maligno humano
Extracto
Antecedentes
el cáncer de piel es el cáncer más común en todo el mundo. La transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la adquisición de las células madre del cáncer (CSC) -al igual que emergen propiedades pasos críticos en la metástasis de cánceres de piel humana. El ácido cafeico (CAA) ejerce efectos anticancerígenos. Sin embargo, los efectos de la CAA y la capacidad migratoria de las células madre cancerosas propiedades similares a las células de cáncer de piel, y los mecanismos moleculares subyacentes no se comprenden totalmente.
Métodos
células malignas fueron HaCaT tratada por CAA. ensayo Transwell se realizó para determinar que CAA atenúa la capacidad migratoria; ensayo de la formación de esferoides se realizó para confirmar que CAA disminuyó el fenotipo CSC-similares; Las células HaCaT malignas tratadas se caracterizaron molecularmente por RT-PCR, transferencias Western, transferencia del sudoeste, e inmunoprecipitación.
Resultados
En queratinocitos humanos malignos CAA-tratadas (células HaCaT malignos), la inhibición de la se observaron capacidad migratoria y el fenotipo de células madre cancerosas similar. CaA regulado hasta la fosforilación de p38, y el regulado de la activación del factor nuclear kappa B (NF-kB) /vía de señalización de caracol. De hecho, p38 disminuyó la actividad de unión al ADN de NF-kB al promotor de
caracol
gen, lo que dio como resultado la inactivación transcripcional de
caracol
. El bloqueo de p38 atenúa la inhibición CAA-inducida de la capacidad migratoria y el fenotipo de células madre cancerosas similar en las células HaCaT malignos.
Conclusiones
CaA atenúa la capacidad migratoria y las CSC propiedades similares a las de queratinocitos humanos malignos, en el que, p38 mediada baja regulación de la vía de señalización /caracol NF-kB está implicado
Visto:. Y Yang, Li Y, K Wang, Wang Y, W Yin, Li L (2013) p38 /NF-kB /Caracol está implicada la vía de la inhibición inducida por el ácido cafeico de células madre similares a las del cáncer de Propiedades y capacidad de migración de queratinocitos humanos en maligno. PLoS ONE 8 (3): e58915. doi: 10.1371 /journal.pone.0058915
Editor: Vladislav V. Glinskii, Universidad de Missouri-Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: 4 de octubre de 2012; Aceptó 8 de febrero de 2013; Publicado: 13 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los Fundamentos de las Ciencias Naturales de china (81072338) y un proyecto financiado por el Programa de Desarrollo Académico prioridad de instituciones de educación superior de Jiangsu (2010). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de piel es el cáncer más común en todo el mundo [1], [2]. Para las últimas dos décadas, la tasa de mortalidad de cáncer de piel es estable, en parte debido a la enfermedad metastásica [3]. Las opciones de tratamiento para el cáncer de piel metastásico siguen evolucionando en varias fronteras. Dacarbazina, actualmente la única Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA) aprobó la quimioterapia para el tratamiento de la enfermedad metastásica, hasta la fecha ha dado como resultado poco o ningún impacto sobre la supervivencia, incluso cuando se evaluó en combinación con terapias con diversos mecanismos de acción [4]. agentes quimioterapéuticos novedosos para el tratamiento de pacientes con cáncer se necesitan con urgencia maligno de la piel diseminada.
origen natural se informó derivados de ácido hidroxicinámico de tener cáncer, anti-inflamatorio, y propiedades antioxidantes [5], [6]. Su origen natural y presencia en todas partes han llevado a un fuerte interés en el uso de los mismos como agentes anticancerígenos. El ácido cafeico (3, ácido 4-dihidroxicinámico, CAA) es el principal ácido hidroxicinámico dietética. Estudios recientes sugieren que CaA ejerce efectos contra el cáncer [7]; CaA ejerce efectos de protección contra daños de la piel inducido por UVB mediante la supresión de la activación de la interleucina-10 y proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) en piel de ratón [8]; Además, CaA inhibe la actividad de quinasa Fyn (un mediador clave requerida para el cáncer de piel inducido por UVB), que puede estar implicado en la supresión de la carcinogénesis de la piel [9]. Sin embargo, los efectos de las AC en la capacidad metastásica de cáncer de piel, y los mecanismos moleculares que subyacen en, no se entienden completamente.
