Extracto
El ADN metiltransferasa azacitidina y decitabina representan las drogas arquetípicas para la terapia del cáncer epigenético. Para caracterizar la actividad de desmetilación de azacitidina y decitabina hemos tratado el cáncer de colon y las células leucémicas con ambos fármacos y análisis de la metilación del ADN basada en matrices utilizado de más de 14.000 genes promotores. Adicionalmente, la desmetilación inducida por el fármaco se comparó con los patrones de metilación de las células de cáncer de colon isogénicas que carecen tanto de ADN metiltransferasa 1 (DNMT1) y DNMT3B. Se demuestra que los patrones de desmetilación inducidas por fármacos son altamente específicos, no aleatoria y reproducible, lo que indica remetilación selectiva de loci específicos después de la replicación. Correspondientemente, se encontró que los dinucleótidos CG dentro de islas CG se convirtieron preferentemente remetilada, lo que indica un papel para el contexto de secuencia de ADN. También se identificó un subconjunto de genes que nunca fueron demethylated por el tratamiento de drogas, ya sea en el cáncer de colon o en líneas de células leucémicas. Estos genes de desmetilación resistente se enriquecieron para Polycomb represivas Complejo 2 componentes en células madre embrionarias y para el factor de transcripción motivos que no están presentes en genes desmetilados de unión. Nuestros resultados proporcionan una visión detallada de los patrones de metilación del ADN inducidas por azacitidina y decitabina y sugieren la participación de complejos mecanismos de regulación en la desmetilación del ADN inducido por fármacos
Visto:. Hagemann S, O Heil, Lyko M, Brueckner B ( 2011) azacitidina y decitabina inducir el gen-específico y no aleatoria de ADN desmetilación en líneas celulares de cáncer humano. PLoS ONE 6 (3): e17388. doi: 10.1371 /journal.pone.0017388
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Noviembre 2010; Aceptado: February 1, 2011; Publicado: 7 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Hagemann y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1463) a FL (www.dfg.de). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
metilación del ADN aberrante es una importante característica del cáncer [1], [2], [3]. En las células cancerosas, la hipometilación global está acompañada de genes supresores de tumores y hypermethylated transcripcionalmente silenciados. Estos llamados epimutaciones contribuyen a la pérdida de control de la proliferación en células de cáncer [4], [5], [6].
El mantenimiento de epimutaciones hipermetilación inducida requiere la actividad continua de metiltransferasas de ADN (DNMTs) durante la división celular. Por lo tanto, la inhibición de DNMTs se ha utilizado con éxito en la terapia del cáncer epigenético de revertir epimutaciones y reactivar los genes supresores de tumores silenciados epigenetically [7], [8], [9], [10]. Los inhibidores de Dnmt arquetípicas 5-azacitidina (azacitidina, AZA) y 2'-desoxi-5-azacitidina (decitabina, DAC) han sido aprobados para el tratamiento del síndrome mielodisplásico, un trastorno de la médula ósea preleucémica. A pesar de su uso en la clínica y en numerosos estudios preclínicos, el conocimiento del mecanismo de acción de estos fármacos es todavía incompleta [11].
Uno de los principales efectos celulares observados constantemente de azacitidina y decitabina es la desmetilación del ADN . Como análogos de nucleósidos, AZA y DAC se incorporan en el ADN de replicación, donde pueden formar enlaces covalentes con DNMTs [12], [13], [14]. Esta captura de DNMTs conduce a la desmetilación pasiva durante la replicación del ADN y la división celular. La inhibición de la metilación del ADN por AZA y DAC se ha demostrado con éxito en loci seleccionado en diversos estudios clínicos [7], [9], [15].
