Extracto
Icaritin, un compuesto de
Epimedium Género
, tiene selectivo del receptor estrogénico (ER) modular actividades, y posee actividad anti-tumor. Aquí, hemos examinado el efecto icaritin sobre el crecimiento celular de las células del cáncer de endometrio humano Hec1A y encontramos que icaritin la proliferación de las células inhibió Hec1A. Icaritin inhibido el crecimiento celular se asoció con un aumento de los niveles de p21 y p27 expresión y reduce cyclinD1 y cdk 4 expresión. Icaritin también indujo apoptosis de las células acompañada por la activación de las caspasas como se evidencia por la escisión de poli (ADP-ribosa) polimerasa sustrato endógeno (PARP) y la liberación del citocromo c, que fue abrogada por el pretratamiento con el inhibidor pan-caspasa z-VAD-fmk. Icaritin tratamiento también indujo la expresión de la proteína pro-apoptótica Bax con la consecuente disminución de Bcl-2 y la expresión. Además, icaritin indujo la fosforilación sostenida de la señal extracelular regulada kinase1 /2 (la MAPK /ERK1 /2) en las células Hec1A y U0126, un mapa específico quinasa quinasa (MEK1 /2) inhibidor, bloqueó la activación de ERK1 /2 por icaritin y abolido la inhibición del crecimiento inducida por icaritin y apoptosis. Nuestros resultados demuestran que icaritin indujo sostenida activación de ERK 1/2 y inhibe el crecimiento de células de cáncer de endometrio Hec1A, y proporcionó un racional para la evaluación preclínica y clínica de icaritin para la terapia del cáncer de endometrio
Visto:. Tong JS, Zhang QH , Huang X, Fu XQ, ST Qi, Wang YP, et al. (2011) Icaritin Causas sostenido ERK1 /2 activación e induce la apoptosis en células de cáncer de endometrio humano. PLoS ONE 6 (3): e16781. doi: 10.1371 /journal.pone.0016781
Editor: Syed Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: 8 de Diciembre, 2010; Aceptado 14 de enero de 2011; Publicado: 8 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Tong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación básica del Estado Mayor de China para QY Sun (2011CB94451). Este trabajo también fue apoyado por el NIH subvención a DK070016 Z.Y. Wang y los Premios de tabaco Nebraska Liquidación Programa de Investigación Biomédica (LB-595 y LB692) para Z.Y. Wang. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de endometrio es uno de los tumores malignos de la pelvis femenina más comunes y es el cuarto tipo de cáncer más común en las mujeres de América del Norte detrás de pulmón, de mama, de colon y el cáncer, con 42.160 nuevos casos y 7.780 muertes estimadas para el año 2009 [ ,,,0],1], [2], [3]. Alrededor de 81.500 mujeres se ven afectadas cada año en la Unión Europea y la incidencia va en aumento. La mediana de edad de aparición es de 63 años, mientras que & gt; 90% de las mujeres mayores de 50 años [4]. Aunque los pacientes diagnosticados y tratados para la etapa temprana de la enfermedad de la histología endometrioide disfrutan relativamente buenas tasas de supervivencia, los pacientes con avanzado (estadio III o IV, de acuerdo con el sistema recién revisada por la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia [FIGO]) o recurrente cáncer de endometrio tiene un mal pronóstico [5]. Para aquellas mujeres con enfermedad en estadio temprano, la cirugía con el uso individualizado de volumen dirigido radioterapia es curativa [6]. Para aquellas mujeres con enfermedad en estadio avanzado, no existe un estándar real de la atención y tradicionalmente estas mujeres son tratados con cirugía, quimioterapia y radiación, en una o más combinaciones. En el contexto de enfermedad avanzada o recurrente, particularmente cuando no es susceptible de la resección quirúrgica, el sello distintivo de la terapia ha sido la quimioterapia [7]. Aunque muchos pacientes que inicialmente responden a la quimioterapia, la resistencia y la recaída del tumor eventualmente desarrollan [5]. Por lo tanto, es urgente desarrollar nuevos agentes terapéuticos para tratar eficazmente esta enfermedad mortal.