La transición epitelio-mesenquimal (EMT) es un proceso de desarrollo mediante el cual se convierten en células epiteliales a las células mesenquimales durante la embriogénesis, la remodelación de tejidos, y la curación de heridas [10]. Durante dicho proceso, las células epiteliales adquieren propiedades de células mesenquimales, y muestran la adhesión intercelular reducida y el aumento de la invasión [11]. La activación del programa EMT ha sido implicado como un paso importante en la metástasis de muchos tumores humanos, incluyendo la piel [10], [12].
Un concepto propuesto recientemente para explicar las características de los tejidos neoplásicos es la existencia de auto-renovación de células madre, y especies afines en los tumores, que han sido llamados "células madre del cáncer (CSC) '[13]. CSC se han identificado en muchos cánceres humanos, incluyendo la piel, mama, hígado, pulmón, etc. [1], [12], [14], [15]. Dentro de un tumor, células madre cancerosas, que constituyen una pequeña porción de las células neoplásicas, se definen por su capacidad de producir nuevos tumores. Por esta razón, también se han denominado "células iniciadoras del tumor '[13]. Una relación entre la EMT y células madre cancerosas se ha observado, que durante el proceso de EMT, las células epiteliales adquieren vástago rasgos similares a células y que las CSC exhiben una apariencia mesenquimales-como [16]. Este vínculo entre el proceso de EMT y la inducción de células madre cancerosas puede explicar por qué el programa EMT induce la iniciación y progresión del tumor.
A continuación, se concluyó que CAA atenúa las propiedades de capacidad migratoria y las CSC-como en queratinocitos humanos malignos (maligno células HaCaT). CaA mejoró la fosforilación de p38, que bloquea la activación del factor nuclear kappa B (NF-kB) /señal vía caracol. La inhibición de p38 abolió la inhibición CAA-inducida de la capacidad migratoria y el fenotipo de células madre cancerosas similar en las células HaCaT malignos.
Resultados
CaA atenúa la capacidad migratoria de las células malignas HaCaT
para determinar los efectos de CaA en el potencial migratorio de las células HaCaT malignas, se realizó transwell ensayo. Como se muestra en la Figura 1, las células HaCaT malignos muestran capacidad migratoria alta; por el contrario, CaA atenuó la capacidad migratoria de las células HaCaT malignas de una manera lo hace dependiente. Desde 100,0 M de CaA disminución de la capacidad migratoria de las células malignas HaCaT con eficacia, y ya que no tenía ninguna citotoxicidad detectable (Figura S1), se optó por esta concentración para una mayor investigación.
células HaCaT malignos fueron tratados con 0.0, 50.0 , o 100,0 M de CaA durante 48 h, respectivamente. (A) analiza ensayo Transwell de la capacidad migratoria de las células HaCaT malignos, bar = 125 micras; (B) Cuantificación de transwell ensayo de migración celular. Las células migradas se tiñeron con cristal violeta. Los resultados se expresaron como el número de células migradas por campo de visión (media ± SD, n = 5). **
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con 0.0 M de grupo de células HaCaT maligna CAA-tratada.
CaA induce mesenquimal-epitelial (MET) en las células HaCaT malignas
En las células malignas HaCaT, alteración de epitelio mesenquimal a la morfología de tipo huso es una manifestación [17]. Desde EMT permite a las células para moverse e invadir [18], que luego determinamos los efectos de las AC en el proceso de EMT en células HaCaT malignos. Como se muestra en la Figura 2A, las células HaCaT malignos muestran una apariencia similar a fibroblastos mesenquimales; sin embargo, después de que estas células se expusieron a CaA durante 48 h, mostraron una morfología de tipo epitelial. La inhibición de la capacidad adhesiva celular está asociado con la iniciación EMT [18]. Aquí, los ensayos de adhesión mostraron que CaA mejoró la capacidad adhesiva de las células HaCaT malignos (Figura 2B). A continuación, los efectos de CaA en la expresión de EMT /adhesivo marcadores: E-cadherina, N-cadherina, y vimentina, se determinaron. Después de células HaCaT malignas fueron tratados por CAA durante 48 h, el nivel de E-cadherina se aumentó, en contraste, N-cadherina y vimentina niveles se redujeron (Figura 2C). Por lo tanto, los cambios tanto morfológicos y moleculares demuestran que, con la exposición a CaA, las células HaCaT malignas se someten a un MET.
