Extracto
El legumain cisteína proteasa participa en varios procesos biológicos y patológicos, y la proteasa se ha encontrado sobreexpresada y asociado con un fenotipo invasivo y metastásico en un número de tumores sólidos. En consecuencia, legumain se ha propuesto como un marcador pronóstico de ciertos tipos de cáncer, y una diana terapéutica potencial. Sin embargo, los detalles sobre cómo avanza la progresión maligna legumain junto con la regulación de su actividad proteolítica no están claros. En el presente trabajo, la expresión legumain fue examinada en líneas celulares de cáncer colorrectal. diferencias sustanciales en cantidades de formas legumain pro y activos, además de los patrones de distribución distintos intracelulares, se observaron en las células HCT116 y SW620 y xenoinjertos subcutáneos correspondiente. Legumain se cree que está situado y procesada hacia su forma activa principalmente en las endo-lisosomas; Sin embargo, la distribución subcelular sigue siendo en gran parte inexplorado. Mediante el análisis de las fracciones subcelulares, se encontró una forma proteolíticamente activa de legumain en el núcleo de las dos líneas celulares, además de la canónica residencia endo-lisosomal.
In situ
análisis de la expresión y la actividad legumain confirmó la endo-lisosomal y localizaciones nucleares en células cultivadas y, sobre todo, también en secciones de xenoinjertos y biopsias de pacientes con cáncer colorrectal. En las líneas celulares HCT116 y SW620 se encontró legumain nuclear para compensar aproximadamente el 13% y el 17% de la legumain total, respectivamente. En similitud con los estudios anteriores sobre las variantes nucleares de cisteína proteasas relacionadas, legumain fue mostrado para procesar H3.1 histonas. El descubrimiento de legumain localizada en el núcleo lanza un completamente nuevo campo de la biología y funciones en el cáncer legumain
Visto:. Haugen MH, Johansen HT, Pettersen SJ, Solberg R, K Brix, Flatmark K, et al. (2013) Nuclear Legumain actividad en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (1): e52980. doi: 10.1371 /journal.pone.0052980
Editor: Mateo Bogyo, Universidad de Stanford, Estados Unidos de América
Recibido: Junio 7, 2012; Aceptado 22 de noviembre de 2012; Publicado: 10 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Haugen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido generosamente apoyada por subvenciones de las autoridades regionales del sudeste de salud [HSO,#2011142], www.helse-sorost.no; El Consejo de Investigación de Noruega en el marco del Programa de Genómica Funcional [FUGE,#158954 /S10], www.forskningsradet.no/fuge; Søren y el legado Jeanette Bothners y la Sociedad de Cáncer de Noruega [# PR-2006-0272], www.kreftforeningen.no; La Universidad de Oslo; Anders Jahres fundación para la Promoción de la Ciencia; Astrid y Fundación Birger Torsteds; y la Fundación Nansen. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Legumain, o AEP (asparaginil endopeptidasa), pertenece a la familia C13 de cisteína proteasas en el CD clan de acuerdo con la Base MEROPS peptidasa [1]. Fue descubierto por primera vez en los granos [2] y la platija de sangre (
Schistosoma mansoni
) [3] antes de que Chen y colaboradores describieron la versión de mamíferos en 1997 [4]. La proteasa de mamífero es claramente homóloga con legumain a partir de especies no mamíferas y la conservación a lo largo del linaje evolutivo presumiblemente indica importancia funcional. El pro-enzima humana de 433 aminoácidos se somete a varias divisiones sucesivas tanto N- y C-terminales, de los cuales algunos requieren pH ácido, antes de llegar a la forma activa de la enzima madura. El proceso de maduración es parcialmente autocatalítico, pero depende también de otras enzimas proteolíticas que, junto con la comprensión completa del proceso de activación, no se han caracterizado completamente [5] - [7]. La proteasa activa muestra preferencia altamente específico para la hidrólisis del sustrato C-terminal a la asparagina y en cierta medida después de ácido aspártico en condiciones más ácidas. Los inhibidores endógenos más potentes de legumain son cistatina E /M y la cistatina C [8], [9], mientras que el inhibidor químico clásico de cisteína proteasas, el compuesto E64, no afecta a la actividad legumain [4].
