Extracto
Antecedentes
Los marcadores séricos son unas herramientas potenciales para la detección de cáncer colorrectal cáncer (CRC). El objetivo de este estudio fue obtener los perfiles de expresión proteómica e identificar marcadores séricos para la detección precoz del CCR.
Métodos
perfiles proteómicos de muestras de suero recogidas de 35 voluntarios sanos, 35 pacientes con avanzado adenoma colorrectal (ACA), y 40 pacientes con CCR se compararon mediante la tecnología Clinprot. El uso de ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), 366 muestras de suero se analizaron adicionalmente, y se utilizaron los estudios de inmunohistoquímica de 400 tejidos para verificar la expresión de quininógeno-1 y su valor en la detección temprana del CRC.
Resultados
modelos de predicción se establecieron entre los tres grupos, y quininógeno-1 fue identificado como un marcador potencial para el CRC utilizando la tecnología Clinprot. ELISA también detectado en suero significativamente mayor en los niveles de ACA y de pacientes con CRC 1-quininógeno comparación con los controles (
P Hotel & lt; 0,05). Además, el área bajo la curva ROC (AUC) para el suero quininógeno-1 en el diagnóstico de ACA fue 0.635 (P = 0,003), y para el antígeno carcinoembrionario suero (CEA) era 0,453 (P = 0,358). La sensibilidad, especificidad y exactitud de quininógeno-1 en suero para el diagnóstico de la etapa de Duke A y B CRC fue 70,13%, 65,88% y 67,90%, respectivamente, mientras que el CEA en suero fue de 38,96%, 85,88% y 63,58%, respectivamente. Por otra parte, inmunohistoquímica mostró que la expresión de quininógeno-1 fue significativamente mayor en los tejidos de CRC y de ACA que en la mucosa normal (48,39% frente a 15,58% vs. 0%,
P
& lt; 0,05).
Conclusiones
Estos resultados sugieren que la tecnología Clinprot proporciona una herramienta útil para el diagnóstico de CCR, y quininógeno-1 es un biomarcador de suero potencial para la detección temprana de adenoma colorrectal avanzado y CRC.
Visto: Wang J, Wang X, Lin S, Chen C, Wang C, Ma Q, et al. (2013) Identificación de quininógeno-1 como un biomarcador de suero para la detección temprana de adenoma colorrectal avanzado y cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (7): e70519. doi: 10.1371 /journal.pone.0070519
Editor: R. Mitsunobu Kano, Universidad de Okayama, Japón
Recibido: 14 Noviembre 2012; Aceptado: 25 Junio 2013; Publicado: 23 de julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Ciencia y Tecnología de Proyectos Planificación de la provincia de Guangdong (2010B031600098) y el Programa de Desarrollo de Ciencia y Tecnología del municipio de Guangzhou (2.060.402). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
se estima que más de 143.000 personas en los Estados Unidos serán diagnosticados con cáncer colorrectal (CCR) en 2012, y más de 50.000 personas morirán a causa de esta enfermedad [1]. Mediante el cribado de individuos con riesgo promedio, se plantea la hipótesis de que el CRC se pudo detectar en sus primeras etapas, lo que reduce las tasas de mortalidad asociadas con el CRC [2] - [4]. En la actualidad, la detección de CCR puede incluir una prueba de sangre oculta en heces, sigmoidoscopia y colonoscopia [5]. En muchos países de recursos limitados, la prueba de sangre oculta en heces se utiliza sobre todo, a pesar de la insuficiente sensibilidad de este ensayo [6], [7]. Por otra parte, con la sigmoidoscopia y son procedimientos invasivos e incómodos colonoscopia, su aplicación para la detección de CRC se ha limitado [8]. Por lo tanto, se necesitan enfoques menos invasivos y no invasivos para mejorar la sensibilidad y la conformidad del paciente en pruebas de detección de CRC.
