Extracto
La desregulación de la no receptor tirosina quinasa ETK /BMX ha sido reportado en varios tumores sólidos. En este informe, hemos demostrado que la expresión ETK se aumenta progresivamente durante la progresión del cáncer de vejiga. Se encontró que la baja regulación de ETK en células de cáncer de vejiga atenuadas actividad STAT3 y AKT mientras que la sobreexpresión exógena de ETK tuvo efectos opuestos, lo que sugiere que la desregulación de ETK puede atribuir a la elevada actividad de STAT3 y AKT detectado con frecuencia en el cáncer de vejiga. La supervivencia, la migración y la invasión de células de cáncer de vejiga se vieron comprometidas significativamente cuando la expresión ETK fue derribado por un shRNA específica. Además, demostramos que ETK se localiza en las mitocondrias en las células de cáncer de vejiga a través de la interacción con Bcl-XL y la regulación de la producción de ROS y la sensibilidad a los fármacos. Por lo tanto, ETK puede jugar un papel importante en la regulación de la supervivencia, la migración y la invasión de la modulación de múltiples vías de señalización en las células de cáncer de vejiga. análisis de inmunohistoquímica en microarrays de tejidos que contienen 619 muestras de tejido de la vejiga humanos muestra que ETK es aumentada de manera significativa durante el desarrollo y la progresión del cáncer de vejiga y el nivel de expresión ETK predice la tasa de supervivencia de los pacientes con cistectomía. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que ETK puede servir potencialmente como una nueva diana terapéutica para el tratamiento del cáncer de vejiga, así como un biomarcador que podría ser utilizado para identificar a los pacientes con mayor riesgo de mortalidad, que se podrán beneficiar con terapias dirigidas a la actividad ETK.
Visto: Guo S, Sol M, Guo Z, Li W, A Alfano, Chen H, et al. (2011) tirosina quinasa ETK /BMX está regulado en el cáncer de vejiga y predice mal pronóstico en pacientes con cistectomía. PLoS ONE 6 (3): e17778. doi: 10.1371 /journal.pone.0017778
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: 20 de enero de 2011; Aceptado: 9 Febrero 2011; Publicado: 7 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIH (CA106504) y el DOD (W81XWH-08-1-0174) concede a YQ, Fundación Nacional de Ciencias Naturales de china (30872584) y la Fundación de Ciencias Naturales de Guangdong (8251008901000018) a SQ Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es uno de los cánceres más comunes en los Estados Unidos. Se estima que habrá 70,530 nuevos casos y 14.680 muertes por cáncer de vejiga en 2010 [1], [2], [3]. factores genéticos y epigenéticos múltiples se cree que contribuyen al riesgo de desarrollar cáncer de vejiga. Además de los factores de riesgo bien conocidos, tales como el envejecimiento, el género, la exposición a humo de cigarrillos y productos químicos industriales, varias lesiones genéticas que proporcionan señales para la transformación celular, la proliferación, la migración y la invasión en el cáncer de vejiga se han identificado [4]. Estos incluyen mutaciones o alteraciones en la expresión de p53, PRB, E-cadherina, COX2, BLCA-4, CXCL1, MMP-2/9 y EGFR [5]. aumento acumulado en estos defectos genéticos también proporciona la evaluación del pronóstico de evolución de la enfermedad. Sin embargo, es necesaria una mayor comprensión de la biología del tumor de vejiga para desarrollar una terapia más eficaz. Hay así una necesidad para la identificación y la aplicación de nuevos objetivos terapéuticos en el cáncer de vejiga.
