Extracto
Antecedentes
El cáncer de pulmón causa aproximadamente 1,2 millones de muertes por año en todo el mundo, y no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa el 85% de todos los cánceres de pulmón. La comprensión de los eventos moleculares en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es esencial para mejorar el diagnóstico precoz y el tratamiento de esta enfermedad.
Metodología y Principales conclusiones
En un intento de identificar relacionada novela NSCLC genes, se realizó una proyección de todo el genoma del número de copias cromosómicas cambios que afectan a la expresión génica utilizando basados en la hibridación y la expresión génica arrays genómicos comparativos de microarrays en 32 muestras de tumores resecados radicalmente de fase I y II pacientes con CPNM. Se aplicó una herramienta de análisis de integración para determinar si el número de copias cromosómicas afecta a la expresión génica. Se identificaron una deleción en 14q32.2-33 como una alteración común en NSCLC (44%), que influyó significativamente en la expresión de genes de HSP90, con domicilio en 14q32. Esta supresión se correlacionó con una mejor supervivencia global (p = 0,008), la supervivencia también ya estaba en los pacientes cuyos tumores tenían bajos niveles de expresión de HSP90. Hemos ampliado el análisis de tres conjuntos de validación independientes de pacientes con CPNM, y se confirmó la baja expresión de HSP90 estar relacionado con la supervivencia global más larga (P = 0,003, P = 0,07 y P = 0,04). Además, el tratamiento in vitro con un inhibidor de la HSP90 tenía potente actividad antiproliferativa en líneas celulares de cáncer.
Conclusiones
Nos sugieren que la orientación HSP90 tendrá impacto clínico de los pacientes con CPNM.
cita: Gallegos Ruiz MI, Suelo K, P Roepman, JA Rodríguez, Meijer GA, Mooi WJ, et al. (2008) La integración del gen Dosificación y la expresión génica en células no pequeñas de cáncer de pulmón, Identificación de HSP90 como objetivo potencial. PLoS ONE 3 (3): e0001722. doi: 10.1371 /journal.pone.0001722
Editor Académico: Christoph Plass, Universidad del Estado de Ohio, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Diciembre, 2007; Aceptado: 4 febrero de 2008; Publicado: 5 Marzo 2008
Derechos de Autor © 2008 Gallegos Ruiz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Pablo Roepman es empleado por Agendia BV
Introducción
cáncer
pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1] y el cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) representa el 85% de los cánceres de pulmón. Una mejor comprensión de los eventos moleculares subyacentes al desarrollo y la progresión de la enfermedad puede contribuir a mejorar la gestión clínica de los pacientes de NSCLC. Un número de genes, por ejemplo, P53, RAS, p16 y EGFR, se ha demostrado que ser alterado en NSCLC [2]. Dado el carácter heterogéneo y complejo de este tipo de tumor, es probable que muchos genes que impulsan NSCLC tumorigénesis aún tienen que ser identificados.
Se cree que las aberraciones cromosómicas ser eventos críticos en la tumorigénesis humana, y varias regiones genómicas que albergan con frecuencia ganancias de ADN (3q, 5p, 7q, 8q, 11q y 16p) y las pérdidas (3p, 4q, 5q, 6q, 8p 9p y 13q, 17q) se han identificado en pacientes con NSCLC [3]. Uso de matriz basados en la hibridación genómica comparativa (aCGH) y de genes microarrays de expresión, cambios de número de copia de ADN y la expresión génica se puede medir a lo largo de todo el genoma de las células tumorales. Mediante la combinación de los datos de estos análisis, es posible obtener un genoma amplia visión integrada de las aberraciones de dosis génica y su efecto sobre la expresión de genes, lo que podría ayudar en la identificación de genes importantes en el CPNM [4].