La identificación de biomarcadores serológicos específicos para CRC podría proporcionar un método relativamente no invasivo y económicamente ventajoso para la detección de CCR en comparación con las opciones actuales de cribado. Sin embargo, el suero es un fluido corporal complejo que contiene muchas proteínas diferentes. Por ejemplo, más de 10.000 proteínas diferentes se han detectado en el suero humano, y muchas proteínas son secretadas por las células o cobertizo durante diferentes procesos fisiológicos o patológicos [9], [10]. Por lo tanto, es difícil identificar un marcador sérico específico de la enfermedad. Debido a los avances en las metodologías de la proteómica, ahora es posible identificar rápidamente nuevos marcadores candidatos para el cáncer. Por ejemplo, muchos estudios han demostrado las capacidades de láser de desorción /ionización de espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) para separar mezclas complejas de proteínas, facilitando así una comparación de las variaciones en la expresión de proteínas para el normal y muestras de suero cancerosas [11] - [13]. En particular la tecnología, Clinprot, que se basa en MALDI-TOF-MS, tiene muchas ventajas para la aplicación clínica, incluyendo su sensibilidad, facilidad de uso, y la capacidad de análisis de alto rendimiento [14], [15].
el uso de MALDI-MS, Seraglia
et al.
[16] informó anteriormente quininógeno-1 sea un marcador de plasma potencialmente nueva para el CCR. Quininógeno-1 es una proteína multifuncional que juega un papel importante en muchos procesos fisiopatológicos [17], incluyendo la fibrinólisis, la trombosis y la inflamación, así como tener un papel en la oncogénesis [18]. Para confirmar estos resultados e identificar marcadores novela plasma adicionales para CRC, los sueros de pacientes con CCR, los pacientes con adenoma colorrectal avanzado (ACA), y los individuos sanos fueron analizados utilizando la tecnología Clinprot, ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), e inmunohistoquímica.
Materiales y Métodos
Selección de pacientes
Todas las muestras se recogieron del hospital Nanfang. Los sueros fueron recogidos entre el 1 de octubre del 2009 y 31 de diciembre de 2010. Se recogieron tejidos embebidos en parafina del 1 de abril de 1999 y el 31 de diciembre de 2007. Los pacientes con un historial conocido de la poliposis adenomatosa familiar, poliposis cáncer colorrectal hereditario, la hipertensión, cualquier otra tumores, y enfermedades inflamatorias obvias, fueron excluidos. Los siguientes factores se registraron para cada tejido: la edad del paciente, el sexo del paciente, el tamaño del tumor, localización del tumor para el CDN y ACA, la histología del tejido y el grado del tumor para la neoplasia intraepitelial de ACA, la diferenciación, la etapa de Duke, y el tumor-nódulo-metástasis (TNM) etapa (7ª ed) del CCR. adenoma colorrectal pacientes que tienen al menos un adenoma ≥10 mm, o que tienen una estructura vellosa o carcinoma
In situ
, se clasificaron como pacientes ACA [19].
Este estudio se realizó de acuerdo con directrices éticas institucionales y fue aprobado por el Comité de Ética médica de la Universidad médica del Sur (# 2011119). formularios de consentimiento informado por escrito se obtuvieron de todos los pacientes.
Preparación de muestras
Se recogieron los sueros de voluntarios sanos, pacientes ACA, CRC pacientes preoperatorios (antes de cualquier tratamiento clínico obtenidos), y postoperatorias pacientes con CRC (obtenido siete días después de la cirugía). Para el análisis Clinprot, se obtuvieron un total de 110 muestras de suero de voluntarios sanos (n = 35), pacientes de ACA (n = 35), y pacientes con CRC preoperatorios (n = 40). Para los ELISA, se obtuvo un total de 366 sueros de un adicional de 85 voluntarios sanos, 80 pacientes ACA, 143 pacientes con CCR preoperatorios y postoperatorios 58 pacientes con CCR. voluntarios asintomáticos y aparentemente sanos fueron seleccionados que no tienen una historia previa de cáncer. Todas las muestras se recogieron en 5 ml tubos separadores de suero, y luego se incubaron a TA durante 30 min. Después de la centrifugación a 3000 rpm durante 10 min, los sueros se distribuye en alícuotas de 50 l y se almacenó a -70 ° C hasta que se necesite.
Un total de 400 tejidos embebidos en parafina se analizaron por inmunohistoquímica, incluyendo 75 mucosa colorrectal normal de tejidos que se recogieron de voluntarios sanos que se sometieron a una biopsia endoscópica de la mucosa. Además, 77 ACA tejidos se recogieron de pacientes ACA sometidos a resección endoscópica, y 248 CRC tejidos se obtuvieron de pacientes con CRC que se sometieron a cirugía. Todas las muestras se fijaron en solución de formalina al 10% y embebidos en parafina. Se cortaron secciones (4 mM) y se prepararon para la tinción inmunohistoquímica y ensayos de hematoxilina-eosina.