Icaritin (fig. 1A) es un producto de hidrólisis de icariina de
Epimedium
, una hierba medicinal china tradicional. Icaritin exhibe muchas actividades farmacológicas y biológicas, como la estimulación de neuronal y la diferenciación cardíaca [8], [9], el aumento de osteoblástica y suprime la diferenciación osteoclástica y la actividad [10], la prevención de esteroides asociados osteonecrosis [11], la inhibición de la humana carcinoma de próstata PC-3 de crecimiento de células [12], la inducción de células de músculo liso prostático humano apoptosis a través de ERK1 /2 vía [13], y efectos neuroprotectores [14]. Anteriormente, se informó de que icaritin muestra una actividad similar al estrógeno en las células del receptor de estrógeno positivo de cáncer de mama MCF-7 a concentraciones sub-micromolar [15]. Al intervalo micromolar, sin embargo, icaritin inhibe el crecimiento de células de cáncer de próstata PC-3 [12]. Estos resultados indicaron que icaritin tiene tanto agonistas como antagonistas de actividades en función de las concentraciones y puede funcionar como un modulador del receptor de los estrógenos para regular el crecimiento celular. Sin embargo, no existen informes sobre la actividad de icaritin contra el cáncer de endometrio.
(A) La estructura química de icaritin. (B) Efectos de icaritin en la inhibición del crecimiento de células Hec1A. Las células se mantuvieron en medio libre de fenol rojo con suero fetal tratado con carbón vegetal 2,5% durante 24 h, y después se trataron con la concentración indicada de icaritin. Las células se recogieron a diferentes puntos de tiempo como el potencial indicada y la proliferación se evaluó mediante el ensayo de MTT. Los resultados de ocho experimentos independientes se promediaron y media ± SEM. *,
P
. & Lt; 0,05 en comparación con las células control
proteína activada por mitógeno (MAP) participan en diversas funciones celulares tales como la proliferación celular, la diferenciación celular, la motilidad celular, y la muerte celular [16]. Hay tres principales subgrupos de la familia MAPK: extracelular regulada por señal kinase1 /2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal de la proteína activada por estrés kinases1 /2 (JNK1 /2) y la p38 proteínas quinasas. Las cascadas de señalización que implican JNK y p38, activado por señales extracelulares de estrés, están involucrados en la diferenciación celular y la apoptosis [17], [18]. Estudios previos han demostrado que la activación transitoria de ERK1 /2 juega un papel fundamental en la proliferación celular y que sostenida activación ERK1 /2 induce la detención del ciclo celular y la diferenciación [19], [20]. En el presente estudio, hemos demostrado aquí que la activación de ERK1 /2 vía de señalización media la apoptosis de las células Hec1A icaritin-inducida.
En el presente estudio, se encontró que las células icaritin provocó una Hec1A la apoptosis mediada por la mitocondria y sostenida activación del /vía MAPK ERK1 /2. Nuestros resultados sugieren que icaritin podría ser útil como un agente contra el cáncer en la terapia del cáncer de endometrio.
Resultados
Icaritin inhibe el crecimiento de células de cáncer de endometrio Hec1A
icaritin Anteriormente, se informó el crecimiento inhibió de células de cáncer de próstata PC-3, las células del cáncer de mama y células de hepatoma HepG2 [12], [15], [21]. Decidimos examinar el efecto de icaritin en el crecimiento de las células Hec1A endometriales. Las células se trataron con varias concentraciones de icaritin durante 12 h, 24 h, y 48 h, y el crecimiento celular se midió con el ensayo de MTT. Se encontró que hubo una reducción dependiente de la dosis y dependiente del tiempo del crecimiento de las células tratadas con Hec1A icaritin (Fig. 1B), lo que indica que icaritin inhibe la proliferación de las células Hec1A.
Para investigar el mecanismo subyacente icaritin detención del ciclo celular inducida, se examinaron los principales reguladores de fase G1, tales como la ciclina D1 /CDK4 como inhibidores de quinasas dependientes de ciclina WAF1 /p21 y KIP1 /p27. Como se muestra en la Fig. 2A, icaritin tratamiento dio lugar a una marcada disminución de los niveles de expresión de ciclina D1 y CDK4 y aumento de WAF1 /p21 y la expresión KIP1 /p27 en comparación con las células tratadas con vehículo (Fig. 2B). Estos datos indicaron que icaritin fue capaz de inducir la detención del ciclo celular y para regular efectores relacionados con el ciclo.
células (A) Hec1A se trataron con la concentración indicada de icaritin para 24 h. Los niveles de ciclina D1 y CDK4 se determinaron por transferencia de western. Los niveles de proteína de β-actina también se midieron como controles. las células (B) Hec1A se trataron con la concentración indicada de icaritin para 24 h. Los niveles de p21 y p27 se determinaron por transferencia de western. Los niveles de proteína de β-actina también se midieron como controles.