epitelial y endotelial tirosina quinasa (ETK), también conocido como la médula ósea X quinasa (BMX), es un miembro de la familia Tec no receptor de tirosina quinasa. ETK contiene un dominio NH2-terminal Pleckstrin de homología, una homología Src 3 de dominio, una homología 2 dominio Src, y un dominio tirosina quinasa COOH-terminal [6]. ETK puede activarse por varios estímulos extracelulares, incluyendo factores de crecimiento, citoquinas, hormonas de la matriz extracelular y [7]. proteína ETK está presente en el citoplasma con una fuerte tinción perinuclear en las células cuando se examinan mediante microscopía de inmunofluorescencia [8], [9], [10]. La activación de la actividad de quinasa ETK se puede lograr por la interacción de su dominio de homología pleckstrin ya sea con la fosfatidilinositol 3-quinasa fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato producto o el dominio FERM de FAK, que conduce a la translocación de la membrana plasmática de ETK [6], [8]. ETK se ha demostrado que desempeñan un papel en diversos procesos celulares incluyendo la proliferación celular, la transformación, la diferenciación, la migración y la metástasis. ETK puede interactuar con FAK y p130
Cas para regular el citoesqueleto de actina y la motilidad celular [8], [11]. También se ha demostrado que ETK interactúa directamente con p53 reprimir tumor e inhibir su translocación nuclear, promoviendo así la quimiorresistencia en células de cáncer [9]. Anteriormente puso de manifiesto que ETK es aumentada progresivamente durante el desarrollo del cáncer de próstata humano y la progresión [12], [13]. Sin embargo, el papel de ETK en células de cáncer de vejiga sigue siendo desconocido.
En este informe, hemos demostrado que la expresión ETK se aumenta progresivamente durante la progresión del cáncer de vejiga. ETK juega un papel importante en la regulación de la supervivencia, la migración y la invasión de la modulación de múltiples vías de señalización en las células de cáncer de vejiga. Demostramos además que ETK también se encuentra en la mitocondria a través de la interacción directa con Bcl-XL y la regulación de la producción de ROS en respuesta al tratamiento de fármacos quimioterapéuticos. Además, la expresión ETK se correlaciona positivamente el grado del tumor y predice el resultado del paciente. Nuestros datos sugieren que ETK puede servir potencialmente como una diana terapéutica y marcador pronóstico para el cáncer de vejiga.
Resultados
Funcional Etk se sobreexpresa en el cáncer de vejiga
Se examinó la expresión en ETK un panel de líneas celulares de cáncer de vejiga humanos y se encontró que el nivel de expresión ETK se varió en estas células. Curiosamente, se detectó un nivel significativamente más alto de proteína ETK en UM-UC-3 y T24 células que se derivan de alto grado y tumores de vejiga invasivo (Fig. 1A). A continuación, examinó si ETK es funcional en estas células invasoras. En primer lugar, si la prueba de factor de crecimiento podría activar la actividad quinasa ETK usando la fosforilación de la tirosina 40 (Y40), un sitio de autofosforilación por ETK a partir de su activación [8], como de lectura. Como se muestra en la Fig. tratamiento 1B, EGF induce la fosforilación Y40, lo que sugiere que ETK es activa en células de cáncer de vejiga. De acuerdo con estudios anteriores mostraron que ETK está aguas arriba de STAT3 y Akt [15], [16], encontramos el nivel de fosforilación de ambos STAT3 y AKT fue comprometida cuando la expresión ETK fue derribado por una específica shRNA (Fig. 1C, Izquierda ). A la inversa, cuando overexpressed ETK en 5637 células con un nivel relativamente bajo de ETK endógena, hemos detectado un aumento de la actividad tanto de STAT3 y AKT (Fig. 1C, derecha). Estos datos indicaron que juntos ETK es altamente expresado en líneas celulares de cáncer de vejiga invasivo e implicado en la regulación de la actividad de Akt y STAT3.
