables continuas entre dos grupos independientes se calcularon utilizando la prueba t de Student de dos colas. El valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
expresión de PTEN se downregulated en el miR-21 que expresan exceso de xenoinjertos
PTEN es un objetivo de. oncomir miR-21. Para examinar la relación entre el miR-21 y PTEN, xenoinjertos de ratones SCID derivados de miR-21 se analizaron sobre-expresión de las células HCT116 (miR-21) y el control de las células transfectadas con el vector (pCMV) para la expresión de miR-21 y PTEN . Como era de esperar, los datos de análisis de QRT-PCR revelaron que los niveles relativos de miR-21 fueron significativamente mayores en los xenoinjertos de miR-21 sobre-expresión de las células HCT-116, en comparación con los controles (Fig. 1A). En contraste, los niveles de ARNm de PTEN en xenoinjertos de miR-21 significativamente se disminuyeron en comparación sobre-expresión de las células a los controles (Fig. 1B). Tomados en conjunto, los resultados muestran una relación inversa entre el miR-21 y PTEN. Esta observación es similar a lo que hemos señalado anteriormente para los niveles de proteína PTEN en 21-miR células de cáncer de colon hyperexpressing HCT-116 (12).
cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó con ARN aislado de parafina fijados con formol y embebidos xenoinjertos.
vía de PTEN-Akt se activa en colonosphere
Colonospheres, considerado como tumores sustitutos, son altamente enriquecido en CSC /CSLCs [22]. Para determinar si miR-21 y su PTEN proteína diana están involucrados en la regulación de las propiedades funcionales de colonospheres, las expresiones de miR-21, PTEN y Akt, los efectores aguas abajo de PTEN se analizaron en colonospheres generados a partir de HCT116 y HT29. Ambas líneas celulares HCT116 y HT29 formaron esferoides bien redondeados (figuras 2A y amp;. B, panel superior). La expresión de miR-21, como se determina por qRT-PCR, se encontró que era 4-5 veces mayor en colonospheres, formado por las dos líneas celulares, en comparación con sus células parentales correspondientes (figuras 2A & amp;. 2B; panel central). Por otro lado, el análisis de Western-blot reveló disminución de la expresión de PTEN en colonospheres, en comparación con las células parentales correspondientes (Figs 2A y amp;. 2B, panel inferior). Como era de esperar, la reducción de PTEN en colonospheres se asoció con un aumento de la activación de Akt, como se demuestra por marcados aumentos en las concentraciones relativas de p-Akt en comparación con las células parentales correspondientes (Figs 2A y amp;.. 2B panel inferior). Tomados en conjunto, los resultados sugieren que un aumento de miR-21 en colonospheres que conduce a la reducción de PTEN activa vía de señalización Akt, que puede jugar un papel en la regulación de las propiedades tumorigénicas de colonospheres que están enriquecidos en CSC /CSLCs.