Icaritin induce la apoptosis de células Hec1A
siguiente prueba si también icaritin induce la muerte celular por apoptosis en células de cáncer de endometrio Hec1A humanos. las células se trataron con Hec1A icaritin y la apoptosis se ensayó por dos métodos diferentes. Como se muestra en la Fig. 3A, el número de células TUNEL positivas aumentó con el aumento de concentraciones de icaritin. fragmentación nucleosoma, un indicador de apoptosis, determinada con la célula de detección de la muerte ELISA confirmó además que icaritin inducida por apoptosis de las células a una dosis y de manera dependiente del tiempo (Fig. 3B). Además, una anexina V-tinción también demostró que icaritin indujo la muerte celular apoptótica, pero no la necrosis en las células Hec1A (Fig. 3C).
(A) Visualización de células apoptóticas por el ensayo TUNEL en las células Hec1A. fragmentación (B) de ADN se evaluó utilizando un kit ELISA de detección de muerte celular. Los datos se expresan como media ± SEM de tres experimentos separados. *,
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& lt; 0,05 en comparación con las células control. (C) El estado de apoptosis se determinó por el método de tinción con anexina V /PI. Porcentajes de negativo células (viables), células de anexina V-positivos (temprano de apoptosis), células PI-positivo (necróticas), o anexina V y PI-doble positivas se demostró que las células (a finales de la apoptosis) (media de tres experimentos independientes) por una análisis de citometría de flujo.
de la dosis y los efectos dependientes del tiempo de icaritin en la activación proteolítica de la caspasa-3 y caspasa-9 también se examinaron. Como se muestra en la Fig. 4A, el tratamiento icaritin resultó en un aumento significativo en la forma activa de la caspasa-3 y caspasa-9 en células Hec1A. La activación de las caspasas en las células tratadas icaritin Hec1A se confirmó adicionalmente mediante la detección de la escisión de PARP, un sustrato endógeno de la caspasa-3 activada y una característica de la apoptosis. Como se muestra en la Fig. 4B, el tratamiento de células con Hec1A icaritin dio lugar a la escisión de PARP a un fragmento de 85 kDa. Además, se analizó la localización subcelular de citocromo c para determinar si la vía de las mitocondrias está implicado en la apoptosis inducida por icaritin. Inmunofluorescencia de citocromo c se visualizó con un microscopio láser confocal. Después las células se trataron con 10 icaritin mu M durante 24 h, el patrón de tinción de citocromo c se convirtió en difusa y borrosa (Fig. 4C) en contraste con el aspecto compacto, la placa-como de citocromo c en las células de control tratadas con vehículo, indicando la liberación de citocromo c de la mitocondria en el citosol de las células tratadas con icaritin
.
células (a) Hec1A se trataron con los indicados icaritin concentración o los puntos de tiempo indicados, los extractos celulares totales se prepararon y se sometieron a transferencia de Western ensayo para medir los niveles de escindido con la caspasa-3 y escindido con la caspasa-9. Los niveles de proteína de β-actina también se midieron como controles. las células (B) Hec1A fueron tratados con el indicado icaritin concentración o los puntos de tiempo indicados, los extractos celulares totales se prepararon y se sometieron a ensayo de transferencia de Western usando anticuerpos contra PARP. Los niveles de proteína de β-actina también se midieron como controles. las células (C) Hec1A se fijaron y se marcaron durante citocromo c (rojo) y DNA (azul). (D) células Hec1A se pretrataron con 10 M de z-VAD-fmk durante 1 h, seguido con 10 icaritin mu M durante 24 h, y se determinaron la fragmentación del ADN y la actividad de la caspasa-3. Los datos se expresan como media ± SEM de tres experimentos separados. *,
P
& lt; 0,05 en comparación con las células control. las células (E) Hec1A se trataron previamente con 10 mM de z-VAD-fmk durante 1 h, seguido con 10 icaritin mu M durante 24 h. Los extractos de proteína se prepararon y se sometieron a ensayo de transferencia de Western usando anticuerpo contra PARP. Los niveles de proteína de β-actina también se midieron como controles.