Hay varios informes de legumain siendo sobre-expresa en una serie de tumores sólidos (por ejemplo, colorrectal y cáncer de mama), y esto también se ha correlacionado con un fenotipo más invasivo y metastásico [10] - [12]. Recientemente, hemos examinado un panel de líneas celulares de melanoma y se encontró que se expresó legumain y activo en la mayoría de las líneas celulares de investigación [13]. En los tejidos normales, legumain se expresa lo más prominente en la placenta, riñón y bazo [10]. Legumain ratones knock-out nacen sanos y fértiles, pero muestran la reducción del peso corporal, aberrantes endo-lisosomas con el desarrollo de la insuficiencia renal y la hematopoyesis extramedular en el bazo [14] - [16].
Recientemente se ha demostrado que legumain puede estar involucrado en la proliferación celular independiente de la actividad endopeptidasa [17]. Además, legumain se ha demostrado para activar proMMP-2, lo que puede explicar en parte la asociación observada entre la expresión legumain y potencial metastásico [18]. La estricta especificidad de sustrato combinado con un exceso de expresión en varios tipos de tumores ha motivado explotación de legumain como un activador de pro-fármaco en el tratamiento del cáncer, por ejemplo mediante la adición de una cadena escindible péptido a la doxorubicina o auristatina [10], [19] y la orientación de compuestos de fármacos utilizando un inhibidor de la enzima legumain [20]. Otras funciones biológicas conocidas de legumain incluyen el procesamiento de la autofagia-lisosomal de las proteínas hepatocelular [21], el procesamiento de antígenos para la presentación de MHC de clase II [22], y la maduración de Toll-like receptor de señalización [23].
En este estudio, la expresión y la actividad proteolítica legumain se examinaron en dos líneas celulares de carcinoma colorrectal (CCR), HCT116 y SW620. diferencias notables en la actividad fueron identificados inicialmente y que utilizan más estas líneas celulares para examinar la distribución legumain y la actividad a niveles subcelulares. De gran interés y bastante inesperada, proteolítica nuclear legumain activo fue revelado en ambas líneas celulares, además de la localización de endo-lisosomal esperado. Estos resultados fueron confirmados además por inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y
In situ
mediciones de la actividad en las células cultivadas y xenoinjertos, y también documentaron en el tejido tumoral humano CRC. Por último, se mostró legumain para escindir proteolíticamente la histona H3.1
in vitro
descubrimiento de una implicación potencial funcional de la actividad legumain localizada en el núcleo.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares, xenoinjertos y biopsias CRC
RKO, CO205, SW48, Colo320DM, HT29, SW620 y HCT116 fueron comprados de la American Type Culture Collection (ATCC). KM20L2 y HCC2998 (DCTD Tumor /Repositorio de la línea celular) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Michael R. Boyd (Instituto Nacional del Cáncer, Frederick, MD, EE.UU.), así como LS174T [24] y [25] TC7 líneas celulares de Dr. Richard Hamelin (INSERM, París, Francia). identidad de la línea celular fue validado por análisis de repetición en tándem corto para el HCT116 y SW620 líneas celulares. Las células se cultivaron en RPMI 1640 (Bio Whittaker) que contenía suero bovino fetal al 10% (Hyclone), Hepes 20 mM (Biowittaker) y Glutamax 2 mM (Invitrogen). Todas las líneas celulares fueron probados rutinariamente negativo para
Mycoplasma
. xenoinjertos subcutáneos de HCT116 y SW620 se establecieron mediante la inyección de 1 * 10
6 células en ambos flancos de la hembra de raza localmente (nu /nu) ratones BALB /c desnudos [26]. Vivienda y todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Hospital Universitario de Oslo, en cumplimiento de las directrices de la Autoridad de Investigación de Animales de Noruega sobre el bienestar animal. biopsias humanas se obtuvieron de los pacientes durante la cirugía primaria de CRC asumido o verificada. El estudio fue aprobado por el Comité Regional de Ética del sur de Noruega (# S-98080) y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de los pacientes.