A, el perfil de expresión de ETK en líneas celulares de cáncer de vejiga. nivel de expresión ETK un total de lisados celulares de líneas celulares de cáncer de vejiga fue examinado por inmunotransferencia con anti-ETK. Tubulina se utilizó como control de carga. B, la activación de ETK en células de cáncer de vejiga tratados con EGF. UM-UC-3 y T24 células fueron suero de hambre durante 24 h, después se trató con 20 ng /ml de EGF durante 15 o 30 minutos. El nivel de EGFR activado y ETK se monitorizó mediante inmunotransferencia con anti-pEGFR (Y1175) y anti-pETK (Y40), respectivamente. El nivel de EGFR total y ETK en los lisados celulares también se detectó con anti-EGFR y anti-ETK respectivamente. C, el Reglamento de STAT3 y la actividad de AKT ETK en células de cáncer de vejiga. UM-UC-3 y T24 células fueron infectadas con lentivirus que codifica el shRNA específico para ETK o un control de vector. A las 24 h después de la infección, las células fueron privadas de suero durante la noche y después se lisaron. El nivel de STAT3 activo y AKT fue examinado por inmunotransferencia con anti-pSTAT3 (Y705) y anti-pAKT (S473), respectivamente (panel izquierdo). El efecto de la sobreexpresión ETK sobre la actividad de AKT y STAT3 se examinó también en el cáncer de vejiga 5637 células (panel derecho).
Etk está presente en las mitocondrias y se asocia con Bcl-XL
Cuando examinamos localización celular de ETK en células de cáncer de vejiga, se observó una distribución de puncate ETK en el citoplasma. Curiosamente, la tinción ETK se solapa parcialmente con el etiquetado Mitotracker en estas células (Fig. 2A). También se detectó una cantidad significativa de proteína ETK en la fracción mitocondrial, junto con otras proteínas mitocondriales conocidos Bcl-XL y VDAC (Fig. 2B). Como ETK carece de una señal de orientación mitocondrias, nos preguntamos si se podía localizar a la mitocondria a través de una interacción proteína-proteína. Como se muestra en la Fig. 2C, endógena Bcl-XL se co-precipita con ETK en ambas líneas celulares de cáncer de vejiga examinados. Resultados similares se obtuvieron también en células 293T que sobreexpresan tanto T7-etiquetados ETK y GFP-etiquetados Bcl-XL. Estos datos sugirieron que ETK puede formar un complejo con Bcl-XL y localizar a las mitocondrias. Debido a la función anti-apoptótica de Bcl-XL, hemos examinado el papel de ETK en la regulación de la apoptosis en estas células. Como se muestra en la Fig. 3A, knock-down de expresión ETK por un shRNA específica aumentó significativamente el número de células apoptóticas en las células UM-UC-3 y T24. Además, la inhibición de la actividad ETK mejorado la producción de ROS y la citotoxicidad en células de cáncer de vejiga en respuesta al tratamiento de Doxorubucin, mientras que la sobreexpresión de ETK tenía efectos protectores (Fig 3B & amp;. 3C). El crecimiento del tumor y la metástasis está regulada en parte por la capacidad de las células tumorales para degradar el tejido matriz circundante y migrar. Para probar si la regulación al alza ETK puede causar un fenotipo tal, se examinaron adicionalmente los efectos de ETK knock-down sobre la migración celular y la invasión del cáncer de vejiga usando los ensayos de cámara de Boyden. Higo. 3D muestra que la migración de las células UM-UC-3 y T24 desmontables-ETK se redujo a 40% y 60% respectivamente, en comparación con el control shRNA células tratadas. Resultados similares se observaron también cuando examinamos su capacidad para invadir a través de Matrigel. Estos datos sugirieron que la inhibición de la expresión ETK en células de cáncer de vejiga en peligro tanto la migración y la invasión.
A, ETK se localiza en las mitocondrias en las células UM-UC-3 y T24. Las células se marcaron con rodamina Mitotracker, seguido por tinción de inmunofluorescencia con anti-ETK. Los núcleos se contratiñeron con DAPI. La localización de ETK se determinó por microscopía confocal. Amarilla muestra colocalización de ETK y Mitotracker. proteína B, ETK se detecta en la fracción mitocondrial. Mitocondrial y las fracciones citosólicas se prepararon como se describe en Métodos. Los extractos fraccionados se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos anti-ETK o indicados para los marcadores de fraccionamiento. ERK fue utilizado como un marcador citosólico, mientras que Bcl-XL y VDAC como marcadores mitocondriales. C, ETK se asocia con Bcl-XL. extractos totales de células a partir de células UM-UC-3 y T24 se inmunoprecipitaron con el control anti-ETK o IgG, seguido de inmunotransferencia con los anticuerpos como (panel izquierdo) se indica. Las células 293T se cotransfectaron con T7-Etk y GFP-Bcl-XL, se realizó la inmunoprecipitación usando anti-T7 (panel central) o anti-GFP (panel derecho), seguido de inmunotransferencia con los anticuerpos como se indica.