A fin de determinar el papel de la activación de caspasas en la apoptosis inducida por icaritin, se trataron células Hec1A con el inhibidor pan-caspasa z-VAD-fmk (10 mM) antes del tratamiento icaritin. El inhibidor de pan-caspasa z-VAD-fmk pretratamiento abolió la actividad de caspasa-3 y la reducción de la apoptosis inducida por icaritin como se mide por la fragmentación nucleosoma en células Hec1A (Fig 4D & amp;. E). Estos resultados sugieren fuertemente que la activación de la cascada de caspasa era esencial para la apoptosis inducida por icaritin en células Hec1A.
Icaritin regula la expresión de Bcl-2 la familia de proteínas en las células Hec1A
El anti-apoptótica Bcl-2 es un potente antagonista de la ruta mitocondrial de la apoptosis iniciada por una variedad de tensiones extra e intracelulares. Decidimos probar los efectos de icaritin en la expresión de la proteína anti-apoptótica de las proteínas pro-apoptóticas Bcl-2 y Bax en las células Hec1A con el análisis de transferencia de Western. Como se muestra en la Fig. 5, icaritin aumento en los niveles de expresión de Bax, mientras que reduce Bcl-2 expresión en la dosis y de forma dependiente del tiempo, lo que indica que icaritin también regula los niveles de expresión de las proteínas de la familia Bcl-2 para facilitar la muerte celular apoptótica inducida por icaritin.
células (a) Hec1A se trataron con la concentración indicada de icaritin, extractos celulares totales se prepararon y se sometieron a ensayo de transferencia de Western para medir los niveles de Bcl-2 y Bax. Los niveles de proteína de β-actina también se midieron como controles. las células (B) Hec1A se trataron con los puntos de tiempo indicados icaritin de icaritin, extractos celulares totales se prepararon y se sometieron a ensayo de transferencia de Western para medir los niveles de Bcl-2 y Bax. Los niveles de proteína de β-actina también se midieron como controles.
Icaritin induce sostenido ERK1 /2 activación en las células Hec1A
tensiones celulares y los estímulos inducir apoptosis de las células a través de la activación sostenida de la MAPK vías de señalización [22], [23]. por tanto, hemos examinado la activación de las MAPK ERK1 /2, JNK y p38 después del tratamiento icaritin. Como se muestra en la Fig. 6A, los niveles de fosforilación de ERK1 /2 se incrementaron después del tratamiento icaritin, que duran veinticuatro horas. Sin embargo, no se observaron cambios significativos de expresión y fosforilación de los niveles de p38 y JNK después del tratamiento icaritin (Fig 6B & amp;. C). Estos resultados sugieren que la activación sostenida de la MAPK /ERK está implicado en la inhibición del crecimiento inducida por icaritin y la apoptosis en células HecA1.
células Hec1A fueron tratados con el indicado icaritin concentración o el intervalo indicado, se prepararon extractos celulares totales y se sometieron a ensayo de transferencia de Western para medir los niveles de las formas fosforiladas de ERK1 /2 (a), JNK (B) y p38 (C). Las membranas se volvieron a sondar con anticuerpos contra el total de ERK1 /2, JNK y p38 para la normalización.
La vía de señalización ERK1 /2 está implicado en la apoptosis inducida por icaritin en Hec1A
que examinó si la activación sostenida icaritin inducida de la vía de señalización ERK1 /2 juega un papel en la inhibición del crecimiento y la apoptosis. Como se muestra en la Fig. 7A & amp; B, icaritin inducida por apoptosis de las células fue abrogada eficazmente por U0126, un potente inhibidor de MEK1 /2, pero el inhibidor de p38 SB203580 y JNK SP600125 inhibidor no tuvo ningún efecto, lo que sugiere que la activación de ERK1 /2 señalización está implicada la apoptosis icaritin inducida. Del mismo modo, ERK1 /2 inhibición por su inhibidor específico podría antagonizar eficazmente la actividad icaritin inducida por la caspasa-3 (Fig. 7C). Además, ensayo de transferencia Western reveló que U0126 inhibió sostenido ERK1 /2 activación y escisión de PARP en icaritin tratada (Fig. 7D), mientras que el inhibidor de caspasa z-VAD-fmk no tuvo ningún efecto sobre la activación de icaritin inducida de ERK1 /2 (Fig . 7E). Estos resultados demostraron que los efectos pro-apoptóticos de icaritin en células Hec1A están mediados por la activación sostenida de la vía ERK1 /2 señalización
.