La extracción de péptidos de suero usando perlas magnéticas, seguido por MALDI-TOF-MS Analysis
péptidos de suero se separarse y purificarse utilizando una catiónico débil kit de purificación de cromatografía de intercambio basado en perlas magnéticas (Bruker Daltonics GmbH). Un total de 110 muestras de suero se fraccionaron de acuerdo con el protocolo estándar propuesto por el fabricante. estricto control de calidad se mantiene para asegurar la precisión y reproducibilidad de los resultados obtenidos. perfiles de péptidos de suero se analizaron posteriormente mediante un Ultraflex MALDI-TOF /TOF-MS (Bruker Daltonik, Bremen, Alemania). Los espectros se adquirieron en la masa /carga (m /z) intervalo de 1.000 a 10.000 el uso de software FlexAnalysis (Bruker Daltonics).
Clinpro software de herramientas 2.2 (Bruker, Daltonik) se utilizó para el análisis de todos los datos derivados de muestras de suero. Esto incluye los datos brutos obtenidos antes del tratamiento, la resta de los espectros de línea de base, la normalización de los espectros, la alineación internas de los máximos usando picos prominentes, y un procedimiento de pico de cosecha. Por otra parte, los datos pretratados se visualizaron y se analizaron estadísticamente utilizando la prueba t y algoritmos genéticos (GA) Estudiante. Además, los modelos de predicción se establecieron utilizando el GA. Para determinar la exactitud de los modelos de predicción generados, se llevó a cabo la validación cruzada. En resumen, se seleccionan todas las muestras como un conjunto de entrenamiento en el algoritmo predictor clase, a continuación, se utilizaron las mismas muestras a excepción de una muestra seleccionada al azar como un conjunto de ensayo. Una "prueba" fue entonces realizó diez veces al azar.
péptido de identificación por MALDI-TOF /TOF
Después de completar el análisis estadístico, se identificaron los péptidos expresados diferencialmente. Inicialmente, las masas mono-isotópica de péptidos en el rango de m /z de 1000 a 3000 se determinaron utilizando un modo de reflexión. Después de espectros MS /MS de iones precursores fueron adquiridos en el modo TOF /TOF, MS /MS datos fueron sometidos a una búsqueda de base de datos de la mascota para identificar los correspondientes partidos proteína de longitud completa.
Enzyme-ensayo inmunoenzimático ( ELISA)
Todos los sueros se analizaron de una manera ciega, y los estándares y las muestras se realizaron por triplicado. concentraciones quininógeno-1 se cuantificaron utilizando un kit ELISA quininógeno humano (Nº EK2001-1, Assaypro, MO, EE.UU.). En la práctica: (1) 25 l estándar o de muestra y 25 l quininógeno biotinilado se añadió a 96 pocillos microplacas de poliestireno revestida con un anticuerpo policlonal contra quininógeno humano. Después de 2 h a TA, las placas se lavaron cinco veces, a continuación, 50 l conjugado de estreptavidina-peroxidasa se añadió a cada pocillo. Después de 30 min a RT, las placas se lavaron cinco veces y se añadieron 50 l de sustrato cromógeno a cada pocillo. Después de un color azul suficientemente desarrollada, se añadió solución de parada 50 l a cada uno de los valores así y la absorbancia a 450 nm se registraron utilizando un lector de microplacas. Una curva estándar se genera y se utiliza para determinar las concentraciones de quininógeno-1 presente en las muestras analizadas.