CDF restaura la expresión de PTEN en las células de cáncer de colon
Anteriormente, hemos demostrado que las células de cáncer de colon CR no sólo se enriquecen en CSC /CSLCs sino que también expresan niveles significativamente más altos de miR-21 que sus homólogos parentales [12]. Desde CDF anterior ha sido demostrado que inhibe el crecimiento de las células CR HCT116 de cáncer de colon y HT29, nos llevó a determinar si la inhibición del crecimiento inducida por CDF de células de cáncer de colon CR podría atribuirse a la restauración de eje miR-21-PTEN-Akt. De hecho, la expresión de las células HT29 miR-21 en CR HCT116 y se redujo notablemente cuando se incubaron con 100 nM CDF, en comparación con los controles de DMSO correspondientes (figuras 3A & amp;. 3B, panel superior). Esto se asoció con la expresión aumentada de PTEN y la reducción en pAkt (forma activada) en CR HCT116 y las células HT29 (Figs 3A & amp;. 3B; paneles inferiores); no se observó ningún cambio aparente en la forma no fosforilada (total) de Akt en células ya sea CR HCT116 o CR HT29 en respuesta a la CDF (Figs 3A y 3B;. paneles inferiores). El efecto de la CDF en el miR-21 inducida por la expresión de PTEN fue reconfirmada por el ensayo de luciferasa. células CR-HCT116 se transfectaron con la construcción de indicador de luciferasa que contiene PTEN 3'UTR secuencia de semillas miR-21 y posteriormente se incubaron con 100 nM CDF para 24 h. CDF aumentó significativamente la actividad de la luciferasa, por el control (Fig. 3C). Para fines de comparación, las células HCT116-CR fueron transfectadas con anti-sentido-miR-21, que reveló un aumento en la actividad de PTEN-luciferasa (Fig. 3C). Colectivamente, los datos revelan que en las células de cáncer de colon CR, CDF regula a la baja miR-21 que resulta en la regulación positiva de PTEN que conduce a la disminución de la activación de Akt. Estas observaciones sugieren que la CDF restaura el eje de miR-21-PTEN y AKT en las células del cáncer de colon quimio-resistentes (CR).
Los controles fueron incubadas con DMSO. Western-blot (panel inferior) mostraron cambios en las concentraciones relativas de PTEN, y pAkt total de Akt en células HCT116 y HT29 quimio-resistentes en respuesta a la CDF o DMSO. (C) CDF tratamiento o anti-miR-21 transfección aumenta la actividad de la luciferasa en células HCT116 quimio-resistentes transfectadas con la construcción de pGL3-luc que tiene la secuencia de semillas PTEN-miR21. NC = control negativo
A fin de examinar si la CDF afectaría a la expresión de miR-21- PTEN -. Eje Akt en el cáncer de colon metastásico, se llevó a cabo el mismo experimento con la línea celular SW620 que se ha generado a partir de tejido de cáncer de colon metástasis. Como se ha observado para las células HCT116 y CR-HT29, CDF causó una marcada reducción de miR-21 expresión en células SW620 (Fig. 4). Esto se asoció con un aumento de los niveles de PTEN y reducción de la forma fosforilada de Akt, en comparación con los controles correspondientes (Fig. 4).
-transferencias Western (panel derecho) que muestran cambios en la expresión relativa de PTEN, y pakt Akt total en las células SW620 siguiente 72 h de incubación con CDF o DMSO (controles). β-actina humana sirvió como control de carga.
Discusión
A pesar del reciente avance en la medicina, casi el 50% de los pacientes con recidiva tumoral CRC espectáculo. Aunque las razones para esto no se entienden completamente, que en parte puede estar relacionada con la incapacidad de apuntar CSC /CSLCs que expresan marcadores de células madre de cáncer, retener el potencial ilimitado para regenerar y son resistentes a las terapias convencionales [24] que resulta en la quimioterapia de refractario tumores. Esto explicaría por qué es tan difícil de erradicar por completo el cáncer y por qué la recurrencia es una amenaza siempre presente.
A pesar de que en general se cree que surgen células madre del cáncer de las células madre o progenitoras normales tras la mutación [24], una mejor comprensión de los cambios moleculares y bioquímicos asociados con las células madre del cáncer es esencial para el desarrollo de terapias dirigidas. Hemos informado que las células de cáncer de colon CR, que se enriquecen en CSC /CSLCs, forman fácilmente esferoides y exhiben aumento de la expresión de miR-21, que se ha demostrado ser upregulated en muchos tumores malignos, incluyendo el cáncer de colon [12], [25] . La expresión de miR-21 en la mucosa del colon también se ha encontrado que aumenta durante el envejecimiento, cuando la incidencia de cáncer colorrectal aumenta bruscamente [26]. Aunque el papel preciso de miR-21 en la progresión de la carcinogénesis de colon no se entiende completamente, se informó de miR-21 para inducir la troncalidad en células de cáncer de colon mediante la regulación negativa del receptor de TGF-[26]
.