a, abajo-regulación de la apoptosis inducida por la expresión ETK en células de cáncer de vejiga. UM-UC-3 y T24 células fueron infectadas con lentivirus que codifica el shRNA específico para ETK para 96 h y la apoptosis se evaluó mediante ensayos de TUNEL. Las células apoptóticas se cuantificaron contando las células TUNEL-positivas a partir de cinco campos independientes aleatorios. B, ETK regula la actividad de ROS y la citotoxicidad en células de cáncer de vejiga en respuesta al tratamiento Doxorubucin (DOX). Las células se infectaron con la codificación lentivirus el shRNA específico para ETK, Etk T7-tagged ETK o un control de vector. A las 48 h después de la infección, las células se trataron con DOX (UM-UC-3, 0,5 g /ml; células T24, 2,5 mg /ml) durante 20 h y después se incubaron con 10 nM 5 (6) -CDCFDA para 30 min. células ROS-positivas fueron contados bajo el microscopio de fluorescencia. Los resultados se expresaron como porcentaje del control. C, ETK regula la citotoxicidad en células de cáncer de vejiga en respuesta al tratamiento DOX. Las células se infectaron como se describe en B y tratado con DOX (T24, 5 mg /ml; UM-UC-3, 0,5 mg /ml) durante 48 h. La viabilidad celular se evaluó mediante ensayos de WST-1 (panel superior). El nivel de expresión ETK se monitorizó mediante inmunotransferencia con anti-ETK (panel inferior). *, P & lt; 0,05 en comparación con el control; **, P & lt; 0,01 en comparación con el control. D, desmontables de ETK inhibe la migración y la invasión in vitro. migración celular y la invasión de ensayo fueron descritos como métodos. Los resultados se expresaron como porcentaje del control. *, P & lt; 0,05 en comparación con el control; **, P. & Lt; 0,01 en comparación con el control
Etk está aumentada en el tejido de cáncer de vejiga humano y predijo la supervivencia del paciente
Para examinar la expresión ETK en los tejidos tumorales de vejiga humana, se realizó análisis de inmunohistoquímica en microarrays de tejidos de la vejiga humana que contienen 619 muestras de tejido de 233 pacientes. ETK tinción parecía ser tanto positiva citoplasmática y nuclear (Fig. 4A), y la expresión ETK se incrementó marcadamente en los tejidos tumorales de vejiga en comparación con sus homólogos benignas (Tabla 1). Además, el nivel de expresión ETK fue significativamente mayor en los tumores T1-T4 invasiva que la de que en no invasivos homólogos Tis /TA (p & lt; 0,001); sin embargo, la expresión ETK no difirió significativamente dentro de T1 a tumores T4 (datos no presentados). Además, la expresión ETK aumentó con el grado del tumor (p & lt; 0,001). ETK expresión en la CEI fue una excepción notable, con una media del 12% en el citoplasma, que es inferior a las puntuaciones G1-G3 (Tabla 1), lo que sugiere una asociación de ETK overepression con tumores papilares de vejiga. Para evaluar si ETK podría ser utilizado como un potencial marcador de pronóstico, se realizó un análisis resultado clínico en 118 pacientes fueron sometidos a cistectomía que fueron seguidos durante una media de 92,3 meses. Se identificó un punto de corte para el 15% subestratificación óptimo de estos pacientes de acuerdo con la expresión citoplasmática ETK. Había 75 tumores (64%) con una baja expresión (≤15%) y 43 tumores (36%) con alta expresión (& gt; 15%). El análisis de Kaplan-Meier indicó que los pacientes que tenían mayor tinción citoplasmática de ETK (puntuación de tinción & gt; 15%) tenían más pobre (p test figura 4B, log-rank = 0,0028.) probabilidad de supervivencia global. Además, el análisis multivariable de regresión de Cox mostró que ETK es un predictor significativo de la supervivencia después de ajustar por otras variables clinicopatológicas importantes como la edad, el grado del tumor, el estadio y estado de los ganglios linfáticos positivos (Tabla 2). Como se indica en el modelo, ETK fue el único predictor pronóstico independiente de la supervivencia general con riesgo relativo de 1,7 (IC del 95%: 1.1 2.7, p = 0,0159). Tomados en conjunto, estos datos mostraron que la expresión ETK se incrementa en el cáncer de vejiga y se asocia con la progresión tumoral y mal pronóstico.