células HaCaT malignos fueron tratados con 0,0 o 100,0 M de CaA durante 48 h, respectivamente. (A) imágenes morfológicas de las células malignas HaCaT (bares: línea continua = 500 micras y la línea punteada = 125 m); (B) Cuantificación de ensayo de adhesión como se describe en la sección
Materiales y Métodos
. Se utilizaron los coeficientes de adherencia de las células HaCaT no tratados malignas para determinar el nivel de 100%; análisis (C) Western blot de E-cadherina, N-cadherina, y los niveles de vimentina. Las transferencias se normalizan mediante el uso de GAPDH para corregir las diferencias en la carga de las proteínas. **
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con 0.0 M de grupo de células HaCaT maligna CAA-tratada.
CaA disminuye las propiedades de células madre cancerosas, de células malignas HaCaT
La inducción de la EMT se ha asociado con la adquisición de tallo características similares a células, incluyendo la expresión de tales marcadores de las células madre de la superficie, el crecimiento no adherentes, y los cambios en la expresión de glicoproteínas de la superficie celular [16]. CD34 y K5 son marcadores de la superficie celular de las células madre de la piel [19], [20]. En nuestro estudio, las células HaCaT malignos mostraron una expresión elevada de
CD34 Opiniones y
K5
ARNm; sin embargo, después del tratamiento de las células HaCaT malignos con CaA durante 48 h, una disminución en la expresión de tales mRNAs se observó (Figura 3A). La formación de esferoides demuestra la capacidad de las células para la auto-renovación y para la iniciación de tumores, que son características de las células madre del cáncer (CSC) [21]. De ahí se determinó los efectos de CaA en la formación de esferoides en las células HaCaT malignas. En los platos no adherentes, las células malignas HaCaT forman esferas que flotan libremente y viables; Sin embargo, después del tratamiento de las células HaCaT malignos mediante el ACC durante 48 h, tal fenómeno fue desaparecido (Figura 3B y 3C). Estos datos demuestran que CAA disminuye las propiedades de células madre cancerosas, de células malignas HaCaT.
P>
K5 Opiniones y
CD34
niveles de mRNA. Las bandas se normalizaron por el uso de GAPDH para corregir las diferencias en la carga de los ADNc; (B) que flotan libremente, esferas viables formados por células malignas HaCaT (barra = 125 m); (C) de la esfera de cuantificación (media ± SD, n = 3). **
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con 0.0 M de grupo de células HaCaT maligna CAA-tratada.
CaA inhibe la activación de la vía /señal de caracol de NF-kB por p38
caracol, un factor de transcripción con dedos de zinc , funciona como un regulador para suprimir la expresión de moléculas de adhesión y para ayudar al escape de las células tumorales de la muerte celular durante EMT [22]. NF-kB, un mediador clave implicado en la transformación maligna de las células HaCaT [17] regula up-, caracol expresión e induce la EMT [23], [24]. La hipótesis de que la vía de señalización /caracol NF-kB podría estar implicado en la inhibición inducida por la AAC del propiedades de los CAC-como y capacidad migratoria de las células HaCaT malignos. Aquí, como se muestra en la Figura 4A, CaA disminuyó la expresión de fosfo-de RelA (que indica la activación de NF-kB) y el caracol, que sugirió que CaA bloqueó la activación de la vía /señal de caracol NF-kB.