En el presente estudio, hemos realizado un análisis integrador del número de copias cromosómicas y la expresión de genes en muestras de tumores resecados radicalmente a partir de 32 pacientes con CPNM. Dos nuevos algoritmos, 'CGH llamada' [5] y 'ACE-it' [6], se aplicó para analizar los datos. Se identificaron una deleción en la región del cromosoma 14q32.2-33 en el 44% de los pacientes con CPNM. Esta supresión se relaciona con una mejor supervivencia del paciente, y se asoció con una disminución de expresión de HSP90, una chaperona molecular para varias oncoproteínas que se está estudiando como una nueva diana en la terapia contra el cáncer. baja expresión de HSP90 se correlacionó con una mejor supervivencia en los 32 pacientes con CPNM inicialmente analizados. Un análisis más detallado de los tres conjuntos independientes de pacientes con CPNM confirmado una asociación significativa entre la supervivencia del paciente y la expresión de HSP90. Además,
in vitro
experimentos muestran líneas celulares de cáncer a ser extremadamente sensibles a la HSP90 inhibidor 17-AAG. Nuestros datos sugieren e importante papel de HSP90 en el CPNM.
Métodos
Pacientes y muestras
El equipo de prueba consistió en muestras de tumores resecados radicalmente de 32 pacientes con NSCLC etapa temprana. Tres pacientes tuvieron un tiempo de supervivencia de menos de 30 días y se consideraron muertes postoperatorias. Por lo tanto estos tres pacientes no están incluidos en los análisis de supervivencia. Los pacientes tenían una mediana de seguimiento de 86 meses (rango 0,4 a 135,5). el consentimiento informado verbal había sido obtenida de todos los pacientes y el manejo de las muestras estaba de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité de ética "subcommissie voor de ethiek van het mensgebonden onderzoek", del Centro Médico de la Universidad VU en Amsterdam.
El primer conjunto de validación consistió en 140 pacientes con CPNM resecado radicalmente del consorcio europeo cáncer de pulmón. Los pacientes tenían una mediana de seguimiento de 35 meses. Todos los pacientes incluidos habían tenido ninguna enfermedad maligna previa, el estadio patológico del tumor 1 o 2 (T1-2), etapa de nodos 0 + 1 (N0-1), sin metástasis a distancia (M0) en el momento de la operación, y sin enfermedad residual después de la resección ( R0). Ninguno de estos pacientes recibió (neo) quimioterapia adyuvante o radioterapia. La segunda validación consistió en 111 pacientes con CPNM etapa temprana de Bild y col. [7]. El tercer conjunto de validación consistió en los "conjuntos de datos 1 y 2" a disposición del público a partir de Lu et al. [8] y contenía 54 pacientes con NSCLC etapa temprana. Una descripción completa de las características del paciente de los cuatro conjuntos de pacientes se proporciona en la Tabla 1.
El aislamiento de ADN genómico y la gama de hibridación genómica comparada
Cryo-secciones de muestras de tejido congelado, flanqueando las secciones utilizadas para el ARN y el aislamiento de ADN, se verificaron por el patólogo estudio (WM) para contener al menos 50% de las células tumorales. ADN genómico fue extraído de cada muestra utilizando Trizol siguiendo las instrucciones del fabricante (Life Technologies, Breda, Países Bajos). marcaje de ADN y la hibridación de microarrays de ADN CGH 30K se realizó según lo descrito por van den IJssel et al protocolos estándar [9].
aislamiento de RNA y de expresión génica micro arrays
El aislamiento de ARN y etiquetado de cDNA siguieron . La hibridación se llevó a cabo en la plataforma Agilent acuerdo con los procedimientos estándar descritos por el fabricante y en otras partes [10].