Recientemente, los efectos de AZA y DAC también se han investigado en el nivel genómico. Debido a la limitada disponibilidad de herramientas adecuadas para el análisis de metilación de todo el genoma, estos estudios se limitaron inicialmente para el análisis de los cambios de transcripción inducida por fármacos. Por ejemplo, se utilizó el perfil de expresión génica para analizar los efectos de DAC en el patrón de expresión génica de células de cáncer de colon HCT116 y los resultados sugieren que, además de la activación de genes de genes hypermethylated, regulación a la baja de la transcripción puede ser un efecto importante de la DAC [16], [17]. Más recientemente, las matrices Illumina GoldenGate se utilizaron para caracterizar directamente desmetilación del ADN inducido por fármacos a 1.505 dinucleótidos CG que representa 807 genes relacionados con el cáncer de células de leucemia mieloide [11]. Sin embargo, debido a la baja cobertura comparable de esta matriz, los datos resultantes fueron analizados en los detalles y las características moleculares de las respuestas desmetilación del ADN se mantuvieron a ser investigado.
En el presente estudio, se utilizó la escala del genoma Infinium análisis para caracterizar sistemáticamente las respuestas de desmetilación después del tratamiento AZA y DAC en dos líneas celulares de cáncer humano. Con este fin se investigaron los niveles de metilación de más de 27.000 dinucleótidos CG que representa a más de 14.000 genes [19] en las células HCT116 de cáncer de colon y en células HL-60 de leucemia mieloide. Nuestros resultados muestran que la AZA y DAC demethylate GC en las islas de los no-CG de manera más eficiente que los de las islas CG (CGI). Por otra parte, el tratamiento con AZA y DAC resultados en los patrones de desmetilación del ADN no aleatorias y reproducibles en HCT116 y células HL-60. Además, hemos identificado un subconjunto de los GC que ni se demethylated después del tratamiento con fármaco ni en células con niveles muy reducidos de DNMT1 y sin DNMT3B [20], [21]. GC desmetilación resistentes se asocian con genes preferentemente vinculados por componentes Polycomb represivas complejo 2 (PRC2) en células madre embrionarias y se enriquecen de motivos de unión de factores de transcripción que no están presentes en los genes desmetilado. Estos resultados desentrañar los patrones de desmetilación del ADN por AZA y DAC y sugieren que la desmetilación inducida por el fármaco está regulada por mecanismos moleculares definidos.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
Humano células de colon HCT116 carcinoma y HCT116 doble knockout (DKO) células (DNMT1 - /-; DNMT3B - /-) fueron amablemente proporcionados por Bert Vogelstein (julio de 2007) y se cultivaron en condiciones estándar en medio 5A de McCoy suplementado con 5% de L-glutamina y 10% de FCS (Invitrogen). La identidad de las células HCT116 fue confirmada por DMSZ (Braunschweig, Alemania, enero de 2008) el uso de perfiles de ADN de ocho repeticiones en tándem cortas. Se obtuvieron células HL60 de la ATCC y se cultivaron en condiciones estándar en medio RPMI (Sigma) suplementado con 5% de L-glutamina y 10% de FCS (Invitrogen). alícuotas frescas de todas las líneas celulares se utilizaron para los experimentos. Para analizar los efectos de la 5-azacitidina (AZA) y 2'-desoxi-5-azacitidina (DAC), las células fueron cultivadas en medios suplementados con los compuestos, a las concentraciones indicadas.
Inhibidores
5 mM de soluciones madre de AZA (Sigma) y DAC (Calbiochem) se prepararon disolviendo las sustancias en agua destilada H
2O (GIBCO) y se almacenaron a -80 ° C. Inmediatamente antes del tratamiento, las soluciones madre se diluyeron en medio de cultivo celular a las concentraciones indicadas.
Análisis genómico metilación del ADN
células tratadas con las drogas se incubaron con las concentraciones indicadas de AZA y DAC después de un 24 h período de siembra, y se preparó el ADN genómico utilizando la sangre y DNeasy Tissue Kit (Qiagen). los niveles globales de metilación del ADN genómico se determinaron mediante electroforesis capilar como se describe anteriormente [22].