células HaCaT maligno (a) fueron tratados con 0,0 o 100,0 M de CaA durante 24 h, respectivamente. Western blot análisis de caracol, p-p38, y los niveles de p-RelA. Las transferencias se normalizan mediante el uso de GAPDH para corregir las diferencias en la carga de las proteínas; (B) Después de las células malignas HaCaT fueron pretratados por 10,0 M de SB203580 (un inhibidor de p38) durante 6 h, se expusieron a 0,0 o 100,0 M de CaA durante 24 h, respectivamente. (B, parte superior), las células lisados se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpo NF-kappa B /de RelA, y los inmunoprecipitados se sometieron a transferencias de Southwestern para determinar la unión de NF-kappa B a secuencias de ADN de
caracol
promotor (5 ' -
taa CD -
GGG-AGT-TGG-CGG
-3 '); (B, abajo) los inmunoprecipitados se sometieron a transferencia de Western para determinar el nivel de RelA, que se usó para corregir las diferencias en la carga de los inmunoprecipitados; células HaCaT malignas (C) se trataron como se describe en (B), RT-PCR (arriba) y transferencia Western (parte inferior) análisis de caracol ARNm y los niveles de proteína. Blots /bandas se normalizaron mediante el uso de GAPDH para corregir las diferencias en la carga de las proteínas /ADNc.
A fin de determinar el regulador aguas arriba de NF-kB /caracol en CaA tratados células malignas HaCaT , se determinó la activación de p38 (un inhibidor de NF-kB y EMT [25]). Como se muestra en la Figura 4A, CaA mejoró la fosforilación de p38 (que indica la activación de p38). Sobre la base de estos datos, la hipótesis de que en las células HaCaT malignos, CAA bloqueó la vía de señalización /caracol NF-kB por p38.
A continuación, utilizamos inmunoprecipitación y ensayo de transferencia del sudoeste para confirmar nuestra hipótesis. SB203580 es un inhibidor específico de p38, y que usamos 10,0 M de SB203580 para bloquear la activación inducida por la CAA-p38 (Figura S2). Después de células HaCaT malignos fueron pretratados con 10,0 M de SB203580 por 6 h, que se expusieron a 0,0 o 100,0 M de CaA durante 24 h, respectivamente. De RelA se inmunoprecipitó con su anticuerpo específico, y los inmunoprecipitados se sometieron entonces a transferencias de Southwestern usando la sonda marcada con biotina "
gggagttggc
" (Figura S3) para determinar la unión de NF-kappa B a secuencias de ADN de
caracol
promotor. Como se muestra en la Figura 4B, CaA disminuyó la unión de NF-kappa B en
caracol
promotor en las células HaCaT malignas; sin embargo, la inhibición de p38 abolió este efecto. Además, el bloqueo de p38 atenúa la expresión CAA-mediada por la disminución de caracol mRNA y los niveles de proteína (Figura 4C). Estos resultados sugieren que, en las células HaCaT malignas expuestas a CAA, la p38 disminuyen la actividad de unión al ADN de NF-kB a
caracol
promotor, lo que se traduce en el transcripcional baja regulación de caracol.
p38 está implicada en la MET inducida por CaA de células HaCaT malignas
determina entonces las funciones de p38 en MET CaA mediada en células HaCaT malignas. Después de células HaCaT malignos fueron pretratados con 10,0 M de SB203580 por 6 h, que se expusieron a 0,0 o 100,0 M de CaA durante 48 h, respectivamente. Como se muestra en la Figura 5. En las células HaCaT malignas CAA-tratados, el nivel de E-cadherina se incrementó, pero se redujeron los niveles de N-cadherina y vimentina (Figura 5A); capacidad adhesiva celular se mejoró (Figura 5B); y las células adquieren una morfología de tipo epitelial (Figura 5C). Sin embargo, la inhibición de p38 abolió el fenómeno anterior inducida por CAA (Figura 5A, 5B y 5C). Estos resultados sugieren que p38 está implicado en MET CAA-inducida de células HaCaT malignas
.
Después de células HaCaT se trataron previamente malignas por SB203580 (un inhibidor de la p38) durante 6 h, que se expusieron a 0,0 o 100,0 M de CaA durante 48 h, respectivamente. (A) análisis de transferencia de Western de E-cadherina, N-cadherina, y los niveles de vimentina. Las transferencias se normalizan mediante el uso de GAPDH para corregir las diferencias en la carga de las proteínas; (B) Cuantificación de ensayo de adhesión como se describe en la sección
Materiales y Métodos
. Se utilizaron los coeficientes de adherencia de las células HaCaT no tratados malignas para determinar el nivel de 100%; (C) las imágenes morfológicas de las células malignas HaCaT (bares: línea continua = 500 micras y la línea punteada = 125 micras). **
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con (CAA + SB203580) tratados con maligna grupo de células HaCaT.