Los lisados celulares, medios de recolección acondicionado y enriquecimiento subcelular
Para obtener lisados celulares para inmunotransferencia, los cultivos sub-confluentes se separaron usando EDTA (Biowittaker) y se lavaron 3 veces en PBS enfriado con hielo (Biowittaker) antes de tampón de lisis frío (NaCl 150 mM, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% NP-40 se añadió) con la mezcla de inhibidor de la proteasa CompleteMini (Roche Diagnostics) para secar los sedimentos celulares y se dejó en hielo durante 15 min. Finalmente, las muestras se sometieron a ultrasonidos y se centrifugaron a 15.000 × g durante 15 min para eliminar los restos celulares. En muestras para mediciones de la actividad de un tampón de lisis (citrato de sodio 100 mM, 1 mM EDTA disódico, 1% de n-octil-beta-D-glucopiranósido, pH 5,8) se utilizó sin inhibidores de proteasa. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el kit BCA (ácido bicinconínico) de ensayo de proteínas (Pierce) o ensayo de Bradford [27]. Todas las muestras se almacenaron a -80 ° C. medio celular acondicionado fue adquirida por la siembra de 7,5 * 10
5 células en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche en medio que contiene suero, luego se lavaron y se cultivaron durante otras 24 horas en 1 ml de medio libre de suero. El medio condicionado libre de suero se centrifugó a 15.000 × g durante 5 min y el sobrenadante se recogió. Las proteínas del medio acondicionado se concentraron por adición de 4 volúmenes de acetona enfriada con hielo, dejando las muestras en hielo durante 15 min y centrifugación a 4 ° C y 12.000 × g durante 10 min. Líquido se eliminó y el aire precipitado se secó a temperatura ambiente antes de volver a disolver en tampones para las mediciones de inmunotransferencia o de actividad, de acuerdo con los protocolos siguientes. enriquecimiento subcelular de los lisosomas y los núcleos se realizó por centrifugación en gradiente de densidad de acuerdo con Brix
et al.
[28] con la separación de las fracciones repitió dos veces para asegurar una alta pureza. tampones de lisis se ajustaron a pH 5,0 y 7,4 para lisosomal y las fracciones nucleares, respectivamente. Todos los demás enriquecimiento subcelular se realizó por triplicado utilizando el kit de Proteína Fraccionamiento subcelular de células cultivadas (Thermo Scientific) en 5 * 10
6 células HCT116 y 10 * 10
6 SW620 células para obtener volúmenes iguales de gránulos de las células como el inicio material de acuerdo con el protocolo de los fabricantes, y con la adición de lavar el pellet entre todas las fracciones para garantizar una alta pureza.
inmunotransferencia y ELISA
muestras se corrieron en geles NuPAGE al 4-12% ( Invitrogen) a 150 V y temperatura ambiente utilizando el MES-tampón suministrado (que contiene SDS) según el protocolo del fabricante, y luego se transfirieron a 0,45 micras de fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore Corp.) en la cerradura de células Sure-X ( Invitrogen) a 4 ° C durante una hora en 20% de metanol que contenía tampón Tris-glicina. La calidad de la transferencia de la proteína se verificó utilizando Amidoblack para geles 1D. Las membranas se bloquearon posteriormente durante una hora a temperatura ambiente en leche seca TBST-buffer 5% (Tris-solución salina tamponada con Tween 20) y se sondaron con anticuerpo primario en la leche seca TBST-buffer 5% durante una hora a temperatura ambiente en la siguiente concentraciones: anticuerpo policlonal de cabra legumain (pAB) (1:1000; R & amp; D Systems; AF2199), la catepsina L pAb de cabra (1:500; R & amp; D Systems; AF952), catepsina B pAb de conejo (1:10000; Calbiochem; 219.408), la cistatina E /M pAb de cabra (1:500; R & amp; D Systems; AF1286), anticuerpo monoclonal de ratón α-tubulina (mAB) (1:5000; Calbiochem; CP06), arilsulfatasa B (BSRA) mAb de ratón (1 :500, R & amp; D Systems; MAB4415), proteína de la membrana lisosomal-asociado (2-lámpara) mAb de ratón (1:250, Santa Cruz, sc-18822), proteína especificidad 1 (SP1) de conejo pAb (1:10000, Millipore , 07-645), y mAb de conejo histona H3 (1:10000, Millipore, 05-928). A continuación, las membranas se lavaron 3 veces en tampón sin la leche en polvo, probaron con HRP-secundaria (peroxidasa de rábano picante) anticuerpo (1:5000; DakoCytomatation) específico contra las especies correspondiente durante una hora a temperatura ambiente, y posteriormente se lavaron 3 veces. Desarrollo se realizó utilizando SuperSignal West Dura ampliada Duración Substrato (Pierce) según las instrucciones del fabricante, visualizado en películas de rayos X médicos (Kodak, o Thermo Scientific) y convirtió a TIFF utilizando un escáner de película de superficie plana (Canon). Para densitometría análisis de la película fue escaneada en un densitómetro calibrado GS-800 (Bio-Rad) y se cuantificó mediante QuantityOne v.4.6.5 (Bio-Rad). Todas las cantidades medidas se normalizaron mediante el control de carga correspondiente (α-tubulina). mediciones de ELISA de legumain total de humano (R & amp; D Systems, DY4769) de tres aislamientos de proteínas separadas se realizaron por duplicado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante
Mutación análisis
ADN de la HCT116 líneas celulares. y SW620 se aisló usando el kit de ADN QIAamp Blood Mini (Qiagen).