Análisis de los datos
Para CGH array, análisis de puntos y control de calidad se realizaron con Bluefuse versión 3.2 ( BlueGenome, Cambridge, Reino Unido). Puntos de ruptura, ganancias, pérdidas y amplificaciones fueron detectados utilizando el llamado algoritmo de CGH. Este algoritmo convierte log2ratios primas a las medidas absolutas de la "pérdida", "Normal", "ganancia" o "amplificación" mediante la aplicación de un algoritmo de segmentación combinada con un modelo de mezcla de probabilidad [11]. Con el fin de probar estadísticamente si la expresión de genes se vio afectada por la dosis de genes se aplicó un CGH herramienta de integración expresión de matriz, ACE-it [6], en el que la llamada matriz CGH y relaciones de log10 normalizados para arrays de expresión se utilizaron como datos de entrada. ACE-usa los unilateral de Wilcoxon rango suma estadísticas para probar qué cromosómica número de copias aberraciones afectan recurrentemente la expresión del ARN. p-valores calculados son ajustados para múltiples pruebas utilizando el método de Benjamini Hochberg [12]. ACE-it sólo prueba genes que cumplen los criterios de la contaminación y el equilibrio, que son controlados a través de un umbral en el número de muestras. Aquí, el umbral se fija en un valor predeterminado fijo de 9 muestras, lo que significa que sólo las posiciones cromosómicas se han tenido en cuenta que han tenido al menos 9 muestras en un estado llamando CGH y no más de 9 en el otro estado. El array CGH todo conjunto de datos de la serie de ensayos (n = 32) se encuentra disponible en la base de datos GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo, número de acceso GSE7878). Los datos de expresión génica, tanto del equipo de prueba (n = 32) y la validación conjunto 1 (n = 140) de los 359 genes identificados por ACE-it está disponible en la base de datos de matriz Express (www.ebi.ac.uk/aerep/inicio de sesión, número de acceso de diseño de matriz: A-MEXP-749, los datos del experimento:. E-TABM-270)
Los datos de expresión genética de conjunto de validación 2 se obtuvo usando chips de Affymetrix Hu133plus2 (GEO número de acceso GSE3141). El valor medio de la intensidad de señal MAS5 calculados de cuatro probesets detección HSP90AA1 fue utilizado en nuestros cálculos.
El tercer conjunto de validación que contiene los datos de expresión de genes de Affymetrix Hu95 y patatas fritas Hu133 (número de acceso GEO GSE6253). El chip Hu95 contenía una probeset detectar HSP90AA1 y el chip Hu133 contenían cuatro probesets, de los cuales se utilizó el valor medio de las intensidades de señal de RMA calculada en nuestros cálculos.
Estadísticas
Una regresión de Cox univariante se realizó un análisis para investigar relación de los valores de expresión génica con el tiempo de supervivencia. Las curvas de supervivencia se construyeron utilizando el método de Kaplan-Meier y las diferencias en general fueron evaluados usando la prueba de log-rank. En el equipo de prueba, tres pacientes con menos de 30 días el tiempo de supervivencia fueron excluidos del análisis de supervivencia, ya que su muerte se consideró la mortalidad quirúrgica. Para determinar los efectos independientes de la expresión de HSP90, el subtipo histológico, el estadio del tumor, la edad y el género, se realizó un análisis de regresión de Cox. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Multiplex Ligadura dependiente sonda de amplificación (MLPA)
Para Multiplex Ligadura dependiente sonda de amplificación (MLPA), el P070 sonda conjunto subtelomere (MRC Holanda, Amsterdam, se utilizó Países Bajos), que contiene una sonda situada dentro de la banda 14q32.33 (región 104874216-105070384). MLPA se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando 100 ng de ADN como entrada. DNA aislado de la sangre de un grupo de donantes sanos se utilizó como muestra de referencia. señales de la sonda se normalizaron dividiendo el área del pico del cromosoma 14q por el área del pico de 14p cromosoma. MLPA genera 14q /14p relaciones se representan frente a los log2ratios media normalizada de los oligos en la zona 104787271-105071522 de la matriz (total de 11 oligos). Esta región abarca la región de la sonda MLPA.
RT-PCR cuantitativa
Con el fin de validar los valores de expresión obtenidos a través de arrays de expresión génica, se realizaron cuantitativa en tiempo real PCR utilizando tecnología Taqman® y la ABI PRISM 7500 Sequence Detection System instrumento equipado con el software versión 1.3.0 SDS (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Adelante y atrás primers y sondas fueron diseñados y producidos por Applied Biosystems para HSP90AA1 (Hs00743767_sH), y para el GUSB gen control endógeno (Hs00939626_mi). PCR se llevó a cabo en un volumen de reacción de 25 l que contenía 50 ng de ADNc, 1 × TaqMan PCR Universal Master Mix, y los conjuntos de cebador y sonda para HSP90AA1 y GUSB. Cada muestra se analizó por duplicado, y los valores de ciclo umbral medio (Ct) de cada muestra para GUSB, se restaron de los valores medios de Ct para HSP90AA1. Los valores Ct generada TaqMan fueron transformados log de los valores de expresión y representan frente a los Δlog2ratios entre GUSB y HSP90AA1 de la matriz de expresión.