P38 está implicado en la inhibición CAA-inducida de células madre cancerosas propiedades similares a las células HaCaT en malignas
Además, nos determina los efectos de la inhibición de p38 en Caa-inducida de células madre cancerosas propiedades similares a las células HaCaT en malignas. Las células se trataron como se describe anteriormente. Como se muestra en la Figura 6, CaA atenúa la expresión de
CD34
y
K5
mRNAs (Figura 6A), y la disminución de la formación de esferoides (figura 6B y 6C). Sin embargo, la inhibición de p38 abolió el fenómeno anterior inducida por CAA (Figura 6A, 6B y 6C). Estos resultados indican que p38 está implicado en la inhibición inducida por CaA de propiedades CSC-como en células HaCaT malignas.
Después de células HaCaT se trataron previamente malignas por SB203580 para 6 h, que se expusieron a 0,0 o 100,0 M de CaA durante 48 h, respectivamente. (A) RT-PCR análisis de
K5 Opiniones y
CD34
niveles de mRNA. Las bandas se normalizaron por el uso de GAPDH para corregir las diferencias en la carga de los ADNc; (B) que flotan libremente, esferas viables formados por células malignas HaCaT (barra = 125 m); (C) de la esfera de cuantificación (media ± SD, n = 3). **
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con (CAA + SB203580) tratados con maligna grupo de células HaCaT.
CaA atenúa la capacidad migratoria de las células malignas HaCaT por p38
Finalmente, determinamos si CaA disminuyó el migratoria capacidad de las células HaCaT malignas a través de p38. células HaCaT malignos fueron expuestos a CaA (0,0 o 100,0 mM) en presencia o ausencia de SB203580 como se describe en la Figura 6, y el potencial migratorio de las células HaCaT malignas se determinó por transwell ensayo. Como se muestra en la Figura 7, CaA atenuó la capacidad migratoria de las células HaCaT malignas; sin embargo, la inhibición de p38 abolió este fenómeno. Estos datos sugieren que p38 está implicado en la inhibición inducida por CaA de capacidad migratoria en las células HaCaT malignas
.
Después de células HaCaT se trataron previamente malignas por SB203580 para 6 h, que se expusieron a 0,0 o 100,0 M de CaA para 48 h, respectivamente. (A) analiza ensayo Transwell de la capacidad migratoria de las células HaCaT malignos, bar = 125 micras; (B) Cuantificación de transwell ensayo de migración celular. Las células migradas se tiñeron con cristal violeta. Los resultados se expresaron como el número de células migradas por campo de visión (media ± SD, n = 5). **
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con (CAA + SB203580) tratados con maligna grupo células HaCaT.
Discusión
CaA es uno de los principales metabolitos producidos por la hidrólisis de ácido clorogénico, un importante fitoquímico fenólico en diversos alimentos, incluyendo el café [8]. Debido a que una gran cantidad de ácido clorogénico se absorbe en forma metabolizada, considerable atención se ha centrado en los efectos biológicos de los metabolitos tales como CaA con el fin de evaluar posibles
in vivo
efectos de las dietas que contienen ácido clorogénico [9 ]. La evidencia acumulada sugiere que CAA tiene el potencial para inhibir el desarrollo del cáncer de piel, por ejemplo, CAA inhibe el desarrollo de tumores de la piel inducida por 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato de piel de ratón [26]. Sin embargo, los efectos de CaA de la capacidad migratoria de las células malignas de la piel, y los mecanismos moleculares que subyacen en, siguen sin estar claros. Aquí encontramos que CAA atenúa la capacidad migratoria y propiedades de los CAC-como de queratinocitos humanos malignos, en el que, p38 mediada baja regulación de la vía /señal de caracol de NF-kB estuvo involucrado.