células (A) Hec1A fueron tratados con icaritin en presencia o ausencia de 10 M U0126, 10 SP600125 mu M, o 40 mu M SB203580 durante 24 h, el crecimiento celular se determinó mediante MTT. Las barras representan la media ± SEM de tres experimentos separados. *,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el grupo tratado con icaritin. las células (B) Hec1A fueron tratados con icaritin en presencia o ausencia de 10 mM U0126, 10 mM SP600125, o 40 mu M SB203580 durante 24 h, y se determinó la fragmentación del ADN. Los datos se expresan como media ± SEM de tres experimentos separados. *,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con las células tratadas con icaritin a. (C) células Hec1A fueron tratados con icaritin en presencia o ausencia de 10 mM U0126, 10 mM SP600125, o 40 mu M SB203580 durante 24 h, y la actividad de la caspasa-3 se determinó mediante el ensayo de la caspasa-Glo. Los datos se expresan como media ± SEM de tres experimentos separados. *,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con las células tratadas con icaritin a. las células (D) Hec1A se pretrataron o no tratados previamente con 10 mM U0126 entonces añadido con DMSO (vehículo) o 10 icaritin mu M durante 12 h, 24 h, respectivamente. Los extractos de proteína se prepararon y se sometieron a ensayo de transferencia de Western para medir los niveles de ERK1 fosforilados /2. Los niveles de proteína de ERK1 /2 también se midieron como controles. las células (E) Hec1A se pretrataron o no tratados previamente con 10 mM U0126 entonces añadido con DMSO (vehículo) o 10 icaritin mu M durante 12 h, 24 h, respectivamente. Los extractos de proteína se prepararon y la escisión de PARP se analizó con el perno Western. Los niveles de proteína de β-actina también se midieron como controles. Las células (F) Hec1A se trataron previamente con o sin z-VAD-fmk (10 M) se incubaron adicionalmente con icaritin 10 M durante 24 h. Los extractos de proteína se prepararon y se sometieron a ensayo de transferencia de Western para medir los niveles de ERK1 fosforilados /2. Los niveles de proteína de ERK1 /2 también se midieron como controles.
Discusión
A continuación, hemos demostrado que icaritin, un compuesto purificado de hierba medicinal Epimedium, induce una inhibición del crecimiento y la muerte celular por apoptosis en las células del cáncer de endometrio humano Hec1A a una dosis y tiempo dependiente
.
está bien establecido que la progresión del ciclo celular es dinámicamente y estrictamente regulada por complejos que contienen ciclinas y cdk todos los cuales son críticos para la progresión normal de la célula ciclo y la inactivación de estas proteínas conduce a la detención del ciclo celular [24], [25], [26]. Los efectos inhibidores observados de icaritin en la expresión de ciclina D1 y CDK4 en células Hec1A sugirieron que icaritin puede detener el ciclo celular en una fase específica. la actividad CDK también está regulada por los inhibidores de CDK como WAF1 /p21 y familias KIP1 /p27 de proteínas. Aquí, también mostró que icaritin indujo los niveles de expresión del WAF1 /p21 y KIP1 /p27.