Los resultados de nuestra actual investigaciones demuestran que los colonospheres, que son altamente enriquecido en CSC /CSLCs con un aumento de la expresión de miR-21 [12], [22], muestran una disminución de la expresión de la proteína supresora de tumores PTEN, un objetivo de miR-21. Nuestros datos actuales muestran también una relación inversa entre el miR-21 y PTEN y apoya la tesis de que el miR-21 regula la expresión de PTEN. La pérdida de PTEN, observada en miR-21 sobre-expresión de las células de cáncer de colon podría ser, en parte responsable de la activación de Akt, como se evidencia por el aumento de los niveles de pAkt en colonospheres. El aumento de la activación de la vía de señalización de Akt podría desempeñar un papel fundamental en la aceleración del crecimiento de xenoinjerto de células de cáncer de colon miR-21-overexpressing en ratones SCID, que se informó anteriormente [12] y podría conferir resistencia a los fármacos a diferentes tumores malignos, incluyendo el cáncer colorrectal [5 ], [6], [7], [8].
miR-21 el potencial "oncomir" nos invocado para buscar agente (s) que podría ser utilizado con eficacia para regular a la baja de miR-21 en el cáncer de colon células y reduciendo así su potencial tumorigénico. Razón fundamental para la consecución de esta línea de investigación proviene de nuestra reciente observación de que la regulación negativa de miR-21 en células de cáncer de colon quimio-resistentes hace que la diferenciación y los hace susceptibles a los agentes contra el cáncer, específicamente la curcumina difluorado (CDF), un análogo del ingrediente dietético curcumina con una mayor biodisponibilidad que el compuesto original [13], [14], [27]. Estudios recientes de este laboratorio han demostrado también que CDF inhibe el crecimiento de células de cáncer de colon CR y también aumenta la expresión de miR-34, que está regulado por disminución en los tumores de colon [20]. Además, estudios anteriores han demostrado que la CDF para modular la expresión de miR-21 y PTEN en el cáncer de páncreas [18]. Por lo tanto, CDF podría ser considerado como un agente terapéutico potencial para los cánceres de páncreas y colorrectal. Por otra parte, nuestra observación de que CDF modula eje de miR-21-PTEN-Akt en las células p53-p53 positivos y negativos de cáncer de colon sugiere que la FCD podría ser terapéuticamente eficaz en tumores p53 positivos y negativos de colon. Curiosamente CDF también se encuentra que es eficaz en la restauración de los niveles de PTEN en la línea celular de cáncer de colon metastásico SW620. Tomados en conjunto, los resultados sugieren que CDF podría ser un agente terapéutico eficaz para diferentes etapas de cáncer de colon. Addtionally, el hecho de que CDF modulación de eje miR-21-PTEN-Akt se observó en células de cáncer de colon quimio-resistentes que son altamente enriquecida en células madre cancerosas /CSLCs sugiere que este nuevo análogo de la curcumina también podría ser terapéuticamente eficaz para el cáncer recurrente, que se sabe que es resistente a la quimioterapia convencional [14].
en conclusión nuestros datos actuales demuestran que miR-21 y PTEN están inversamente relacionados en que un aumento de la expresión de miR-21 resultados en la reducción de PTEN que conduce a la activación de la señalización de Akt. Estos actos pueden desempeñar un papel fundamental en la progresión tumoral. Además, nuestra observación de que miR-21 mediada por la señalización de PTEN-Akt podría normalizarse por CDF en células de cáncer de colon de quimioterapia resistente sugiere que CDF podría ser un agente terapéutico potencial para el cáncer de colon recurrente.
Agradecimientos
pGL3-luc era una especie de regalo del profesor Tushar Patel, Ohio State University y profesor Ghosh Goutam Choudhury, UTHSCSA.