EMT se refiere a un programa durante el desarrollo embrionario normal con una pérdida de propiedades epiteliales, tales como la adhesión celular y la expresión del marcador epitelial, e-cadherina, y adquisición de propiedades mesenquimales, tales como aumento de la motilidad celular y la expresión del marcador mesenquimal, N-cadherina y vimentina [ ,,,0],10]. EMT es vista como un paso importante en la invasión tumoral y la metástasis [27]. Aquí, se encontró que, después de la exposición de las células HaCaT malignas a CaA durante 48 h, mostraron una morfología de tipo epitelial y la capacidad adhesiva mejorada. Además, no hubo incremento en la expresión de E-cadherina (un marcador epitelial), y la disminución de la expresión de N-cadherina y vimentina (marcadores mesenquimales). Estos resultados demuestran que, con la exposición a la CAA, los HaCaT células malignas se someten a una economía de mercado.
Adquisición de CSC propiedades similares a emerger como un paso crítico en la progresión del cáncer [28]. Muchos genes se expresan en células madre cancerosas de la piel, incluyendo
CD34
,
K5
, etc. [19], [20]. En la piel,
CD34
se expresa específicamente en las SC de queratinocitos, y
CD34
expresión es clave para la carcinogénesis de piel [19];
K5
es un marcador de la SC de la piel no diferenciadas o células madre cancerosas [20]. En nuestro estudio, las expresiones de
CD34
y
K5
mRNA se redujeron sustancialmente en las células HaCaT malignas CAA-tratada. SC y células madre cancerosas comparten una variedad de propiedades, incluyendo selfrenewal, aunque típicamente se dysregulated en la oncogénesis. Muchos SC o CSC líneas cultivadas forman grupos esféricos de flotación libre de células viables que contienen una preponderancia de las castas o células madre cancerosas [21], [29]. En el presente estudio, CAA-tratada células malignas HaCaT capacidad atenuada expuesto para formar esferas. Estos resultados indican que las células HaCaT características malignas perdidas las CSC-como por la exposición a la AAC.
caracol, un factor de transcripción con dedos de zinc, funciona como un regulador para suprimir la expresión de moléculas de adhesión y para ayudar al escape de las células tumorales de la muerte celular durante la EMT [22], [30]. Snail se expresa frecuentemente en muchos tipos de células tumorales en las que se reduce la expresión de E-cadherina. Por otra parte, esta relación inversa de caracol y E-cadherina se observa a menudo en los tipos de tumores invasivos [31]. Estudios posteriores confirmaron un efecto supresor de caracol en
E-cadherina
promotor a través de una unión de las tres cajas E específica
(cacctg) Hoteles en la región promotora en -178 a +92 del
E-cadherina
de genes [31]. Por otra parte, el caracol también se ha relacionado con la adquisición de características CSC-como [22]. Aquí, en las células HaCaT malignas CAA tratados, se observó una disminución en la expresión de caracol.
A fin de determinar el regulador aguas arriba del caracol en las células HaCaT malignos tratados CAA, se determinó la activación de NF-kB. NF-kB se cree que iniciar y acelerar la tumorigénesis, y su transformación celular bloques de inhibición inducida por promotores tumorales [16], [23]; NF-B induce cambios morfológicos, la migración celular, la activación de caracol y la represión de la producción de E-cadherina [24], [32]. NF-kB se une a
caracol
promotor y regula positivamente la transcripción caracol expresión [23]. Aquí, en las células HaCaT malignas CAA tratados, se observó una disminución de expresión de p-de RelA. Además, CAA reducido regulado la actividad de unión al ADN de NF-kB a
caracol
promotor, lo que resultó en la inhibición transcripcional de caracol. Estos resultados indican que CaA induce una inactivación de la vía /señal de caracol NF-kB.