estudios de inhibición del crecimiento celular
La inhibición del crecimiento después de
in vitro
exposición a la Hsp90 utilizado clínicamente inhibidor de 17-AAG (InvivoGen, San Diego, CA) fue examinado en tipo salvaje líneas celulares de NSCLC 4 EGFR (H460, H157, H441 y A549, obtenidos a partir de los Drs. P. Dennis y F. Kaye , NCI, Bethesda, MD). Brevemente, 10
5 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos de cultivo de tejidos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), se dejaron adherir, y luego continuamente expuestas a varias concentraciones de 17-AAG (0, 10, 30 , 100, 300, 1000 nM) durante 24, 48, o 72 horas. En cada punto de tiempo, las células fueron separadas de los pocillos, se incubaron con azul de tripano, y se determinó el número de células viables (azul de tripano-excluido) por triplicado utilizando un hemacitómetro. El número de células media con barras de error estándar se muestra en cada punto de tiempo. Además, el 50 IC
(concentración de fármaco en la que la inhibición del crecimiento del 50% se obtiene) de 17-AAG a las 72 horas se determinó para cada línea celular.
Resultados
dosis génica relacionados con la PI cambios de expresión génica en NSCLC
las aberraciones cromosómicas eran abundantes en los 32 pacientes con CPNM analizados. Con el fin de identificar los puntos de corte de las ganancias y pérdidas se aplicó el algoritmo de CGH llamada [11]. En la Tabla 2 se enumeran las regiones cromosómicas en el que las ganancias o pérdidas estaban presentes en al menos el 20% de los pacientes. La herramienta de ACE-it estadística [6] se utiliza para determinar si el número de copias del gen afectado la expresión génica. Un total de 359 transcripciones resultó ser significativamente afectada por el número de copias. En la Figura 1, las áreas de los genes afectados están indicados para pacientes con CPNM 32, que se muestra en verde (ganado regiones) o rojo (regiones perdidas).
solar Resumen para llamadas ganancias y pérdidas en 32 pacientes con CPNM resecado con copias de ADN cambios en el número indicado en gris. Los valores positivos indican el porcentaje de muestras encontrado con una ganancia. Los valores negativos indican el porcentaje de muestras que albergan una pérdida en la ubicación cromosoma especificado. Los genes en regiones determinadas afectadas por el aumento del número de copias se indican en verde y los genes afectados por la pérdida de número de copias se indican en rojo. Una selección de genes afectados se indica. La lista completa de los 359 afectados transcripciones se puede encontrar en el cuadro complementario S1.
Un análisis de supervivencia de regresión de Cox univariante se realizó para la expresión de los 359 genes que fueron identificados para ser influenciado por el número de copias (véase el cuadro complementario S1). Después de múltiples pruebas de corrección (usando el método de Benjamini Hochberg) ninguno de los 359 genes siguió siendo significativa para la supervivencia en este pequeño conjunto de pacientes (n = 32). La lista superior de genes correlacionados con la supervivencia (en el puesto de los valores de p primas) contenía principalmente los genes localizados en los cromosomas 3 y 5 regiones adquirido. También se observó un gen en la lista de los 20 mejores, HSP90AA1, localizado en el cromosoma 14. El gen HSP90AA1 (generalmente referido como HSP90), situado en 14q32.2, era el único gen en esta región con una reducción significativa expresión en pacientes afectados por la pérdida de esta región (P = 0,05). Estas observaciones nos llevó a investigar este locus con más detalle.
aberraciones genómicas en 14q y el gen HSP90AA1 correlación con la supervivencia expresión
Hemos investigado la correlación de la supresión ajustado recurrente en la región de 14q32.2- 33, con la supervivencia. Curiosamente, los pacientes en los que se suprime esta región tenían una supervivencia global mejorada (OS) en comparación con los pacientes que albergan un gen normal de dosificación en este locus (5 años OS 69% vs. 41%, P = 0,004-Figura 2A).
curvas (a) de Kaplan-Meier para la supervivencia global se muestran para 29 pacientes en relación con la dosis de genes en la región cromosómica 14q32.33. (B) La supervivencia global de 29 pacientes en relación con la expresión de HSP90. Bajo la expresión se define como la expresión más baja que la media del total de 32 muestras, la expresión "normal" se define como superior a la mediana de 32 muestras. Tres de los 32 pacientes incluidos en el análisis de la dosis génica y de expresión fueron excluidos del análisis de supervivencia debido a un tiempo de supervivencia de menos de 30 días.