basado en arreglo metilación del ADN análisis
Se realizó un análisis de metilación del ADN de genes específicos de Array basado en el uso de grano de la viruta Infinium HumanMethylation27 tecnología (Illumina) según las instrucciones del fabricante. En breve, el ADN genómico tratado con bisulfito era todo el genoma amplificado y se hibrida a la HumanMethylation27 BeadChip. Oligómeros, unidos a dos tipos diferentes de cuentas por locus interrogado, coinciden o bien el no metilado o el estado metilado, permitiendo la extensión de una sola base y detección. El estado de metilación de una citosina específica se indica por valores beta promedio (BAV), donde 1 corresponde a la plena metilación y 0 para no metilación. Los valores delta beta (DB) se calcularon restando los valores de AVB células tratadas o knock-out de los valores de control AVB. réplicas biológicas (ver Figura S2) de cada experimento se agruparon y gama de sondas con
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≥0.05 fueron excluidos del análisis. Loci se anotó como metilado si la AVB fue mayor que o igual a 0,2 [23]. están disponibles en la base de datos ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress) los datos completos de metilación CG. Para una descripción más detallada de la normalización y otros cálculos se refieren a métodos S1. Los resultados fueron analizados utilizando el software BeadStudio de Illumina, versión 3.1.3.0 y con R, versión 2.10.0 [24]. En concreto, se utilizaron siguientes paquetes de R para el análisis de datos: gráficos (diagramas de caja), estadísticas (estimaciones de densidad kernel y los análisis estadísticos), el paquete limma [25] para la construcción de diagramas de Venn y el paquete de celosía [26] para la visualización de multivariante (parcelas de datos enrejado).
454 secuenciación de ADN con bisulfito
secuenciación de bisulfito de ADN profundo de los GC de 4 genes (PIK3CG, Ells1, Aff2, NTRK3) se llevó a cabo como se describe anteriormente [27], [ ,,,0],28]. Para la secuencia 454, ADN genómico tratado con bisulfito se amplificó usando cebadores específicos de secuencia que contienen códigos de barras específicos al tratamiento y 454 secuencias de enlace (Figura S7). 454 secuenciación profunda fue realizada por el Fondo para el DKFZ Genómica y Proteómica.
Análisis del factor de transcripción motivos
para identificar los motivos de unión del factor de transcripción enriquecido se utilizó la herramienta en línea PScan [29] y 130 de unión factor de transcripción de unión a los perfiles (
H. sapiens
) a partir de la base de datos JASPAR [30]. El análisis de los genes se centró en la región de -450 a 50, con respecto a su sitio de inicio de la transcripción. Para resumir los resultados del análisis PScan, se generó un mapa de calor que muestra el logaritmo natural de los
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valores.
Resultados
Establecimiento de las condiciones de tratamiento para aza- y DAC desmetilación inducida en las células HCT116
Como un primer paso hacia una caracterización sistemática de las respuestas de desmetilación inducida por azacitidina (AZA) y decitabina (DAC), que tuvo como objetivo maximizar la eficiencia desmetilación, para minimizar la toxicidad de drogas [31], [32] y para evitar remetilación como se ha observado durante el tratamiento a largo plazo [33]. Con este fin, se trataron las células HCT116 con el aumento de las concentraciones de fármaco (Figura 1A) y sobre varios periodos de tiempo (Figura 1B) para determinar los niveles de metilación genómica globales por electroforesis capilar. Los resultados mostraron claramente para ambos fármacos que la máxima desmetilación se alcanzó con concentraciones de 1 mM después de 24 a 36 h con DAC que muestra una reducción de 60% y AZA mostrando una reducción del 50% de la metilación del ADN global.
Desde azanucleosides requieren la replicación del ADN para su función, analizamos si el número de células en fase S podría verse afectada por el tratamiento de drogas. células HCT116 se trataron con 0,1, 1, y 10 M de AZA o DAC y distribución del ciclo celular se analizó mediante FACS (Fluorescence activados en Cell Sorting). Mientras que la proporción de células en fase S se aumentó después del tratamiento 24 h con 0,1 a 10 mM AZA o DAC, tiempos de incubación más largos solamente resultaron en una disminución de la replicación de las células durante varias concentraciones de fármaco (Figura S1A). Por otra parte, también FACS análisis reveló que las concentraciones de fármaco solamente altas (10 mM) dio lugar a una detención en la fase G2, que fue acompañada por una reducción de las células en la fase G1 (Figura S1B). Además, la muerte celular pronunciada se observó sólo con altas concentraciones de fármaco, especialmente después del tratamiento con 10 mM AZA, lo que indica que las células tratadas con AZA detuvieron para replicar y murieron. Estas observaciones confirmaron que desmetilación debe analizarse después de 24 h y a 1 mM concentración de fármaco para excluir los efectos de confusión de la toxicidad del fármaco.