LGMN
(ENSG00000100600) exón 12 (ENSE00000808693) se generó posteriormente por PCR utilizando adelante específico (5'-agaggctggacttggggtat-3 ') e inverso (3-5'-gcttccgttacatggaggac') cebadores. Las reacciones de secuenciación se realizaron utilizando los mismos cebadores y el kit de secuenciación del ciclo Dyenamic ET Dye Terminator (Amersham) como se describe por el proveedor. Las muestras fueron finalmente sometidos a publicar limpieza, se separó por electroforesis capilar y se analizaron usando un instrumento de secuenciación MegaBACE1000 (Amersham).
actividad Legumain, inmunofluorescencia e inmunohistoquímica
Legumain actividad en lisados celulares y subcelulares fracciones se midió por triplicado mediante la escisión del sustrato Z-Ala-Ala-Asn-NHMec (Departamento de Bioquímica, Universidad de Cambridge, Reino Unido) como se describe anteriormente [4], [29]. En breve, se añadió lisado de células (20 l) a negro microplacas de 96 pocillos (Nº 3915; Costar, Corning). Después de la adición de 100 l de tampón y 50 solución de sustrato l (concentración final 10 mM) a pH 5,8 o 7,4, una medición cinética basado en aumento de la fluorescencia durante 10 min se realizó a 30 ° C en un lector de placas (Wallac Victor 3 , PerkinElmer) y se presentan como unidades de enzima en donde una unidad de actividad se definió como la cantidad de enzima liberadora de 1,0 mol de producto /min en las condiciones estándar descritas. La inmunofluorescencia se realizó en células cultivadas en portaobjetos de vidrio esterilizados en placas de 6 pocillos posteriormente fijadas en 4% PFA y permeabilizadas con 0,2% Triton-X100 antes de la tinción con anticuerpo primario legumain (1:100) y un anticuerpo secundario conjugado con Alexa488 (Invitrogen, 1:200, a-11034) en tampón que contenía 0,1% de BSA. portaobjetos de control se prepararon sin adición de anticuerpo primario. Los núcleos se tiñeron con DRAQ5 ™ (Biostatus) y cubreobjetos montados en Mowiol en 200 mM Tris-HCl, pH 8,5 (Hoechst) antes de la observación en LSM510 de escaneo láser confocal sistema de imagen o LSM710 (Carl Zeiss). aritmética de imagen se realizaron según Jedeszko
et al.
[30] utilizando la imagen J [31]. El análisis de legumain localizada en el núcleo se realizó en 5 z-pilas cada una compuesta de 25-35 y 30-40 secciones células que contienen cada uno capturados sin píxeles saturados.
En la actividad in situ en Red de legumain células y secciones de tejidos de xenoinjertos se midió mediante la escisión del sustrato Suc-Ala-Ala-Asn-NHNapOME (Departamento de Bioquímica, Universidad de Cambridge, Reino Unido) como se describe anteriormente y se verifica en el tejido de ratones legumain knock-out [32], [33] utilizando concentraciones finales de 1 mM 5-nitro-salicilaldehído, sustrato 0,5 mM y se suministra con DAPI (Invitrogen) para visualizar los núcleos. Las células montadas en OCT Compuesto (Tissue-Tek) y xenoinjertos se cortaron en secciones de criostato (6 M) y se incubaron con solución de ensayo 50 l durante 10-15 minutos a 37 ° C antes de la observación por medio de escaneo láser confocal LSM710 sistema de imagen o LSM510, respectivamente, y usando el módulo de co-localización de software Zen 2009 para pseudo-colorante (blanco). portaobjetos de control se prepararon usando tampón sin sustrato, el inhibidor de epoxi E64 (Sigma) a una concentración final de 1 M o humano cistatina recombinante E /M (amp I +; D Systems, 1286-PI) a una concentración final de 0,1 mM. La tinción inmunohistoquímica se realizó en secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina de xenoinjertos por vía subcutánea crecido y biopsias CRC humanos, utilizando el anticuerpo a una dilución legumain 1:300 con el método de estreptavidina-biotina-peroxidasa tal como se describe anteriormente [34]. Cabra-IgG tinciones de control de isotipo se realizaron a concentración similar en secciones de tejido tumoral de xenoinjertos y CRC
La escisión proteolítica de la histona H3.1
legumain recombinante humana (I + amp;. D systems, 2199-CY ) era auto-activado a 37 ° C durante 2 h en tampón de ácido (mM NaOAc 50, NaCl 100 mM, pH 4,0) a una concentración de 0,1 g /l. legumain bovina se aisló de riñón como se describe por Yamane
et al.
