Extracto
Thiacremonone (2, 4-dihidroxi-2, 5-dimetil-tiofeno-3-ona) es una sustancia antioxidante como un nuevo compuesto de azufre generado a partir-de alta presión con tratamiento de alta temperatura Ajo. Peroxiredoxin 6 (PRDX6) es un miembro de peroxidasas, y tiene actividades de fosfolipasa A2 independiente de calcio (iPLA2) y glutatión peroxidasa. Varios estudios han demostrado que PRDX6 estimula el crecimiento celular del cáncer de pulmón a través de un aumento de la actividad de la glutatión peroxidasa. Un estudio de un modelo de acoplamiento y tire hacia abajo del ensayo mostraron que thiacremonone encaja completamente en el sitio activo (cys-47) de la glutatión peroxidasa de PRDX6 e interactúa con PRDX6. Por lo tanto, se investigó si thiacremonone inhibe el crecimiento celular mediante el bloqueo de la peroxidasa de glutatión de PRDX6 en las células cancerosas de pulmón humano, A549 y NCI-H460. Thiacremonone (0-50 g /ml) inhibió el crecimiento de células de cáncer de pulmón en una manera dependiente de la concentración a través de la inducción de la muerte celular apoptótica acompañada de inducción de la caspasa-3 escindido, -8, -9, Bax, p21 y p53, pero disminución de xIAP , la CIAP y expresión Bcl2. Thiacremonone actividad de la glutatión peroxidasa más inhibida en células de cáncer de pulmón. Sin embargo, el efecto inhibidor del crecimiento de células de thiacremonone no se observó en las células de cáncer de pulmón transfectadas con PRDX6 mutante (C47S) y en presencia de ditiotreitol y glutatión. En un aloinjerto en el modelo vivo, thiacremonone (30 mg /kg) inhibió el crecimiento del tumor también acompañada de la reducción de la expresión PRDX6 y la actividad de la glutatión peroxidasa, pero el aumento de expresión de la caspasa-3 troceados, -8, -9, Bax, p21 y p53 . Estos datos indican que thiacremonone inhibe el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la actividad de la glutatión peroxidasa de PRDX6 través de la interacción. Estos datos sugieren que thiacremonone pueden tener efectos potencialmente beneficiosos en el cáncer de pulmón
Visto:. Jo M, Yun H-H, K-R Parque, Parque MH, Lee DH, Cho SH, et al. (2014) Lucha contra el Cáncer Efecto de Thiacremonone través de regulación a la baja de peroxiredoxina 6. PLoS ONE 9 (3): e91508. doi: 10.1371 /journal.pone.0091508
Editor: Peiwen Fei, Universidad de Hawai Centro de Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de diciembre de 2013; Aceptado: 13 Febrero 2014; Publicado: 11 de marzo 2014
Copyright: © 2014 Jo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Gobierno de Corea (MSIP) (núm MRC, 2008 hasta 0.062.275). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
peroxirredoxinas (PRDXs) son una familia de enzimas antioxidantes como las peroxidasas [1] - [2]. La familia PRDX incluye seis miembros. Se dividen en dos clases [3]. El grupo 2-Cys incluye PRDX1-5, mientras que PRDX6 es solamente un miembro del grupo 1-Cys. PRDXs son una familia de peroxidasas que destruyen peróxidos utilizando residuos de cisteína conservados en el centro catalítico [4]. Entre los seis miembros de esta familia de mamíferos, PRDX6 es el único miembro que tiene actividades independientes del calcio fosfolipasa A2 (iPLA2) y glutatión peroxidasa [5]. Mientras que otros utilizan PRDXs tiorredoxina como reductor fisiológico, PRDX6 utiliza glutatión [6]. PRDX6 protege las células de la membrana, el ADN, daños de proteínas, y la peroxidación de lípidos [7]. El elemento de respuesta antioxidante (ARE) en la región promotora prdx6, a
cis
-actuando elemento regulador, se activa por el estrés oxidativo [8]. La transcripción del gen PRDX6 está regulada por el factor nuclear factores relacionados-2 eritroide 1, 2, y 3 (NRF1, Nrf2, y Nrf3) como factores de transcripción mediante la unión a la ARE [9]. Entre los ENFR, Nrf2 regula positivamente la transcripción del gen PRDX6 [10].
Como PRDXs son antioxidantes, contribuyen a la supervivencia y el mantenimiento tumor mediante la protección de las células del estrés oxidativo inducido por la apoptosis [11]. En un estudio reciente, más de expresión de PRDX 6 atenúa la apoptosis inducida por cisplatino en células de cáncer de ovario humano [12]. En contraste, la reducción de la expresión PRDX6 aumento de la muerte celular inducida por peróxido en las células de cáncer de hígado [13]. La invasión y la metástasis promover acciones de PRDX6 se ha encontrado en células de cáncer de pulmón a través de la activación de Akt través de la activación de phosphoinositiede 3-quinasa (PI3K) y p38 quinasa [4], [14]. La actividad de PRDX6 contribuye a la capacidad metastásica de las células de cáncer de pulmón mediante la estimulación de los componentes de invasión incluyendo PI3K, Akt, y UPA [4]. También se informó de que la expresión PRDX6 en células de cáncer de pulmón se asoció significativamente con la progresión del tumor [15].