Array basada en todo el genoma análisis de la metilación del ADN
Para analizar el ADN los patrones de metilación de las células HCT116 en un genoma de gran escala que utilizan Infinium perfiles de metilación para interrogar el estado de metilación de los dinucleótidos CG que representa 27.578 14.475 genes asociados [11], [19]. La metilación de loci individuales se determinó por medio de valores beta (BAV) que van desde 0 (no metilado) a 1 (completamente metilado). Basado en estudios previos [19], sólo los GC que mostraron una disminución o aumento de su valor AVB (delta beta, DB) de al menos 0,2 se utilizaron para el análisis de los cambios de metilación. réplicas biológicas de las células de control y las células HCT116 tratadas con el fármaco mostraron una muy alta similitud (Figura S2A, B, C), lo que confirma la robustez técnica de la matriz y la alta especificidad de los patrones de metilación inducida por fármacos.
subsiguiente análisis de los datos reveló claramente una distribución bimodal de CG metilación dinucleótido con un pico de bajo metilación (13.667 de 27.571 GC) que se encontró en los valores AVB van de 0 a 0,2 y un pico de alta metilación (8.222 de 27.571) que cubría el intervalo de 0,8 a 1,0 (Figura 1C). Al igual que en las células no tratadas, la distribución bimodal de metilación también se observó después del tratamiento de las células con AZA y DAC (ver Figura 1C). Sin embargo, después del tratamiento de drogas el pico de alta metilación (AVB≥0.8 en células de control) se desplazó a valores más bajos de metilación, lo que indica desmetilación inducida por fármacos.
A, el análisis de la metilación Global (CE) de las células HCT116 tratados con las concentraciones indicadas de AZA y DAC durante 24 h. B, El curso temporal de medición de desmetilación CE inducida por fármacos utilizando 1 M AZA o DAC; Co, las células HCT116 no tratados. C, estimaciones de la densidad del núcleo de datos metilación Infinium para tratar (Co) y las células tratadas con fármaco. D, Validación de Infinium metilación de datos utilizando la secuencia 454 bisulfito; metilación de datos de CG 4 loci, medidos ya sea por análisis Infinium o por la secuencia 454, se correlacionan fuertemente (de Pearson coeficiente de correlación r = 0,84); tratamiento con AZA y DAC está indicada por A y D, respectivamente; diferentes loci se indican mediante colores: PIK3CG (azul), NTRK3 (verde), Ells1 (rojo), y AFF2 (negro) guía empresas
Para validar los resultados de la matriz de metilación, se utilizó altamente cuantitativa 454 bisulfito. secuenciación [28] para analizar cuatro GC fuertemente metilados que se hizo demethylated por tratamiento con fármaco en las células HCT116. En promedio, se obtuvieron alrededor de 300 lecturas por CG (ver Figura S7). El análisis de correlación de los datos de secuenciación y resultados de la matriz (Figura 1D) bisulfito mostró un muy buen acuerdo global de ambos métodos (r = 0,84). Estos resultados demuestran que la matriz Infinium metilación genera una representación exacta del patrón de metilación HCT116 en nuestros experimentos.
patrones de desmetilación son inducidos por fármacos no aleatoria
Más análisis de datos de la matriz mostraron que el tratamiento con AZA dio lugar a la desmetilación (DB≤-0.2) de 6% (852 de 13911) de la GC metilado en las células control (Figura 2A). Mostrando una eficacia aún mayor, el tratamiento indujo DAC desmetilación de 11% (1487 de 13911) de estos sitios CG (Figura 2B). Una prueba de suma de rangos de Wilcoxon confirmó la importancia de la diferencia entre la metilación en aza- y las células del CAD-tratado (Figura 2C,
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-16). La mayor eficiencia de la desmetilación mediada por DAC en el nivel específico de gen es consistente con nuestro análisis global de metilación en las células HCT116 (Figura 1A, B).
cambios de metilación en las células HCT116 tratadas durante 24 h con AZA (A ) o DAC (B); puntos azules y números representan desmetilados GC (DB≤-0.2). C, Boxplots muestran la distribución de los GC metilados en muestras de control HCT116 y las células tratadas con AZA o DAC; líneas negras indican las medianas, las muescas de los errores estándar, cajas del rango intercuartil, y bigotes los percentiles 2,5 y 97,5. D, diagramas de Venn indican GC desmetilado se solapan en las células tratadas con el fármaco.