Las vías de MAPK transducen señales que conducen a diversas respuestas celulares, tales como el crecimiento celular, la diferenciación, la proliferación, la apoptosis y las respuestas al estrés ambiental a estímulos [33]. La señal extracelular regulada quinasa 1/2 (ERK1 /2) y la vía típicamente transduce señales de factores de crecimiento que conducen a la diferenciación celular o la proliferación, mientras que las citoquinas y señales de estrés activan las quinasas c-Jun N-terminal (JNKs) y las vías de p38 MAPK, lo que resulta en las respuestas de estrés, la detención del crecimiento, o la apoptosis [34]. Además de ser un mediador central de la respuesta inflamatoria y el estrés, p38 juega un papel importante en los procesos no inflamatorias, tales como la regulación del ciclo celular y la diferenciación celular [35]. Una vez activado, p38 fosforila una amplia gama de sustratos en el citoplasma y en el núcleo, que regulan la expresión de genes por lo tanto, el ciclo celular y la polarización celular. Los estudios sobre las funciones de las familias de MAPK en la génesis de la EMT han producido resultados contradictorios, debido a la heterogeneidad de los modelos celulares y los diferentes enfoques experimentales utilizados [25], [36]. estudio anterior demuestra que la p38 promueve la expresión de E-cadherina mediante la supresión de TGF-β-quinasa activada 1 (TAK1) -NF-kB señalización [25]. Aquí, en las células HaCaT malignas CAA-tratada, p38 disminuye la actividad de unión al ADN de NF-kB a
caracol
promotor, lo que se traduce en el transcripcional baja regulación de caracol. La p38 /NF-kB /Caracol está implicado en la inhibición CAA-inducida de células madre cancerosas propiedades parecidas y capacidad migratoria en queratinocitos humanos malignos (Figura 8).
En las células HaCaT malignas expuestas a CAA, la p38 disminuye la ADN vinculante actividad de NF-kB a la
caracol
promotor, lo que se traduce en el transcripcional baja regulación de caracol. Tal proceso molecular hace que la inhibición de células madre cancerosas propiedades parecidas y capacidad migratoria de las células HaCaT malignos.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y reactivos
El maligno transforma células HaCaT fueron desarrollados anteriormente por nuestro laboratorio [17]. Las células se mantuvieron en 5% de CO
2 a 37 ° C en medio RPMI-1640 (Life Technologies /Gibco, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS, Life Technologies /Gibco), 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Life Technologies /Gibco, Gaithersburg, MD). El inhibidor de p38, SB203580 fue adquirido de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.). Todos los demás reactivos utilizados fueron de grado analítico o el grado más alto disponible.
Transwell ensayo
ensayo Transwell se realizó mediante el uso de un crecimiento reducido del factor de matrigel recubierto (8 micras de tamaño de poro, BD, Franklin Lakes, NJ) filtros en placas de 24 pocillos. Brevemente, las células se trataron con tripsina y se sembraron en la cámara superior de los cultivos polarizados (3 × 10
4 células /pocillo) en suplementos-1640 gratis. Las cámaras inferiores de los cultivos polarizados se llenaron con el medio de 1640 que contiene 100 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF, R & amp; D Systems). Las cámaras se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 para 24 h. Al final de la incubación, las células en la superficie superior del filtro se retiraron usando un hisopo de algodón. Las células que migran a través del filtro a la superficie inferior se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta durante 5 minutos. Las células migradas fueron vistos y fotografiados bajo un microscopio de contraste de fases (Olympus, Tokio, Japón), y se contaron en cinco campos elegidos al azar.
Ensayo de adhesión
Un total de 1 × 10
4 células tratadas se sembraron en una placa de 96 pocillos durante 24 h, seguido de lavado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces y se fijan con 70% de etanol durante 15 min a temperatura ambiente. Las células adherentes restantes fueron evaluadas por WST-8 hidrólisis utilizando Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Inc.). En resumen, después las células se lavaron en PBS, se incubaron con 20,0 l de solución de CCK-8 durante 4 h. La absorbancia a 450 nm se midió con un lector de placas de múltiples pocillos (Modelo 680, Bio-Rad, EE.UU.). Las proporciones de células no tratadas de control se utilizaron para determinar el nivel de 100%.