Con el fin de investigar la expresión de HSP90 en relación con la supervivencia, se dividió a los 32 pacientes en dos grupos en función de su estado de supervivencia de dos años después de la resección del tumor. Aproximadamente la mitad de los pacientes se clasificaron como de "alto riesgo" y la otra mitad como de "bajo riesgo". Para identificar si ambos grupos de riesgo podrían ser discriminados mediante la expresión de genes de HSP90, que construyó las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier para los dos grupos de igual tamaño con "bajo" y "normal", basándose en la expresión de HSP90 mediana. Baja expresión de HSP90 se asocia con una mejor supervivencia global (OS 5 años 70% vs. 40%, P = 0,13-Figura 2B) aunque las diferencias entre los dos grupos fueron inicialmente no significativo debido probablemente a una combinación de una baja magnitud de la diferencia y un bajo número de pacientes analizados.
validación técnica de supresión 14q y la expresión de HSP90
Para validar la supresión observada en la región 14q32.2-33 se realizó la sonda de amplificación dependiente de la ligadura de múltiplex [13] (MLPA) el análisis mediante un probeset subtelomere que contiene una sonda en la región 14q32.33. El coeficiente de correlación (R
2) entre la pérdida de esta área detectado por CGH array y por MLPA era 0.439.
Para validar los datos de expresión de HSP90 obtenidos con microarrays hemos realizado cuantitativos RT PCR usando el Taqman® tecnología. Se observó una buena correlación entre la expresión de HSP90 medida con las dos técnicas diferentes (R
2 = 0,6431).
Validación de la expresión de HSP90 y su relación con la supervivencia en series de pacientes independiente
para investigar más a fondo la relación entre la baja expresión de HSP90 y el pronóstico de pacientes con CPNM, hemos utilizado tres conjuntos de validación independiente de los pacientes con CPNM. En los tres conjuntos de pacientes, el "bajo riesgo" /"alto riesgo" distribución de los pacientes en las cohortes de pacientes fue de aproximadamente dos tercios en comparación con un tercio. Por lo tanto, se utilizó el 33-percentil de expresión de HSP90 como de corte para la separación de los pacientes con (es decir, de alto riesgo) "normal" y la expresión "baja" (es decir, de bajo riesgo). Para los tres conjuntos de validación, baja expresión de HSP90 se correlacionó con la mejora de la supervivencia global. Esta correlación fue significativa para el primer y tercer conjuntos de validación (P = 0,003 y P = 0,04), y la significación marginal para el segundo conjunto (P = 0,07) (Figura 3). El análisis multivariado reveló que la HSP90 valor pronóstico era independiente de la etapa, el subtipo histológico, la edad y el sexo de los pacientes (Tabla 3) guía.
La supervivencia global de (A) a 140 pacientes con CPNM, la validación del conjunto 1 (B) 111 pacientes con CPNM, la validación del conjunto 2 y (C) 54 pacientes con CPNM, la validación del conjunto 3. el corte para distinguir entre baja y "normal" la expresión se basó en el percentil 33 de los valores de expresión.
Validación de Hsp90 como una diana molecular viable en un panel de líneas celulares de NSCLC
Hsp90 es una chaperona molecular que estabiliza varios oncoproteínas, incluyendo EGFR, y constituye un objetivo potencial para la terapia contra el cáncer novela. Los datos anteriores muestran que el nivel de expresión de Hsp90 es un indicador pronóstico de supervivencia a largo plazo en una serie amplia de pacientes con CPNM, y sugieren que los inhibidores de Hsp90 pueden tener utilidad más amplia en esta enfermedad que se había reconocido. Para examinar esta posibilidad, hemos probado si la inhibición farmacológica de la función Hsp90 impactaría el
in vitro
crecimiento celular en un panel de líneas celulares de cáncer. El crecimiento de estas líneas celulares, todos ellos con EGFR de tipo salvaje, era profundamente inhibida, en una dosis y tiempo dependiente, por concentraciones sub-micromolar de 17-AAG, un inhibidor de la Hsp90 [14] actualmente en fase II de ensayos clínicos (Figura 4). A las 72 horas, la IC50 estaba por debajo de 50 nM 17-AAG en todos los casos, y las concentraciones de fármaco más altas resultó consistentemente en marcado citotoxicidad.