En base a la observación de que los patrones de desmetilación parecían ser sorprendentemente específica con alta reproducibilidad inter-replicarse, nos preguntamos si ambos fármacos comparten comúnmente desmetilados dinucleótidos CG. Para identificar los GC comúnmente demethylated agrupamos AZA y DAC repeticiones, respectivamente, y encontramos un importante número de GC que fueron demethylated por ambas drogas (Figura 2D). Esta superposición fue significativamente mayor que la esperada por desmetilación aleatorio (
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-16, prueba exacta de Fisher), lo que indica que los loci específicos son preferentemente desmetilados por AZA y DAC. A pesar de la actividad de desmetilación generalizada de AZA y DAC, un número sustancial de dinucleótidos CG apareció resistente a la desmetilación inducida por el fármaco en las células HCT116 (Figura 2A, B).
Resistencia a la desmetilación inducida por fármacos se supera principalmente en DNMT1 ; células doble knockout DNMT3B
Para caracterizar mejor las CG resistente a la desmetilación inducida por fármacos se obtuvieron los perfiles de metilación de las células HCT116 con niveles muy reducidos de DNMT1 y la pérdida completa de DNMT3B (células DKO). análisis de los datos reveló desmetilación pronunciada en las células DKO con más de 85% de los GC metilados ser desmetilado (Figura 3A). células DKO también mostraron el mayor grado de desmetilación representado por valores de la mediana DB de menos de -0,55 relación con las células control (Figura 3B). En comparación, se observó significativamente (
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-16, Wilcoxon rango suma de prueba). Más bajos grados de desmetilación de AZA y DAC (Figura 3B)
, células DKO muestran diferencias sustanciales en las células HCT116 en su patrón de metilación; puntos azules y números representan desmetilados o hypermethylated GC (DB≤-0,2 o ≥0.2). B, Boxplots muestran la desmetilación (DB) en las células tratadas con el fármaco HCT16 y células DKO; líneas negras indican las medianas, las muescas de los errores estándar, cajas del rango intercuartil, y bigotes los percentiles 2,5 y 97,5. C, la comparación de la metilación media relativa de las células tratadas con fármaco y las células DKO según lo determinado por análisis global genómico metilación (CE) y el análisis de metilación Infinium. D, diagramas de Venn indican GC desmetilado se solapan entre las células tratadas con el fármaco y células DKO.
A continuación comparó el nivel de metilación media de GC genes asociados derivados de la matriz Infinium a la metilación mundial medido por electroforesis capilar (CE) (Figura 3C). Además de análisis de metilación Infinium, CE también interroga a los GC en elementos repetitivos que comprenden la mayoría de ADN metilado en el genoma humano [34]. Curiosamente, el grado de desmetilación de todo el ADN genómico fue siempre mayor que la desmetilación de genes específicos. Esto sugiere que los GC en elementos repetitivos se hizo desmetilado más eficientemente que los GC genes asociados. Cuando se compararon los patrones de desmetilación de líneas celulares knockout tratados con la droga y, se encontró que el 92% de los GC demethylated por AZA y el 90% de los GC demethylated por el CAD también se desmetilados en las células DKO (Figura 3D). Sin embargo, nuestros resultados indican que la desmetilación inducida por fármacos de genes específicos es relativamente ineficiente en comparación con el genoma entero y para Dnmt con deficiencia de células.
desmetilación inducida por medicamentos de cáncer relacionados y los genes supresores de tumores de buena fe
a continuación analizaron desmetilación inducida por el fármaco en un panel de genes asociados con el cáncer (adaptado de la metilación GoldenGate Cancer Panel I, Illumina). De 807 genes asociados con el cáncer en este panel, 784 (representado por 2.125 GC) también estuvieron presentes en el chip de la metilación Infinium. El análisis de nuestros datos de metilación reveló que los genes relacionados con el cáncer fueron más altamente metilado de genes no relacionados con el cáncer, que están presentes en la plataforma Infinium pero no en GoldenGate (Figura 4A). Además, la metilación relacionada con el cáncer se redujo fuertemente en las células DKO (Figura 4A).