A, Los campos representativos de cáncer de vejiga humano TMA teñidas con anticuerpo anti-ETK. B, el análisis de Kaplan-Meier en la asociación de ETK tinción citoplasmática con la tasa de supervivencia de los pacientes con cistectomía.
Discusión
La sobreexpresión de ETK ha sido reportado en varios tipos de cáncer, incluyendo el de próstata, mama y cánceres de pulmón [8], [13], [17], [18]. Este es el primer informe sobre la desregulación de la expresión ETK en el cáncer de vejiga. expresión ETK elevado frecuentes en las células cancerosas de la vejiga sugirió que ETK puede jugar un papel causal en el desarrollo de la enfermedad y la progresión. Esto fue apoyado por la observación de que la actividad ETK podría ser estimulada por el EGF, que fue demostrado previamente para inducir el crecimiento y mejorar la invasión de las células del cáncer de vejiga mediante la regulación de la actividad de AKT [19], [20]. El receptor de EGF se ha informado altamente expresado en células de cáncer de vejiga y se asocia con la progresión del cáncer y de mal pronóstico en los pacientes [21], [22], [23]. Por lo tanto, puede ETK probable actuar como un efector aguas abajo de EGF /EGFR para promover el crecimiento de tumor de vejiga y la metástasis. Se ha demostrado que la sobreexpresión ETK puede aumentar la proliferación en el epitelio de la próstata del ratón y resultar en el desarrollo de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) en parte por el aumento de la actividad STAT3 [13] AKT y. Se encontró que la baja regulación de ETK en células de cáncer de vejiga actividad STAT3 y AKT atenuadas mientras que la sobreexpresión exógena de ETK tuvo efectos opuestos. La desregulación de STAT3 y PI3K /AKT vías se ha demostrado que desempeñan un papel importante en el desarrollo de carcinoma urotelial y se correlaciona con la progresión del tumor [24], [25]. Es posible que ETK puede ejercer su función en el cáncer de vejiga a través de la regulación de estas vías. metástasis del tumor depende de la capacidad de las células tumorales de invadir tejidos normales. Hemos demostrado que las células del cáncer de vejiga podrían invadir con eficacia una barrera matriz in vitro, y esta capacidad fue despedido notablemente cuando la expresión ETK fue derribado por un shRNA específica. Desmontables ETK conduce a la activación disminuida de STAT3, que desempeña un papel en la invasión del cáncer de vejiga, se explica en parte el posible mecanismo de la inhibición de la invasión. El efecto de ETK en la migración de células podría explicarse basado en el papel establecido de ETK en la migración celular en células de la próstata y cáncer de mama a través de FAK mediada por la señalización de integrina [8].