Para detectar los niveles séricos de CEA, un kit de inmunoensayo enzimático comercialmente disponible (Whiga, Guangzhou, China) fue utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
la inmunohistoquímica
anticuerpo quininógeno-1 se adquirió de Santa Cruz de Biotecnología (sc-25799, CA, EE.UU.). Un protocolo publicado previamente se utilizó para los ensayos de inmunohistoquímica [20], con quininógeno-1 anticuerpo diluido 1:150. Todas las secciones fueron evaluados microscópicamente ciega e independiente por dos patólogos bien entrenados. La intensidad de la tinción se evaluó utilizando un sistema de puntuación semicuantitativo de la siguiente manera: 0, tinción negativa; 1, tinción débil; 2, tinción moderada; y 3, fuerte tinción. La distribución de la tinción también se clasificó de acuerdo con el porcentaje de células teñidas presentes en la región de interés: 0, las células positivas constituidas & lt; 10% de las células tumorales; 1, las células positivas constituidas 10-50% de las células tumorales; 2, las células positivas constituyen el 50-75% de las células tumorales; o 3, las células positivas constituido & gt; 75% de las células tumorales. Se añadieron las puntuaciones de intensidad y distribución para proporcionar una puntuación global para cada muestra. En pocas palabras, se consideraron las muestras que reciben cero puntos negativos (0), se consideraron los casos que reciben 1-3 puntos débilmente positivo (1+), los casos que reciben 4-7 puntos se consideraron moderadamente positivo (2+), y los casos que reciben una puntuación final & gt ; 7 fueron considerados fuertemente positiva (3+)
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 13.0.. Para probar las diferencias entre los grupos, se aplicó la prueba de Chi-cuadrado, con la excepción de que se aplicó la prueba t de Student para la edad. Las correlaciones entre las puntuaciones de inmunohistoquímica determinados para quininógeno-1 y los parámetros clínico de la cohorte fueron evaluados utilizando el coeficiente de correlación de rangos de Spearman orden. Se han encontrado concentraciones de quininógeno-1 y CEA tener una distribución normal. Por lo tanto, estos datos se compararon mediante un análisis de una sola vía de la prueba de varianza. Por el contrario, las comparaciones múltiples se analizaron usando métodos de LSD. Los datos se expresaron como la media ± error estándar de la media (SEM). Características operativas del receptor se utilizaron (ROC) para determinar los valores de quininógeno-1 en suero y CEA para el diagnóstico de los tumores colorrectales. El Kaplan-Meier (log-rank test) se utilizó para el análisis de supervivencia. Para todos los análisis, un valor de p inferior a 0,05 se consideró significativo.
Resultados
perfiles proteómicos de ACA y el CRC de suero de pacientes
Un total de 110 muestras de suero obtenidas a partir de 35 voluntarios sanos (controles), 35 pacientes ACA, y 40 pacientes con CRC preoperatorios fueron sometidos a análisis de Clinprot. Las principales características clínico-patológicas de los pacientes se muestran en la Tabla S1. Los espectros representativos de cada uno de estos grupos se muestran en la Fig. 1A, y las diferencias en la intensidad de la posición y el pico máximo se pueden observar. Utilizando el análisis de MALDI-TOF, se identificaron 70 picos distinguibles en el rango de 1000 a 10000 m /z entre muestras de suero de los controles y los pacientes ACA, y 43 de estos picos fueron estadísticamente significativas (P & lt; 0,01, detalles en Materiales S1). Además, 61 picos se distinguieron entre sueros control y sueros de pacientes de CRC, con 54 de estos picos son estadísticamente significativas (P & lt; 0,01, detalles en Materiales S2) guía
A:. Los espectros de masas Representante de suero de control (una ), el suero de un paciente con ACA (b), y el suero de un paciente con CRC (c). B: MALDI /MS /MS Los espectros de los iones en m /z 1943,95 (a) y m /z 2081,01 (b). El panel C proporciona los resultados de las búsquedas en la base de datos de la mascota, lo que indicaba ambos picos corresponden a quininógeno-1.
El uso de uno de cada cinco picos, GA fue capaz de generar modelos de clasificación con validación cruzada de los diferentes grupos. Los mejores modelos de predicción (detalles en la Tabla 1) alcanzaron una capacidad de reconocimiento de 98.96%, 100,00%, 100,00% para las comparaciones de CRC y control, ACA y el control, y la ACA y el CRC, respectivamente. Por otra parte, las estimaciones de corte de validez fueron 95.49%, 100,00%, y 98,19%, respectivamente.