, los niveles de metilación medianas de los GC relacionados con el cáncer y no relacionados con el cáncer en las células no tratadas (CO), las células tratadas con el fármaco A (AZA, DAC) y células DKO. B, mapa de calor de CG metilación en los genes asociados con el cáncer. C, mapa de calor de hypermethylated tumorales supresores de buena fe-genes en células knockout DNMT tratados con la droga y.
Un análisis detallado reveló que de 2.125 casos de cáncer asociados GC, un conjunto de 906 GC fue hypermethylated ( AVB≥0.8) en el control de las células HCT116. DAC desmetilado estos genes hypermethylated asociados con el cáncer con una eficiencia similar a la AZA (Figura 4B). Curiosamente, se observó que casi todos los genes fueron fuertemente desmetilados en células DKO. También se obtuvieron resultados similares para un conjunto de genes hypermethylated de buena fe supresores de tumores (Figura 4C). Estos datos ilustran aún más la capacidad de DAC y AZA demethylate genes supresores de tumores, y sugieren que la desmetilación general específico del gen inducido por fármacos es comparativamente débil.
islas no CG y CG altamente metilados son preferentemente desmetilado
Para matizar aún más nuestro análisis, hemos distinguido entre el CGI y los GC no asociado a CGI. Como era de esperar [35], [36], los GC en las CGI no eran predominantemente metilado (3,667 de 7,513, AVB≥0.8), mientras que los de las CGI eran en su mayoría no metilado (12.782 de 20.002, AVB≤0.2) (Figura 5). Además, también se observó una fracción importante de los GC altamente metilados que se asociaron con CGIs (4527 de 20002, AVB≥0.8), que es consistente con la hipermetilación CGI en el cáncer [6]. Curiosamente, nuestros resultados muestran que ambos, AZA y DAC, desmetiló una mayor proporción de GC metilados no ubicados en CGIs. En concreto, en células HCT116, AZA desmetilado 3,0% (219 de 7224) de los dinucleótidos CG metilados en CGIs pero 9,5% (633 de 6687) CG metilados en no CGIs (Figura 5B); DAC demethylated 6,6% (474 de 7.224) de dinucleótidos CG en CGI, pero en los GC no CGI (Figura 5C) 15,2% (1.013 de 6.687). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que los dinucleótidos CG dentro de los CGI se convirtió remetilada preferentemente después de desmetilación pasiva inducida por fármacos (P
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-16, prueba exacta de Fisher).
A, Boxplots indicar diferencias en la metilación entre los CGI y no CGI. B, la eficiencia espectáculo desmetilación Boxplots indicado por los valores de DB en aza- y las células HCT116 que dependen de la asociación con CG CGI DAC-tratada. Para A y B, líneas negras indican las medianas, las muescas de los errores estándar, cajas del rango intercuartil, y bigotes los percentiles 2,5 y 97,5. C, Boxplots muestran eficiencias de desmetilación como una función del grado de CG-metilación en aza- y células HCT116 DAC-tratada. los niveles de metilación se agruparon en intervalos de 10% de 0 a 100% de metilación; marcas negras indican las medianas, cajas del rango intercuartil, y bigotes los percentiles 2,5 y 97,5.
Para analizar si la eficiencia desmetilación es una función del grado de metilación CG, agrupamos los GC por su metilación nivel en 10 intervalos de 10% a 100% de metilación y determinada a la que se desmetilado GC medida en diferentes intervalos. Nuestros resultados muestran que la desmetilación inducida por DAC aza- y era más eficiente para gráficos de ordenador altamente metilados (intervalos de metilación de 60% a 100% de metilación). La importancia de este efecto se ilustra adicionalmente mediante un análisis similar de la eficiencia desmetilación en las células DKO. Aquí, los GC de todos los niveles de metilación se desmetilados igual de bien, como se ha demostrado por el constante aumento de la distancia de sus puntos medios de la línea de base (Figura 5D). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la AZA y DAC preferentemente conducen a la desmetilación de dinucleótidos CG altamente metilados.