En muchos tipos de células, la apoptosis se caracteriza por la generación de fragmentos de ADN mediante la acción de endonucleasas endógenas [27] , [28]. El ADN de las células apoptóticas se escinde en multímeros de 180-200 bp fragmentos, correspondiente al tamaño oligonucleosomal. Por lo tanto, el ADN de las células apoptóticas típicamente migra como una escalera de 180-200 multímeros pb en un gel de agarosa. El método Terminal deoxynucleotidy transferasa biotina-dUTP Nick End Labeling (TUNEL) identifica células apoptóticas in situ mediante el uso de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) para transferir biotina-dUTP a estas roturas de la cadena de ADN escindido [29]. La determinación ensayo ELISA de los fragmentos citoplasmáticos histonas asociadas de ADN (mono- y oligonucleosomas) después de la muerte celular inducida [30]. Anexina V se utiliza para determinar cuantitativamente el porcentaje de células dentro de una población que están experimentando activamente apoptosis. Se basa en la propiedad de las células a perder la asimetría de la membrana en las fases tempranas de la apoptosis. En las células apoptóticas, la fosfatidilserina de fosfolípidos de membrana (PS) se transloca desde la cara interna de la membrana plasmática a la cara externa, exponiendo así PS con el medio ambiente externo. Anexina V es una proteína de unión a fosfolípidos dependiente de calcio que tiene una alta afinidad por el PS, y es útil para la identificación de células apoptóticas con PS expuesto. Yoduro de propidio (PI) es una sonda estándar de la viabilidad de citometría de flujo y se utiliza para distinguir viable a partir de células no viables. Las células viables con membranas intactas excluyen PI, mientras que las membranas de células muertas y dañadas son permeables a los PI. Las células que se consideran viables son anexina V y PI negativo; células que están en apoptosis temprana son anexina V positivo y PI negativo; células que están en apoptosis tardía son ambos anexina V y PI positivo; y las células que se encuentran en necrótico son anexina V negativo y negativo PI [31]. El método de tinción de anexina V /PI distingue las células de la apoptosis y células de necrosis. En el presente estudio, las células se trataron con Hec1A icaritin y la apoptosis se ensayó mediante el uso de ensayo de TUNEL y ELISA. Además, un ensayo de unión de anexina V-mostró que icaritin tratamiento inducida por apoptosis, pero no la necrosis en las células Hec1A.
Las mitocondrias juegan un papel central en la transducción de la señal de la apoptosis [32]. La observación de la activación icaritin mediada por la caspasa-9, caspasa-3, posterior escisión de PARP y la liberación de citocromo c, así como el resultado de que el inhibidor pan-caspasa z-VED-FMK casi completamente bloqueado apoptosis icaritin-inducida en Hec1A células, lo que sugiere que la vía de la cascada de caspasas mediada mitocondrial juega un papel muy importante en la apoptosis inducida por icaritin [33].
Bcl-2 de proteínas, incluyendo miembros de la familia relacionados con Bcl-2 y Bcl-2 tales como Bcl-xL, Bad y Bax, juega un papel importante en la regulación de la apoptosis. Ellos pueden activar o inhibir la liberación de factores de aguas abajo, tales como el citocromo c, que conduce a la activación de la caspasa-3 y PARP en la ejecución de la apoptosis [34]. Bax ejerce actividad pro-apoptótica por la translocación desde el citosol a las mitocondrias, donde se induce la liberación de citocromo c, mientras que Bcl-2 ejerce su actividad anti-apoptótica, al menos en parte, mediante la inhibición de la translocación de Bax a la mitocondria [35] . Obviamente, la relación de la expresión de proteínas pro-y anti-apoptóticos, tales como Bax /Bcl-2, es crítico para la inducción de la apoptosis, y que decida que la susceptibilidad de las células a experimentar apoptosis [36]. En el presente estudio, se demostró que el tratamiento de las células con Hec1A icaritin dio lugar a disminución significativa en la proteína Bcl-2 y el aumento de la proteína Bax, cambiando así la relación de Bax /Bcl-2 en favor de la apoptosis. En conjunto, nuestros resultados indicaron que icaritin regula los niveles de expresión de la familia Bcl-2, induce la liberación de citocromo c y caspasa TRIGS dependiente de la muerte apoptótica de células.
La familia de MAPKs, ERK, SAPK /JNK1 /2 y p38, juega un papel central en la proliferación celular, la diferenciación, la supervivencia y la apoptosis, incluyendo extracelular regulada kinase1 /2 [37], [38]. En, ERK1 transitoria general /2 de activación se produce rápidamente y la disminución con 30 a 45 min, que se considera a conducir a la proliferación celular y la supervivencia [39], pero ERK1 2 activación /persistente o sostenida que duran más de 12 h está involucrado en la celda la diferenciación y la muerte [40], [41], [42], [43]. El doble actividad de ERK1 /2 tanto en la proliferación celular y la muerte celular pueden ser explicadas por varios hallazgos recientes que demuestran que ERK fosforiladas pueden producir resultados diferentes, dependiendo de la duración de la acumulación de ERK en el núcleo [44], [45]. Recientemente, se ha informado de que la activación de ERK sostenido estaba involucrado en la apoptosis inducida por calcio de células epiteliales del cristalino [46]. Varios estudios han demostrado que icaritin induce la activación de la quinasa ERK y p38 en las células madre embrionarias y las células neuronales [8], [14]. Chen et al. informó de que icaritin induce la inhibición del crecimiento y la apoptosis de células de cáncer de próstata humano PC-3 a través de la vía ERK1 /2 señalización [13]. Aquí también encontramos que icaritin inducida por la activación sostenida de la ERK1 /2, pero no JNK y p38 en células Hec1A. U0126, un inhibidor específico de MEK (la MAPK /ERK quinasa), efectivamente bloqueado icaritin inducida ERK1 /2 activación y atenuada apoptosis icaritin inducida, lo que sugiere que la activación sostenida de la vía de señalización ERK1 /2 es uno de los mecanismos.