Además de STAT3 y AKT vías que son conocidos para ser activado por ETK, también demostró, por primera vez, que ETK se localiza en las mitocondrias en las células de cáncer de vejiga y de ese modo regula la producción de ROS y la sensibilidad de drogas. Otras tirosina quinasas, incluyendo Src y EGFR, se ha demostrado que estar presente en las mitocondrias. Salvi
et al
informó que Src se encuentra en las mitocondrias en cerebro de rata [26]. EGFR y Src pueden trasladar a la mitocondria mediante la unión de la subunidad de citocromo mitocondrial coxidase (Coxα) de una manera dependiente de EGF y modular la función mitocondrial a través de la fosforilación de Coxα [27]. Sin embargo, la función exacta de ETK en las mitocondrias aún no se ha establecido. Se encontró que ETK está asociado con un miembro de la familia Bcl-2 Bcl-XL en células de cáncer de vejiga. Desmontables de expresión ETK conduce a un aumento de la producción de ROS y la sensibilización de células Caner vejiga a los fármacos quimioterapéuticos. Se ha demostrado que dañan el ADN, la irradiación y la hipoxia puede inducir ROS en células de cáncer [28], [29]. Anteriormente puso de manifiesto que ETK puede conferir resistencia a fármacos en células de cáncer de próstata mediante la interacción con p53 y la inhibición de su función de transducción nuclear. Es posible que ETK también puede promover la resistencia a los medicamentos a través de su efecto protector sobre la función mitocondrial. Por tanto, nuestros resultados demostraron que ETK proporciona un fenotipo maligno y invasiva para las células de cáncer de vejiga a través de la regulación de múltiples vías de señalización (Fig. 5).
Se ha demostrado que la actividad STAT3 y de expresión está aumentado en el cáncer de vejiga tumor y predice la recurrencia del tumor y la supervivencia de los pacientes [30], [31]. Nuestro análisis IHC en el cáncer de vejiga TMA mostró que la expresión ETK se incrementa en tejidos de cáncer de vejiga en comparación con sus homólogos benignos. Teniendo en cuenta que la expresión dirigida de ETK en la próstata de ratón lleva al desarrollo de PIN [13], es posible que ETK también puede jugar un papel en la transformación oncogénica en células uroteliales de la vejiga. Más importante, la expresión ETK es mayor en invasivo (T1-T4) de los tumores de vejiga no invasivos (TIS /Ta), lo que sugiere que ETK también puede jugar un papel en la invasión tumoral y la metástasis. Esta posibilidad fue apoyada por nuestra observación de que desmontables de expresión ETK en células de cáncer de vejiga inhibir su actividad en
in vitro
ensayos de invasión en. Por otra parte, se encontró que el nivel de expresión ETK también puede predecir la supervivencia de los pacientes con tratamiento cistectomía independiente de otras variables clinicopatológicas importantes como la edad, el grado del tumor, el estadio y estado de los ganglios linfáticos positivos. Por lo tanto, ETK puede servir potencialmente como una nueva diana terapéutica para el tratamiento del cáncer de vejiga, así como un biomarcador que podría ser utilizado para estratificar los pacientes con mayor riesgo de mortalidad. Estos pacientes pueden ser beneficiosos de productos terapéuticos destinados a la actividad ETK.
Materiales y Métodos
Cultivo celular, transfección e infección lentiviral
línea celular de cáncer de vejiga humano T24, 5637, J82, RT-4 y UM-UC-3, así como 293T fueron adquiridos de American Type Culture Collection (ATCC). UM-UC-3, se cultivaron células T24 y 293T en medio de Eagle modificado por Dulbecco. se mantuvieron 5637, J82 y RT-4 células en RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal y 1% (v /v) de penicilina y estreptomicina (100 mg /ml) y se mantuvieron a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera. Las células fueron transfectadas con HD FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals) siguiendo las instrucciones del fabricante. infección Lentivirus se llevó a cabo como anteriormente [9].
inmunoprecipitación y Western Blot
Las células se lisaron en el tampón de lisis (20 mM Tris /HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1 mM EDTA, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, Na 1 mM
3Vo
4, 1 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml de leupeptina, y 1 mM fenilmetil sulfonil-fluoruro). El material insoluble se eliminó por centrifugación, y se añadieron anticuerpos de lisado durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos fueron recolectados a través de G-Sepharose perlas de proteína A o proteína, y complejos de proteínas se lavaron tres veces a 4 ° C con el tampón de lisis. La inmunotransferencia se realizó como se describió anteriormente [9]. Brevemente, las cantidades iguales de la muestra se resolvieron en un gel de poliacrilamida SDS y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Las transferencias se incubaron con los anticuerpos primarios indicados durante la noche a 4 ° C y seguido por la detección con anticuerpo secundario de rábano picante conjugada con peroxidasa. El anticuerpo anti-BMX monoclonal (BD Transduction Laboratories) fue utilizado en 1:2000, mientras que anti-pSTAT3 (Y705), AKT, pAKT (S473), EGFR, pEGFR (Y1175) y pETK (Y40) (Cell Signaling Technology, Danvers , MA) se utilizaron en 1:1,000. Anti-Bcl-XL, anti-tubulina, ERK, VDAC y anti-señal de transductores y activadores de la transcripción 3 (STAT3) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) se utiliza en 1:2,000.