Dado que los GC no CGI-asociado muestran los niveles de metilación más altos que los CGI asociada a los GC (Figura 5A), que además analiza si la diferencia metilación de los dos grupos resultó en la diferencia observada en la eficiencia desmetilación entre CGI- y GC no asociado-CGI (Figura 5B, C). Con este fin, se agruparon los GC, de acuerdo con su nivel de metilación en las células no tratadas, en intervalos de igual metilación y desmetilación decididos de los GC en CGI y no CGI (Figuras S3, S4). Este análisis confirmó que los niveles de metilación de más de 50-60% en las células HCT116 (mayor que el 20-30% de las células HL60, ver más abajo), los GC en la no-CGI vuelto significativamente más desmetilado de los GC en CGI.
desmetilación inducida por fármacos en células de leucemia mieloide
Hemos tratado de confirmar nuestros hallazgos anteriores en un modelo más estrechamente relacionada con la indicación aprobada de DAC y AZA. Con este fin, se trataron células HL-60 de leucemia mieloide durante 24 h con las concentraciones de fármaco que indujeron en la respuesta más fuerte desmetilación (0,5 M DAC o AZA) y los perfiles de metilación de nuevo obtenidos por análisis Infinium. Los resultados mostraron que el tratamiento con AZA resultó en desmetilación fuerte (DB≤-0,2) de 16% (1839 de 11406) de la GC metilado en las células control (Figura 6A). tratamiento DAC inducida desmetilación de 8% (941 de 11406) de estos sitios CG (Figura 6B). los niveles de metilación entre las células tratadas con fármaco diferían significativamente (
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-16, prueba de Wilcoxon de suma de rangos), como se describe anteriormente para las células HCT116, y de nuevo observó una fuerte solapamiento de los GC desmetilado por AZA y DAC (Figura S5E). La comparación de los GC CGI asociada y los GC no asociado a CGI demostró que los GC en CGIs eran menos metilado que los de no-CGI, que está de acuerdo con nuestros hallazgos en las células HCT116. Además, como ya se observó en las células HCT116, AZA y DAC desmetilados GC en la no-CGI de manera más eficiente que los de los CGI en las células HL60 (Figura 6C, D) (
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- 16, prueba de Wilcoxon de suma de rangos). De acuerdo con nuestros hallazgos en las células HCT116, desmetilación inducida por fármacos también era más eficiente para gráficos de ordenador altamente metilados en células HL60 (Figura 6E, F).
cambios de metilación en las células HL60 tratadas por 24 h con AZA (A) o DAC (B); puntos azules y números representan desmetilados GC (DB≤-0.2). eficiencia espectáculo desmetilación C, D, indicado por los valores Boxplots DB en aza- y las células HCT116 tratados con DAC que dependen de la asociación con CG CGI; líneas negras indican las medianas, las muescas de los errores estándar, cajas del rango intercuartil, y bigotes los percentiles 2,5 y 97,5. Boxplots muestran eficiencias de desmetilación como una función del grado de metilación CG en E, aza- y F, las células HL60 tratadas con DAC. los niveles de metilación se agruparon en intervalos de 10% de 0 a 100% de metilación; marcas negras indican las medianas, cajas del rango intercuartil, y bigotes los 2,5º y 97,5 percentiles.
Resistencia a la desmetilación se correlaciona con una ocupación PRC2 y el factor de transcripción vinculante
Finalmente consideramos potencial mecanismos moleculares que pueden modular la eficiencia desmetilación inducida por fármacos. Estudios previos han sugerido que la unión de los complejos Polycomb (PRC2) específica puede inducir la hipermetilación de promotores de genes durante la tumorigénesis [37], [38]. De acuerdo con ello, las regiones PRC2 asociada pueden estar predispuestos a la rápida remetilación después de la replicación. Por lo tanto, asignamos los datos de asociación de genoma para SUZ12, EED, y H3K27 trimethylation [39] a los CG correspondientes en el chip Infinium. Nuestro análisis reveló que los GC asociados con los componentes PRC2 interrogados muestran metilación superior mediana de los GC no asociado con PRC2 (Figura 7A). Curiosamente, los GC PRC2 asociada fueron significativamente más resistentes a la desmetilación mediante la AZA y DAC (Figura 7B, C).