en conclusión, hemos encontrado que icaritin inhibe el crecimiento celular y la apoptosis celular inducida en las células Hec1A. También estudiamos los mecanismos subyacentes implicados en la apoptosis inducida por icaritin. Nuestros resultados indican que la inhibición del crecimiento de células inducida por icaritin implica la reducción de la ciclina D1 y expresión de la proteína CDK4 y inducciones de p21 y p27 expresión de la proteína. Nuestros resultados también demostraron que la apoptosis inducida por icaritin implica la activación de la caspasa-3 y caspasa-9 y la liberación de citocromo c. Se encontró que se requería sostenido ERK1 /2 activación de la apoptosis inducida por icaritin. Nuestros resultados proporcionan un racional que icaritin podrían desarrollarse como un agente anticancerígeno potencial contra el cáncer de endometrio humano.
Materiales y Métodos
Materiales y Reactivos
Icaritin con una pureza de hasta y el 99,5% era del Dr. Kun Meng (shenogen Pharma Co Beijing, china). Una solución madre (10 mM) se preparó disolviendo icaritin en DMSO (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) y almacenados a -20 ° C. MTT, DAPI, U0126, SP600125, SB203580, y el inhibidor pan-caspasa (z-VAD-fmk) se adquirieron de Calbiochem (San Diego, CA). Anticuerpo para la caspasa-3 escindido se adquirió de Cell Signaling (Beverly, MA). Los anticuerpos contra ERK1 /2, fosfo-ERK1 /2, p38, fosfo-p38, JNK, fosfo-JNK, p21, p27, el citocromo c, Bcl-2, Bax, se escindió de la caspasa-9, ciclina D1, cdk4, PARP y β -actina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Kit FITC Anexina V de detección de apoptosis que se adquirió de Becton Dickinson (PharMingen).
células de cultivo y ensayo de proliferación celular
La línea celular de cáncer de endometrio humano Hec1A se obtuvo del Dr. Li-Wei Hui (Pekín hospital Popular de la Universidad, Pekín) y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco-BRL, EE.UU.) medio con 10% de suero de ternera fetal (Hyclone, UT), 5 ug /ml de insulina, y se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada atmósfera de 5% de CO
2. Medios de comunicación se pueden cambiar en medio libre de fenol rojo con suero de ternera fetal despojado de carbón vegetal 2,5% para 24 h antes de los experimentos necesarios.
Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una concentración final de 1 × 10
4 células /pocillo y se incubaron en medio DMEM que contiene 10% de FCS durante 24 h. Luego, las células se cultivaron en DMEM con fenol-libre de rojo (Gibcol-BRL, EE.UU.) con suero de ternera fetal tratado con carbón vegetal 2,5% (Biochrom AG, Alemania), seguido por el tratamiento con diferentes concentraciones de icaritin durante 12 h, 24 h, y 48 marido. Se retiró el medio y se añadió medio fresco a cada pocillo junto con 20 l de solución de MTT (5 mg /ml). Después de 4 h de incubación, se añadieron 150 ml de DMSO a cada pocillo. Las placas se leyeron a la longitud de onda de 490 nm utilizando un lector de microplacas (Bioteck Powerwave
TM, EE.UU.). Ocho reduplicate pozos se utilizaron para cada tratamiento, y los experimentos se repitieron tres veces.