Identificación de marcadores de CRC
Una mayor concentración de péptidos con valores de m /z de 1943 y 2081 fueron evidentes en los espectros de CRC, pero no en los espectros de control (
P Hotel & lt; 0,01). El uso de MALDI-TOF /TOF-MS y la base de datos Mascot (Fig. 1B), MS /MS fragmentación de estos dos péptidos identificados las siguientes secuencias, NLGHGHKHERDQGHGHQ y HNLGHGHKHERDQGHGHQ, respectivamente. Por otra parte, se encontró que estos péptidos para representar regiones del mismo quininógeno-1 precursor, el inhibidor de la proteinasa a2-tiol.
Concentraciones séricas de quininógeno-1 y CEA para los diferentes sueros Grupos en
Para validar la expresión de quininógeno-1 detectado en sueros de pacientes con CRC, ensayos de ELISA en suero se realizaron con 366 sueros obtenidos de 85 voluntarios sanos, 80 pacientes ACA, 143 pacientes con CRC preoperatorios, y 58 pacientes con CRC postoperatorias. La edad, el género, el suero quininógeno-1 concentraciones y concentraciones de CEA entre los diferentes grupos se muestran en la Tabla 2. Las concentraciones medias de quininógeno-1 detectados en los controles y pacientes con CRC preoperatorios fueron 153.22 ± 8,43 mg /ml y 215.62 ± 7.63 g /ml, respectivamente, siendo este último significativamente mayor (
P = 0,000
). Además, los niveles de quininógeno-1 fueron significativamente inferiores en los pacientes con CCR después de la cirugía (188.04 ± 11.70 g /ml;
P = 0,044
). Para los pacientes ACA, la media quininógeno-1 concentración detectada fue 194,26 ± 10,14 g /ml, que fue significativamente mayor que la del grupo control (
P =
0.003). En contraste, no hubo diferencia significativa entre cininógeno-1 concentraciones detectadas en los pacientes de CRC pacientes preoperatorios y ACA (
P = 0,082
).
Para las concentraciones séricas de CEA, los niveles de preoperatorio pacientes con CRC, pacientes con CRC postoperatorias, pacientes ACA, y los controles fueron 14.66 ± 2.25 mg /l, 4,48 ± 0,72 mg /l, 3,10 ± 1,15 mg /l, y de 2,43 ± 0,28 mg /l, respectivamente (ACA
vs.
control sano,
P = 0,797
;.. CRC
versus control
sana,
P = 0,000
)
Valor diagnóstico de suero quininógeno -1 y CEA para colorrectal tumores
para evaluar el valor diagnóstico de quininógeno-1, se realizó un análisis de la curva ROC. Como se muestra en la Fig. 2 Aa, el área bajo la curva ROC (AUC) para el suero quininógeno-1 en asociación con un diagnóstico de ACA fue 0,635 (IC del 95%: 0,551-0,719, P = 0,003), mientras que el AUC asociado con un diagnóstico de CRC era 0,706 (IC del 95%:. 0,635 a 0,777, p = 0,000; figura 2 Ac). Sobre la base de estas curvas ROC, un suero quininógeno-1 concentración de 162.99 g /ml fue seleccionado como el valor de corte óptimo para diferenciar los pacientes y los controles de la ACA, con la sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos y negativos, y tasas de precisión siendo 51.25%, 63.53 %, 56,94%, 58,06% y 57,58%, respectivamente. Del mismo modo, un suero quininógeno-1 concentración de 173,96 g /ml fue seleccionado como el valor de corte óptimo para diferenciar los pacientes y los controles de CRC, con la sensibilidad asociada, especificidad, valores predictivos positivos y negativos, y tasas de precisión siendo 63.64%, 65.88%, 75,83%, 51,85% y 64,47%, respectivamente
a:. la curva ROC para el suero quininógeno-1 (a) y CEA (b) para el diagnóstico de la ACA, y la curva ROC para el suero kininogen- 1 (c) y CEA (d) para un diagnóstico de CRC. B: una comparación de la sensibilidad (Se), especificidad (E), valor predictivo positivo (VP +), el valor predictivo negativo (PV), y la precisión (Ac) tarifas de detección de quininógeno-1 y CEA para un diagnóstico de Duke las fases a y B CRC (a) o de la etapa C de Duke y D CRC (b) guía empresas
El ABC de CEA en suero como un diagnóstico de ACA fue 0,459 (IC del 95%:. ,370-,547, P . = 0,358; figura 2 Ab), y como un diagnóstico de CCR fue 0,695 (IC del 95%: 0,627-0,767; p = 0,000; figura 2 AD).. El valor de corte ampliamente aceptada de 5 g /l de CEA en suero se utilizó en este estudio ya que el valor de corte calculado a partir de la curva ROC fue de 5,095 mg /L. Por lo tanto, utilizando este valor de corte para diferenciar pacientes con CRC y controles, la sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos y negativos, y las tasas de precisión se encontró que eran 38,46%, 85,88%, 82,09%, 45,34% y 56,14%, respectivamente. Por lo tanto, CEA se asoció con menores tasas de sensibilidad y precisión en comparación con quininógeno-1.