A, Boxplots muestran la distribución de CG metilación en los GC PRC2 asociada a los GC y no PRC2-asociado en las células HL60. B, C, Boxplots eficiencia espectáculo desmetilación indicado por los valores de DB en aza- y en células HL60 tratadas con DAC que dependen de asociación con componentes PrC2. Para las líneas negras A, B, y C denotan las medianas, las muescas de los errores estándar, cajas del rango intercuartil, y bigotes los percentiles 2,5 y 97,5. D, diagramas de Venn indican los GC, que no llegó a ser desmetilado (AVB≥0.8) en HCT116 tratados con la droga y las células HL60 y en células DKO, respectivamente. E, el porcentaje de GC desmetilación resistentes asociadas con los componentes PRC2 en HCT116 y células HL60, y para gráficos de ordenador de ambas líneas celulares (HCT116 & Amp; HL60) superpuestas. F, Importancia del enriquecimiento de factor de transcripción sitios en los genes con los GC desmetilación resistente en HCT116 y células HL60 y con los GC que se convirtió en demethylated por AZA y DAC en HCT116 y células HL60 (sensibles a la desmetilación) de unión. Zona de juego columnas representan log (
valores de P
) para el enriquecimiento de 130 factores de transcripción.
Para perfeccionar este análisis, nos centramos en los GC posteriormente desmetilación resistente. Hemos identificado un conjunto de 1129 GC genes asociados que eran resistentes a la desmetilación mediante la AZA y DAC en las células HL60 (AVB≥0.8). Curiosamente, 75% de estos GC también eran resistentes a la desmetilación inducida por el fármaco en las células HCT116 (Figura 7D). Un análisis detallado mostró que los componentes PRC2 fueron fuertemente enriquecidas en regiones promotoras de los GC resistentes a la desmetilación en HCT116 y células HL60, así como en la superposición de los GC resistente de las dos líneas celulares (Figura 7E). Para identificar las características más distintivas de los GC desmetilación-sensibles y resistentes, también se analizó si los genes que albergan los GC desmetilación resistente se caracterizan por diferentes conjuntos de factor de transcripción motivos de unión en comparación con los genes que se convierten en desmetilado. El uso de la herramienta de software Pscan [29], se analizó la presencia de sitios de unión para 130 factores de transcripción en 644 genes (851 GC) que eran resistentes a la desmetilación en HCT16 y células HL-60 y 121 genes (128 GC) que se convirtió en demethylated en ambas líneas de células después del tratamiento de drogas. El análisis reveló que los GC desmetilación-sensibles y resistentes se asocian con genes que muestran un enriquecimiento complementaria de sitios de unión de factores de transcripción (Figura 7F, la Figura S8). Curiosamente, los correspondientes factores de transcripción también pertenecen a diferentes familias de factores de transcripción (véase la Figura S9). Por ejemplo, los sitios de unión a factores caja forkhead (Fox) de transcripción se enriquecen en los genes sensibles mientras que desmetilación básica factor de transcripción hélice-bucle-hélice (bHLH) sitios de unión se enriquece en genes resistentes desmetilación. Estos resultados confirman la idea de que los mecanismos moleculares específicos, basados en la secuencia de contexto y de configuración de la cromatina, están involucrados en la regulación de la desmetilación del ADN inducido por fármacos.
Discusión
El papel de la metilación del ADN en el tumor biología celular se ha analizado sistemáticamente en células HCT116 y células knockout DNMT en dos estudios anteriores [16], [17]. Estos estudios utilizaron el enfoque indirecto de desenmascaramiento farmacológica [40] para identificar los genes metilados través de cambios en su perfil transcripcional. Curiosamente, los datos recientes muestran que la AZA y DAC inducen diferentes conjuntos de genes con solamente poca superposición [41]. Este hallazgo es consistente con los datos publicados previamente que indican que ambos compuestos se metabolizan de manera diferente y por lo tanto inducen diferentes efectos sobre la viabilidad celular [42].