(A-D) en tiempo y la inhibición dependiente de la dosis del crecimiento in vitro de H460, H157, H441 y A549 líneas celulares de cáncer tras la exposición a 17-AAG. Las células se sembraron a 105 /pocillo, y se determinó el número de células viables en los días subsiguientes como se describe en Métodos. 17-AAG concentraciones a (H441) o por encima (A549, H460 & amp; H157) 30 nM uniformemente dieron como resultado la pérdida dependiente del tiempo de la viabilidad celular. El valor IC50 de 17-AAG (exposición continua de 72 h) para cada línea celular es el siguiente:. H460 = 30 nM, H157 = 15 nM, H441 = 8 nM, y A549 = 20 nM
Discusión
sobre la base de los datos CGH-array en CPNM, se ha demostrado que existen vías de carcinogénesis molecular múltiples que son los más probable en relación con el género y el hábito de fumar [15]. Además, se ha demostrado que existe un gran solapamiento entre aberraciones observados en el adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas subtipo, a excepción de las ganancias de 3q que parecen ser más específico para el subtipo de carcinoma de células escamosas [16]. Diversas firmas de expresión génica se han correlacionado con la supervivencia de los pacientes de NSCLC [17] - [19]. Además, los estudios moleculares han permitido el desarrollo de enfoques de tratamiento personalizado en varios tipos de tumores [20] - [22]. Sin embargo, es probable que muchos genes diana relacionadas con el cáncer no se han identificado todavía. En este sentido, integrado genoma amplia detección de los cambios de número de copias y la expresión génica utilizando microarrays se ha llevado a cabo recientemente en varios tipos de tumores para identificar los genes cuya expresión se ve afectada por la dosis de genes [4], [23] - [26]. Estos estudios tienen como objetivo identificar nuevos genes relacionados con el cáncer y para definir nuevos biomarcadores de respuesta o firmas de pronóstico. Tanto en NSCLC y el cáncer pancreático ductal, dos amplificaciones focales de 8p12 y 20q11 han sido estudiados en detalle conduce a dos genes candidatos (WHSC1L1 y TPX2) importantes en estas enfermedades [16]
aquí realizado una amplia genoma integrado detección de cambios de número de copias de genes y la expresión de genes en 32 resecado radicalmente pacientes con NSCLC, con el fin de identificar nuevos genes relacionados con NSCLC. Mediante el uso de ACE-it, una nueva herramienta informática para la integración de la dosis génica y de datos de expresión génica, hemos identificado 359 transcripciones que se verán afectados de manera significativa por el número de copias. Un análisis de supervivencia de Cox en los 359 genes reveló ninguna relación significativa después de múltiples pruebas. La lista superior de los genes relacionados con la supervivencia fueron principalmente los genes que residen en regiones adquirido 3q y 5p. Estas regiones abarcan muchos genes y para identificar al gen de la mayor importancia es una tarea difícil. Otras investigaciones deben dilucidar la importancia de estos genes en relación con NSCLC, en particular de los que están en la lista de la parte superior de correlación con la supervivencia como SLC45A2, WDR70 y NIPBL (ver cuadro complementario S1). En este trabajo nos centramos en la recurrente supresión en el cromosoma 14 y el gen HSP90, que también estaba en la lista de la parte superior de la relación con la supervivencia y no se investigó en detalle previamente. La deleción de la región de 14q32.2-33 se correlacionó con la supervivencia mejorada, lo que sugiere, además, que puede contener uno o más genes relacionados con la progresión de NSCLC. La deleción de esta región ha sido descrito previamente por un grupo de informes aberraciones genómicas en NSCLC, pero no se investigó con más detalle [27]. Fuera de los 109 genes de mapeo para la región 14q32.2-33, HSP90 es el único gen con la expresión significativamente menor en los pacientes portadores de la deleción 14q32.2-33. En la serie inicial de 29 pacientes (3 pacientes excluidos del análisis de supervivencia), se observó una mayor supervivencia en pacientes con niveles más bajos de HSP90. La asociación entre los niveles de expresión de HSP90 y el pronóstico de pacientes con CPNM se confirmó que era significativa en tres conjuntos independientes de validación de pacientes con CPNM. El análisis multivariado incluyendo etapa, la histología, la edad y el sexo mostró que la HSP90 se mantuvo de forma independiente en relación con la supervivencia.