También se utilizaron los cinco parámetros antes mencionados para evaluar quininógeno-1 y la detección de CEA para la fase A de Duke y los pacientes B CRC. Para quininógeno-1, las tasas fueron del 70,13%, 65,88%, 65,06%, 70,88% y 67,90%, respectivamente. Para CEA, las tasas fueron del 38,96%, 85,88%, 71,43%, 60,83% y 63,58%, respectivamente. A excepción de la especificidad y los valores predictivos positivos, los valores de los otros parámetros asociados con quininógeno-1 eran mejores que los de CEA (Fig. 2 Ba). Cuando se analizaron los pacientes etapa C y D de CRC de Duke, las mencionadas cinco parámetros para quininógeno-1 eran 72,73%, 65,88%, 62,34%, 75,68% y 68,87%, respectivamente, y para CEA, fueron 34,85%, 85,88%, 65,71 %, 62,93% y 63,58%, respectivamente. Al igual que en la fase A del Duque y los pacientes de CRC B, los parámetros para quininógeno-1, con la excepción de especificidad y valores predictivos positivos, eran mejores que los de CEA (Fig. 2 Bb). Además, la sensibilidad, valor predictivo negativo y tasas de precisión se mejora cuando los pacientes con CCR tuvieron un resultado positivo para quininógeno-1 en suero y /o suero CEA. En contraste, las tasas de especificidad asociados con estas pruebas positivas disminuyeron sustancialmente (Tabla 3).
niveles de expresión de quininógeno-1 en Normal colorrectal mucosa, ACA Los tejidos, y tejidos de CRC
quininógeno -1 se puede detectar en la sangre en condiciones fisiológicas. Sin embargo, no queda claro si los niveles más altos de quininógeno-1 detectados en el suero de pacientes con tumores colorrectales se deriva del propio tumor colorrectal. Por lo tanto, se realizaron ensayos de inmunohistoquímica para evaluar la expresión de quininógeno-1 en tejidos colorrectales. Se examinaron un total de 75 tejidos normales de la mucosa colorrectal, 77 tejidos ACA, y 248 tejidos de CRC. No se encontró diferencia significativa en la expresión de quininógeno-1 entre machos frente a las hembras entre los tres grupos (
P
& gt; 0,05). Además, la inmunorreactividad para quininógeno-1 se encuentra en el citoplasma de las células de ACA y CRC (Fig. 3 A-C), y el nivel de expresión de quininógeno-1 fue significativamente mayor en los tejidos de CRC que en los tejidos de ACA o mucosa normal (48,39 %
vs
15.58%
vs
0%,
P Hotel & lt;.. 0,05; Fig. 3D)
immunostainings representativos de quininógeno-1. en mucosa normal colorrectal (a), el tejido ACA (B), y el tejido CRC (C). Tanto la información (20 ×) y ampliación (40 ×) se proporcionan imágenes, con esta última disposición en cajas empotradas en la esquina superior izquierda de cada panel. D: La cuantificación de cininógeno-1 en los niveles de control de los grupos, ACA, y CRC. E: curvas de supervivencia para el control de grupos, ACA, y CRC. La línea azul representa CRC pacientes negativos para quininógeno-1 de expresión y la línea verde representa CRC pacientes positivos para quininógeno-1 de expresión.