Análisis de Western Blot
Western blot se realizó como se describe anteriormente [47], [48]. Las células fueron tratadas con la concentración indicada de icaritin durante el tiempo indicado en fenol-libre de rojo DMEM (Gibcol-BRL, EE.UU.) con despojado carbón vegetal 2,5% de suero de ternera fetal (Biochrom AG, Alemania). Las células se recogieron en PBS enfriado en hielo, y los extractos celulares se prepararon en tampón RIPA con cóctel inhibidor de proteinasa de Sigma (St.Louis, MO). Las concentraciones de proteína de los lisados celulares se determinaron y se hirvieron con tampón de carga de gel durante 10 min a 100 ° C. Las muestras que contienen 30 mg de proteína total se sometieron a electroforesis en 10% geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore, Temecula, CA). Después de la transferencia, la membrana se bloquearon en TBST (TBS que contiene 0,1% de Tween 20) que contiene 5% de leche desnatada durante 2 h, seguido de incubación durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios apropiados. Después de lavar tres veces en TBST, las membranas se incubaron durante 1 h a 37 ° C con 1:2000 rábano picante anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa. Por último, las membranas se visualizaron usando el sistema de detección de quimioluminiscencia (Amersham, Piscataway, NJ).
TUNEL ensayo
Potencial fragmentación del ADN se examinó con la tinción de fluorescencia por el TUNEL (Terminal transferasa dUTP Nick Etiquetado End) kit de detección de apoptosis (Beyotime Biotech, china) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células cultivadas en coverlips de vidrio estériles se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min, y luego se permeabilizaron con 0,4% Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron con una mezcla de reacción que contiene biotina-dUTP y la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) para 60 min y luego con la solución de avidina-FITC durante 30 min en la oscuridad. DAPI se añadió posteriormente para la tinción nuclear. El análisis microscópico se realizó con un microscopio confocal láser de barrido (Zeiss LSM 710 META, Alemania).
Detección de Apoptosis por ligado a enzima Cell Death Método de ensayo inmunoabsorbente
Para ELISA, las células sembradas en placas de 96 pocillos (1 x 10
4 células /pocillo) fueron tratados con icaritin, a continuación, se evaluaron las células apoptóticas mediante el uso de la célula de ELISA de detección de muerte kit (Roche Diagnostics, Mannhein, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó un inmunoensayo enzimático fotométrico para determinar cuantitativamente la formación de fragmentos de ADN de las histonas asociadas citoplasmáticos en forma de mononucleosomes después de la apoptosis de las células. La absorbancia a 405 nm se midió como indicador de las células apoptóticas. La longitud de onda de referencia fue 490 nm. El factor de enriquecimiento (cantidad total de apoptosis) se calculó dividiendo la absorbancia de la muestra (A405 nm) de la absorbancia de los controles sin tratamiento (nm A490).
ensayos de Anexina V /PI para apoptosis
para los ensayos de PI Anexina V /, las células se tiñeron con Anexina V-FITC y PI, y se evaluaron para la apoptosis por citometría de flujo de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD PharMingen, San Diego, CA, EE.UU.). Brevemente, 1 × 10
6 células se lavaron dos veces con PBS, y se tiñeron con 5 l de anexina V-FITC y 10 l de PI (5 mg /ml) en 1 ml de tampón de unión durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuro. Las células apoptóticas se determinaron utilizando un cytoflurometer Becton-Dickinson FACScan (Mansfield, MA, EE.UU.).
inmunofluorescencia tinción
La tinción de inmunofluorescencia se utilizó para analizar la distribución subcelular de citocromo c en las células inducida Hec1A por Icaritin. Las células cultivadas en coverlips de vidrio estériles se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min. Después de permeabilizaron con 0,4% Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente, las células fueron bloqueadas en 4% BSA-PBS suplementado durante 1 h y se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo anti-citocromo c. Después de lavar tres veces en PBS, las células se marcaron con anticuerpo secundario conjugado con TRITC. DAPI se añadió posteriormente para la tinción nuclear. El análisis microscópico se realizó con un microscopio confocal láser de barrido (Zeiss LSM 710 META, Alemania).
Medición de la caspasa-3 actividad
Las células se trataron con icaritin en ausencia y en presencia de diferentes inhibidores de quinasa, y la actividad de la caspasa-3 en los lisados despejadas se midieron mediante el uso de la caspasa-3 Ensayo de actividad de Kit (Beyotime Biotech, china) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La luminiscencia se cuantificó usando un lector de ELISA. Los valores del blanco se restaron y los aumentos de caspasa 3-actividades se expresaron como veces de incremento y se calculan sobre la base de las actividades medidas a partir de las células no tratadas.