Una cuestión fundamental en la definición de "bajo" y "normal" la expresión es la elección adecuada de un valor de corte. En los primeros análisis se utilizó la mediana de los coeficientes de expresión como cortar entre "bajo" y "normal" de expresión, ya que el bajo riesgo y de alto riesgo de separación de los pacientes fue igual. Sin embargo, en la validación establece el bajo riesgo y grupos de alto riesgo de supervivencia no fueron equilibrados por igual (dos tercios en comparación con un tercio). En consecuencia, los valores de corte utilizados en estos conjuntos de datos no fue el valor de la mediana, pero el 33-percentil.
En este estudio, utilizando una escala del genoma análisis integrador del número de copias de genes y expresión hemos sido capaces de identificar la expresión de HSP90 como un gen importante en las primeras etapas de los pacientes con CPNM. HSP90 es una proteína chaperona que participan en la estabilización de múltiples oncoproteínas tales como EGFR, Her-2 y Akt [28]. Un trabajo reciente ha demostrado que HSP90 desempeña un papel en el mantenimiento de la conformación activa de EGFR y, en particular mutantes de EGFR [29], [30]. Mostramos aquí que varias líneas celulares de NSCLC que llevan de tipo salvaje EGFR son sensibles a la inhibición de HSP90, lo que indica que el efecto inhibidor de 17-AAG no puede atribuirse únicamente a EGFR mutante. HSP90 se ha reconocido recientemente como una diana terapéutica potencial de cáncer y las investigaciones de los inhibidores de HSP90 están en curso [31], [32]. En este sentido, las células de glioblastoma que sobreexpresan EGFR, pero resistente a la inhibición por los inhibidores de quinasa del EGFR, fueron sensibles a la inhibición de HSP90 [33]. Por lo tanto, mientras que Hsp90 puede ser necesario para estabilizar EGFR expresado sobre-o mutado, nuestros datos apoyan un papel más amplio y complejo para Hsp90 en la mediación de crecimiento NSCLC y la supervivencia. La sensibilidad nanomolar baja observada en las 4 líneas celulares sometidas a prueba en nuestros experimentos, está de acuerdo con otros informes publicados de líneas de células tumorales altamente sensibles 17-AAG [34] - [36]. Estas concentraciones son fácilmente alcanzables en los pacientes durante períodos de tiempo prolongados utilizando la programación actual y regímenes de dosificación [37]
.
En resumen, la observación de que el nivel de expresión de HSP90 es un factor pronóstico de supervivencia de pacientes con CPNM (independientemente del estado mutacional del EGFR ), junto con la extrema sensibilidad de las células de NSCLC tipo salvaje de EGFR a la Hsp90 inhibidor 17-AAG, sugiere que los inhibidores de Hsp90 pueden tener mayor utilidad clínica en NSCLC que ha sido considerado anteriormente y garantiza una mayor investigación de la dependencia de otros proto-oncogenes en esta proteína chaperona en el CPNM.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0001722.s001 gratis (0.03 MB PDF)
Reconocimientos
Agradecemos al consorcio europeo del cáncer de pulmón para proporcionar datos de microarrays de expresión génica de la 140 pacientes con CPNM independientes; Instituto Holandés del Cáncer: Sjaak hamburguesas, Tony Van de Velde; Médico de la Universidad de Gdansk: Jacek Jassem, Amelia Szymanowska, Marcin Skrzypski, Barbara Szostakiewicz, Witold Rzyman; Médico de la Universidad de Bialystok: Jerzy Laudanski, Miroslaw Kozlowski, Lech Chyczewski; Thoraxklinik Heidelberg: Michael Meister, Philipp A. Schnabel, Henrik Dienemann y Hans Hoffman. También damos nuestro agradecimiento especial a Sjoerd Vosse (Departamento de Patología, VU University Medical Center, Amsterdam, Países Bajos) para las discusiones de la bioinformática votos y Hans Gille (Departamento de Genética Clínica, VU University Medical Center, Amsterdam, Países Bajos) para realizar MLPA análisis.