Correlación de quininógeno-1 de expresión con las características clinicopatológicas de ACA y CRC pacientes
Las correlaciones entre los niveles citoplasmáticos quininógeno-1 y las características clinicopatológicas de ACA y pacientes con CRC se analizaron por separado. Si bien se encontró acumulación citoplasmática de quininógeno-1 se correlaciona negativamente con la histología del tejido de pacientes ACA (
r
s
= -0,250, p = 0,029), no se correlacionó con la localización del tumor, el tamaño del tumor, o grado de neoplasia intraepitelial (todos los
P Hotel & gt; 0,05, detalles en la Tabla S2). Por el contrario, la acumulación citoplasmática de quininógeno-1 se correlacionó significativamente con el estado de la metástasis escenario y los ganglios linfáticos de Duke para el CRC (
r
s
= 0,151, P = 0,018 y
r
s
= 0,128, P = 0,045, respectivamente). Sin embargo, no se correlacionó con la localización del tumor, el tamaño del tumor, la diferenciación de las células tumorales o metástasis a distancia (todo el
P Hotel & gt; 0,05, detalles en el cuadro S3).
Análisis de supervivencia
CRC pacientes (n = 110) fueron analizados para evaluar una posible asociación entre quininógeno-1 inmunoreactividad y la supervivencia del paciente. En la Figura 3E, la curva de supervivencia de acuerdo con cininógeno-1 citoplasmáticos niveles se muestra. El tiempo de supervivencia media para los pacientes con CRC negativa frente positiva quininógeno-1 fue 45.21 ± 3.17 meses y 38.15 ± 3,07 meses, respectivamente. Por lo tanto, los pacientes con negativo quininógeno-1 de expresión tenían una supervivencia más larga que aquellos con positivo quininógeno-1 de expresión, aunque la diferencia no fue significativa (
P = 0,166
).
Discusión
la detección de adenomas y las primeras etapas del CRC ha disminuido la incidencia y la mortalidad del CCR en los EE.UU. durante las últimas décadas [3]. Sin embargo, los métodos de detección actuales no ofrecen una buena sensibilidad. Por lo tanto, continúan los esfuerzos para ser dirigido hacia el desarrollo de nuevos marcadores séricos de diagnóstico o selección para el CCR. Además, los avances en tecnología proteómica han facilitado la identificación de nuevos biomarcadores. En particular, la tecnología Clinprot se ha encontrado que proporciona resultados altamente precisos y reproducibles, un buen nivel de sensibilidad, y es compatible con un formato de alto rendimiento para la identificación rápida de las proteínas [21]. En consecuencia, los perfiles proteómicos para diversas enfermedades humanas se han obtenido usando Clinprot metodología [22] - [24]. En el presente estudio, el protocolo Clinprot proporcionan modelos de predicción de la CRC y ACA en comparación con los controles sanos, y también entre ACA y el CRC. Por otra parte, las capacidades de reconocimiento de estos modelos fueron 98.96%, 100,00%, 100,00%, respectivamente. Por lo tanto, quininógeno-1 fue identificado como un marcador potencial de la CRC y ACA, y estos resultados se validaron utilizando ELISA. Tomados en conjunto, estos resultados confirman la precisión de la tecnología Clinprot.
La acumulación de pruebas continúa demostrando un papel para quininógeno-1 en la carcinogénesis [25]. Por ejemplo, los niveles significativamente reducidos de quininógeno-1 se han detectado en la orina de pacientes con carcinoma de ovario en comparación con los sujetos control [26]. Estudios previos han demostrado también que quininógeno-1 exhibe propiedades antiangiogénicas y media acciones inhibitorias sobre la proliferación de las células endoteliales [27]. Además, en pacientes con cáncer, los niveles más bajos de quininógeno-1 de expresión han sido detectados en muestras de sangre, y estos niveles pueden contribuir a la supervivencia de las células cancerosas presentes [28]. Sin embargo, el papel de quininógeno-1 en la carcinogénesis, especialmente en CRC, sigue sin estar claro. En el presente estudio, los niveles séricos de 1 quininógeno-en pacientes con ACA o CRC resultaron ser significativamente mayor en comparación con los controles sanos. Es ampliamente aceptado que la ACA es una lesión precancerosa de CRC [29]. Por lo tanto, un aumento significativo en el suero quininógeno-1 los niveles en estos pacientes puede representar un marcador para la detección temprana de CRC, y esto es consistente con los resultados de Qiu
et al.