El ajo se ha utilizado en la medicina tradicional como un componente de alimentos para prevenir el desarrollo del cáncer [16]. Thiacremonone (2,4-dihidroxi-2,5-dimetil-tiofeno-3-ona) es una sustancia antioxidante, como un compuesto de azufre novela, generados a partir de alta temperatura-de alta presión (ATAP) ajo tratado con [17]. En el presente estudio, se investigó el efecto anticancerígeno de thiacremonone a través de la inhibición de la actividad de la glutatión peroxidasa a través de la interacción en células de cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Extracción y caracterización de thiacremonone
La estructura de un compuesto de azufre aislado de ajo (thiacremonone llamado) se muestra en los resultados (Fig. 1A). El ajo (Allium sativum L) se calentó a temperaturas de 130 ° C durante 2 horas. Las muestras calentadas se juiced y después se filtró en un embudo Buchner bajo vacío. jugo de ajo caliente se reparte de forma consecutiva en un embudo de decantación usando acetato de etilo. El aislamiento de los compuestos de la capa de acetato de etilo de zumo de ajo calentada se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice. Esta fracción que contiene thiacremonone se purificó por RP-HPLC preparativa en una SP930D Instrumento Younglin [17]. Thiacremonone se resolvió en 0,01% de sulfóxido de dimetilo, y se trató a concentraciones de 10, 20, y 50 mg /ml en células de cultivo.
(A) Estructura del thiacremonone, un sulfurcompound aislado de ajo. (B) La proteína recombinante de PRDX6 se incubó con thiacremonone conjugado con Sepharose 4B. (C) Lisados de células enteras de NCI-H460 se incubaron con thiacremonone conjugado con Sepharose 4B. Después de la precipitación, los niveles de PRDX6 límite se monitorizaron mediante análisis de transferencia Western. (D) Después de la precipitación con thiacremonone conjugado con Sepharose 4B, los niveles de PRDX6 unido o C47S PRDX6 mutantes fueron monitorizados mediante análisis de transferencia Western. (E) la representación de la cinta modelo de acoplamiento de thiacremonone con PRDX6 (F) Superficie molecular representación del modelo de acoplamiento de thiacremonone con PRDX6.
Cell Cultura y
El A549 y NCI-H460 células de cáncer de pulmón líneas fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). La línea celular normal CCD-18Co de colon y la línea celular normal LL24 pulmonar fueron adquiridos de la orilla línea celular de Corea (Seúl, Corea). células normales NCI-H460 y LL24 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y penicilina /estreptomicina (100 U /ml). células normales y A549 CCD-18Co se cultivaron en un medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y penicilina /estreptomicina (100 U /ml). Los cultivos celulares se mantuvieron a continuación a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
Ensayo de viabilidad celular
Para determinar el número de células A549, y NCI-H460 células de cáncer de pulmón o CCD- 18Co de colon línea celular normal y la línea celular normal LL24 pulmonar se sembraron en placas de 24 pocillos (5 x 10
4 células /pocillo). células subconfluentes se trataron posteriormente con thiacremonone (10, 20, y 50 mg /ml) durante 72 hr. Después del tratamiento, las células se tripsinizaron y se sedimentaron por centrifugación durante 5 min a 1500 rpm, se resuspendieron en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), y azul de tripano se añadieron 0,1 ml de 0,2% a la suspensión de células de cáncer en cada una de las soluciones (0,9 ml cada uno). Posteriormente, una gota de suspensión se colocó en una cámara de Neubauer y se contaron las células cancerosas vivas. Las células que mostraban signos de tinción fueron considerados como muerto, mientras que los que excluye azul de tripano se consideraron viable. Cada ensayo se realizó por triplicado.
La transfección
pulmón células cancerosas (5 × 10
4 células por pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos y transitoriamente transfectadas con siRNA PRDX6 ( Santa Cruz Biotechnology) o pcDNA-PRDX6, (donaciones generosas de DR. Jhang Ho Pak, Universidad de Ulsan Colegio de Medicina usando una mezcla de Prdx6 siRNA o pcDNA-Prdx6 y la WelFect-EX PLUS reactivo en OPTI-MEN, de acuerdo con la las especificaciones del fabricante (WelGENE, Seoul, Corea).
Ensayo de la actividad de luciferasa
A549 y las células de cáncer de pulmón humano NCI-H460 se transfectaron con prdx6 promotor-Luc plásmido utilizando una mezcla de plásmido y el WelFect reactivo EX PLUS en OPTI-MEN, de acuerdo con las especificaciones del fabricante (WelGENE, Seúl, Corea). Después de 6 horas, las células fueron tratadas con thiacremonone. se midió la actividad de luciferasa usando el kit de ensayo de luciferasa (Promega, Wisconsin, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (WinGlow, Bad Wildbad, Alemania)