Western blots
Los lisados celulares se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno ( Millipore, Billerica, MA, EE.UU.); los complejos inmunes se detectaron mediante quimioluminiscencia (Cell Signaling Technology). Los anticuerpos utilizados fueron la E-cadherina, N-cadherina, vimentina, caracol, p38, p-p38 (Thr180 /Tyr182), Rela-p de RelA (Ser536, Señalización Celular Tecnología); Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, Sigma, St. Louis, MO). Las transferencias se normalizan mediante el uso de GAPDH para corregir las diferencias en la carga de las proteínas.
transcriptasa inversa reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
El ARN total (2 mg) se transcribió en ADNc usando la transcriptasa inversa AMV (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Los cebadores para la
CD34 gratis (adelante, 5'-TTGGGCATCACTGGCTATTT-3 '; inversa, 5'-GGAAGGGTTGGGCGTAAGA-3'),
K5 gratis (adelante, 5'-GAGCAGGGCACCAAGAC-3 '; inversa , 5'-CTCCGCATCAAAGAACATC-3 '), y
caracol (hacia adelante, 5'-TTCTCCCGAATGTCCCT -3'; revertir, 5'-TCAGCCTTTGTCCTGTAGC -3 ') fueron utilizados para la amplificación por PCR. La reacción de PCR se evaluó mediante la comprobación de los productos de PCR en 2% w /v de geles de agarosa. Las bandas se normalizaron mediante el uso de GAPDH para corregir las diferencias en la carga de los ADNc
formación de esferoides
En los platos no adherentes (Costar, EE.UU.), las células (1 × 10
4) eran suspendida en medio definido, libre de suero compuesto de DMEM /F-12 (Gibco), 10 ng /ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (bFGF, R & amp; D Systems, EE.UU.), y 10 ng /ml de EGF. Las células se cultivaron durante 10 días y se alimentaron cada 48 h. esferas totales se contaron bajo un microscopio (Olympus).
inmunoprecipitación
Las células se extraen durante 30 minutos con tampón de lisis. Después de la centrifugación de las preparaciones, los sobrenadantes se incubaron con anticuerpos RelA y, posteriormente, con granos + G Sepharose (Sigma) a 4 ° C durante la noche. Los pellets se lavaron tres veces, se resuspendieron en el tampón de muestra de dodecilsulfato de sodio, y se hierve para eliminar la proteína de las perlas. Los inmunoprecipitados se analizaron mediante transferencias del suroeste con una sonda marcada con biotina (5 '-
taa CD -
GGG-AGT-TGG-CGG
-3')., O mediante transferencias Western
ensayos Southwestern
análisis Southwestern se realizaron como se describe anteriormente [17]. Brevemente, los inmunoprecipitados se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore). Después de la transferencia, los filtros se hibridan durante 2 horas a 20 ° C con tampón de unión que contiene 40 ng de la sonda marcada con biotina (
caracol
promotor: 5 '-
taa CD -
GGG-AGT-TGG-CGG
-3 '). Las posiciones de los oligonucleótidos marcados en el extremo con biotina se detectaron mediante una reacción quimioluminiscente de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce, EE.UU.) y se visualizaron por autorradiografía.
El análisis estadístico
valores derivados se presentan como la medios ± SD. Dunnett de
t
de prueba y análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) se utilizaron para evaluar las diferencias significativas entre los diferentes grupos. La significación estadística se determinó por la prueba de Fisher.
P
valores & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativas
Apoyo a la Información
Figura S1..
Efectos de CaA sobre la viabilidad de las células HaCaT malignos. Después las células fueron expuestas a 0,0, 50,0, 100,0, 200,0 o M de CaA durante 24 y 48 h, respectivamente, sus viabilidades se midieron mediante el uso de un kit de ensayo de 8-recuento de células. Las proporciones relativas de la viabilidad celular se determinó comparando el crecimiento de las células expuestas a no CaA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0058915.s001
(TIF)
Figura S2.
Efectos de SB203580 en la viabilidad celular y en la fosforilación de p38. (A) Los efectos de SB203580 en la viabilidad de las células HaCaT malignas. Después las células fueron expuestas a 0,0, 5,0, 10,0, 20,0, o 40,0 M de SB203580 durante 24 h, sus viabilidades se midieron mediante el uso de un kit de ensayo de 8-recuento de células. Las proporciones relativas de la viabilidad celular se representaron con las células no tratadas para determinar el nivel de actividad 100%. (B) SB203580 bloqueó la fosforilación CAA-inducida de p38. (
gggynrrrcc
).
doi:10.1371/journal.pone.0058915.s003
(TIF)
Acknowledgments
The