WST -1, de formación de colonias y TUNEL ensayos
las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
3 células /pocillo y se infectaron con el lentivirus que codifica el shRNA ETK o un control de shRNA. En cada punto de tiempo indicado, la viabilidad celular se midió por el ensayo de WST-1 (Roche) siguiendo el protocolo del fabricante. Para el ensayo de formación de colonias, las células (1 × 10
4) se sembraron en placas de 6 pocillos y se infectaron con el lentivirus para el control de shRNA o ETK shRNA. El cultivo celular se mantuvo en medio completo durante 14 días. colonias de células fueron visualizadas por tinción con azul Coomassie. UM-UC-3 y T24 células se infectaron con la codificación lentivirus ETK shRNA o un control para 96 h y las células apoptóticas se detectaron mediante el ensayo TUNEL, siguiendo las instrucciones del fabricante (Roche). Las células apoptóticas se cuantificaron contando las células TUNEL-positivas a partir de cinco campos independientes aleatorios.
ensayos
migración celular y la invasión
La migración celular se evaluó mediante transwell ensayo como se describe anteriormente [8]. En resumen, se recogieron las células infectadas, se resuspendieron en medio libre de suero, y después se transfirió a las cámaras superiores (5 × 10
4 células por pocillo), mientras que las cámaras inferiores que contienen 0,5 ml de medio condicionado de fibroblastos NIH 3T3. Después de 24 h de incubación, las células en la superficie superior se rasparon y se lavaron de distancia, mientras que las células migradas a la superficie inferior se fijaron y tiñeron con 4 ', 6-diamidino- 2-fenilindol (DAPI) durante 5 min y luego se contaron bajo un microscopio de fluorescencia, y el número relativo al control vector se calculó. ensayo de invasión celular se realizó en condiciones de modo similar al anterior, a excepción de los filtros Transwell fueron pre-recubiertas con Matrigel (BD Biosciences) y 1 × 10
Se han usado 5 células por pocillo.
Inmunofluorescencia y microscopía confocal análisis
Las células se marcaron en medio de cultivo fresco con 200 nM Mitotracker (Invitrogen) a 37 ° C durante 30 min, y luego se fijaron con 3,75% de formalina durante 15 minutos seguido de incubación con solución de bloqueo [10% burro suero 0,5% de albúmina de suero bovino, 0,3% de Triton X-100 en PBS] y se trató con anticuerpo ETK durante la noche a 4 ° C. Las inmunorreacciones fueron revelados por incubación de las células con anticuerpo de cabra anti-ratón FITC 488 conjugado con IgG (Jackson Immuno Research) y DAPI (1:5000) durante 5 min. Por último, el cubreobjetos que contiene las células inmunomarcadas se montaron con un medio de montaje (Biomeda gel montar, Microscopía Electrónica de Ciencias) anti-decoloración. Se evaluaron las células usando una inmersión en agua 40X lente objetivo de un microscopio confocal Zeiss 510 equipado con 347-, 488-, y 543-nm rayos láser.
preparación mitocondrial y especies reactivas de oxígeno (ROS) de detección
fracción mitocondrias las mitocondrias se purificó con kit de aislamiento de células cultivadas (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Intracelular de ROS se midió utilizando el colorante 5 (6) -CDCFDA (sondas moleculares). Después de pasar a través de la membrana de plasma, este lipófilo y no-fluorescente compuesto se desesterificar a un alcohol hidrófilo (H2DCF) que puede ser oxidado a fluorescente DCF por un proceso generalmente considerado involucrar con ROS. Las células cultivadas se cargaron con 10 mM 5 (6) -CDCFDA en medio normal a 37 ° C durante 30 min. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con medio y salieron de la última medio de lavado para los estudios de imagen. Proyección de imagen fue tomada por el microscopio de fluorescencia utilizando un microscopio invertido Nikon TE2000s con objetivo de 10x.