[30]. Aunque, en un estudio de quininógeno-1 de expresión detectado en 118 muestras de plasma obtenidas de pacientes con cáncer gastrointestinal, niveles significativamente más bajos de quininógeno-1 se detectaron [31]. Si bien esto es en contraste con los resultados del presente estudio, esta diferencia puede deberse a las diferencias en tamaño de la muestra, los recursos de la muestra, y el método de detección utilizado.
se han encontrado Las mediciones de los niveles de CEA a ser inadecuado para proyecciones de población debido a la falta de sensibilidad de este ensayo en las primeras etapas de CRC [32], [33]. Un panel de la Sociedad Americana de Oncología Clínica también ha recomendado contra las pruebas de CEA para el cribado de CCR [34]. En consecuencia, los ensayos CEA realizadas en el presente estudio no mostraron ningún valor diagnóstico de la ACA (AUC = 0,453), y también mostraron una menor sensibilidad (38,96%
vs.
70,13%) y la precisión (63.58%
vs. 67,90%) para la fase a de Duke y B CRC, en comparación con quininógeno-1. Estos resultados indican que los niveles séricos de monitoreo quininógeno-1 es más valioso que la detección de CEA en las primeras etapas de CRC. Por otra parte, cuando se controlaron tanto los niveles séricos de quininógeno-1 y los niveles de CEA en pacientes con CRC, la especificidad y el valor predictivo positivo de estos resultados mejorados. Por lo tanto, se recomienda la detección de quininógeno-1 en combinación con otros marcadores tumorales. Además, si se encuentra un paciente a ser positivo para quininógeno-1 y CEA, pero negativo para la proteína fetal alfa, entonces es posible que él /ella sufre de CRC en lugar de cáncer de hígado. Aún se necesitan más estudios para confirmar esta hipótesis.
En pacientes con CRC postoperatorias, los niveles séricos de quininógeno-1 fueron inferiores a las de los pacientes con CCR preoperatorios. Aunque no está claro por qué este se observó, se planteó la hipótesis de que el aumento de producción de quininógeno 1-se deriva de los tejidos tumorales. Esto es apoyado por los resultados obtenidos de inmunohistoquímica que mostraron quininógeno-1 acumulados en el citoplasma de las células tumorales de colon. Sin embargo, los detalles mecanísticos de este proceso no están claros. Además, la acumulación citoplasmática de quininógeno-1 se correlacionó significativamente con el estado de la metástasis de los ganglios linfáticos en pacientes con CCR. Sin embargo, un análisis de supervivencia de pacientes con CRC acuerdo con quininógeno 1-expresión no encontró ninguna diferencia significativa entre el grupo expresión negativa y positiva quininógeno-1, lo que indica el valor pronóstico de quininógeno-1 es limitada.
A nuestro entender, este es el primer estudio que reporta la detección de quininógeno-1 en pacientes ACA y la CRC, con la validación por ELISA e inmunohistoquímica. Basándose en estos resultados, quininógeno-1 parece ser un marcador potencial CRC, que puede ser valiosa para la detección precoz del CRC, en particular en combinación con otros biomarcadores en proyecciones de población para CRC. Un análisis de los pacientes adicionales, incluyendo el procesamiento estandarizada de las muestras obtenidas, se necesita para verificar y ampliar los resultados actuales. Por otra parte, se justifican estudios sobre el mecanismo de quininógeno-1 en los tumores colorrectales.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Las principales características clínico-patológicas de los pacientes incluidos en las cohortes de descubrimiento y validación
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070519.s001 gratis (DOC) sobre Table S2. .
Correlación entre quininógeno-1 de expresión y las características clínico-patológicas de los pacientes ACA
doi: 10.1371 /journal.pone.0070519.s002 gratis (DOC) sobre Table S3. .
Correlación entre quininógeno-1 de expresión y las características clínico-patológicas de los pacientes con CCR
doi: 10.1371 /journal.pone.0070519.s003 gratis (DOC)
Materiales S1.
ClinProt pico estadístico entre el control y los pacientes sanos ACA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070519.s004 gratis (XLS)
Materiales S2.
ClinProt pico estadístico entre los controles sanos y pacientes con CRC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070519.s005 gratis (XLS)
Reconocimientos
Los autores agradecen a los profesores . Yali Zhang y Wang Yadong, por sus sugerencias con respecto a la patología.