microarrays de tejidos, inmunohistoquímica y análisis estadístico
microarrays de tejidos (TMA) se prepararon por el Departamento de Patología de la Universidad de California, Los Angeles (UCLA), Centro Médico como se describe anteriormente [14]. Los investigadores sólo se les proporcionó los datos clínico-patológicos tales como el estadio y grado tumoral. Todos los identificadores de los pacientes se eliminaron de manera que no es posible rastrear cualquier tejido de un paciente particular. Por lo tanto, la confidencialidad del paciente está protegida. Bajo el protocolo aprobado por el comité de IRB en la UCLA, no se requiere el consentimiento del paciente para este estudio. TMA se desparafinaron con xileno y se tiñó como se describe anteriormente [13]. Brevemente, los portaobjetos se rehidrataron y la recuperación de antígeno se logró por microondas durante 15 min en tampón de citrato. Los portaobjetos se incubaron a continuación en peróxido de hidrógeno 0,3% para saciar peroxidasa de rábano picante endógeno (HRP) durante 30 min. Los portaobjetos se preincubaron con suero de cabra normal en PBS (1:20) durante 60 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron después con ETK anticuerpo primario (1:2000) a 4 grados durante la noche. Posteriormente, los portaobjetos se incubaron con IgG anti-conejo marcado con biotina y se incubaron con complejo avidina-biotina peroxidasa preformado. Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron.
Las láminas fueron analizados utilizando el Ariol SL-50 escáner de diapositivas automático (Applied Imaging, San José, California) para cuantificar la cantidad de tinción positiva para cada área de interés. Los umbrales para cada imagen se aplicaron usando el software de análisis Ariol basado en varios parámetros: RGB algoritmo, forma y tamaño. Todos los análisis se realizaron con la secuencia de comandos MultiStain. clasificadores de umbral se personalizan para cada mancha.
Para la evaluación de la tinción nuclear, se calculó la tinción DAB positiva mediante la aplicación de dos umbrales de color con un solo reconociendo fondo azul (hematoxilina manchada) las células y otros que reconocen células positivas de color marrón y azul, no células positivas (número total de células). Las células individuales fueron discriminados mediante la incorporación de los umbrales de forma y tamaño, proporcionando, junto con los umbrales de color, el recuento de células reales. Porcentaje de positividad se determinó dividiendo el número de células detectado por el umbral de marrón por el número total de células, detectada por la suma de los umbrales de color marrón y azul. el área total del tejido analizado también se incluyó en el análisis final (m
2).
Para la evaluación de la tinción citoplasmática, la mancha positiva área se calculó mediante la aplicación de los umbrales de color marrón para detectar píxeles positivos. Porcentaje de positividad se determina dividiendo el área total tinción positiva (m
2) por el área total del tejido analizado (m
2).
La puntuación inmunorreactivas para cada caso se cuantificó por el promedio de cuatro núcleos. Las asociaciones entre la expresión ETK y los parámetros patológicos fueron evaluados con las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis. Diferentes criterios de valoración de supervivencia /recurrencia fueron evaluados para los pacientes que se sometieron a TUR y los pacientes que se sometieron a cistectomía. Las curvas de Kaplan-Meier fueron utilizados para estimar la supervivencia /curvas de tiempo libre de recidiva y se utilizó el test de rangos logarítmicos para probar si las curvas fueron diferentes entre los grupos. La COX modelo de riesgos proporcionales de múltiples se utilizó para evaluar la cual covariables afecta a la supervivencia de tiempo /sin recidivas. Para cada uno de covarianza, se informó de la tasa de riesgo relativo y el asociado
valor de p
. Todos los análisis se realizaron con el software SAS versión 9.2.
Reconocimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Allan J. Pantuck por su asesoramiento en el análisis de datos.