[35]. Se añadió humana H3.1 histona recombinante (New England BioLabs, M2503S) a tampón de ensayo 50 l (MES 50 mM, NaCl 250 mM, pH 5,0 o pH 7,0) con o sin la cistatina E /M y con adición final de cualquiera humana activa o legumain bovina. Cada mezcla se incubó a 37 ° C durante 2 horas con agitación.
Resultados
Legumain y catepsina L se expresan de forma heterogénea en líneas celulares de CRC
Los lisados de un panel de CRC líneas celulares se sometieron a separación por PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Al sondear sucesiva con anticuerpos policlonales, la cantidad total y diversas formas maduras de legumain (panel superior, Fig. 1 y Fig. S2A) y la catepsina L (panel central, Fig. 1 y el panel inferior, Fig. S2A) se visualizaron. Legumain parece estar presente en dos formas masa molecular de aproximadamente 56 y 36 kDa (flechas). Las líneas celulares de CRC muestran una amplia gama en la cantidad total de legumain, y también en cantidades relativas de los pro-forma putativa de 56 kDa y la forma madura activa de 36 kDa, que ambos eran sensibles a la regulación a la baja por una específica legumain siRNA (Fig. S1). Recombinante humana pro-legumain (rhLeg, 5 ng) se utilizó como control. Catepsina L estaba presente en la mayoría de las líneas celulares, aunque se observaron los niveles más altos en la RKO, TC7 y HCT116. En los dos últimos, que albergan grandes cantidades de legumain madura, la catepsina L banda más dominante correspondió a la cadena pesada de 25 kDa de la forma activa de dos cadenas (flecha). Por el contrario, la línea celular RKO mostró alta expresión simultánea de inactiva (30 kDa, de cadena sencilla) catepsina L y un menor nivel de legumain activo, lo que sugiere que estas proteasas de cisteína se someten a la activación mutua en líneas celulares de cáncer colorrectal.
las inmunotransferencias de lisados celulares a partir de un panel de líneas celulares de CRC demostrado una alta variabilidad en la cantidad total de legumain y catepsina L, y también en la presencia de las diferentes formas maduras. Las células HCT116 y SW620 fueron particularmente interesantes ya que muestran una alta cantidad mutuamente excluyentes del activo (36 kDa) y pro-forma inactiva (56 kDa) de legumain, respectivamente. inmunotransferencias sin cortar (Fig. S2A).
La líneas celulares HCT116 y SW620 muestran actividad legumain divergentes
células HCT116 muestran predominantemente la forma madura de 36 kDa de legumain, mientras que SW620 también mostró sustancial cantidades de la pro-forma de 56 kDa (figura 1 y TL;. la Fig. 2B) [6]. Los lisados de estas dos líneas celulares se analizaron adicionalmente por su capacidad para escindir un sustrato específico legumain. Estas mediciones de la actividad revelaron una correspondencia constante entre la intensidad observada de la banda de 36 kDa y la actividad legumain en lisados totales (TL; Fig. 3B). Además, las células HCT116 y SW620 tratadas con un siRNA específico para legumain demostraron una disminución del 70-90% en la actividad legumain (datos no mostrados). Tener evidencia establecida para las diferencias en la cantidad de legumain activo en HCT116 y SW620 que era de interés para determinar si esto podría ser atribuido a mutaciones en Asn323 situados en el exón 12, que ha sido reivindicado necesaria para la escisión de la pro-enzima en el activo forma [5], [6], [36]. Sin embargo, la secuenciación no mostró mutaciones en el
secuencia de nucleótidos LGMN
correspondiente al sitio de reconocimiento de escisión en estas líneas celulares (datos no mostrados), y por lo tanto no podría explicar la diferencia observada en la actividad de la proteasa. Además, la cistatina E /M se ha demostrado que el inhibidor endógeno más potente de legumain y la expresión de esta proteína por lo tanto, se investigó. Curiosamente, los niveles celulares y secretadas de cistatina E /M se encontró que eran muy diferentes entre las dos líneas celulares. En HCT116, dos formas (14 y 17 kDa) de la cistatina E /M se encontraron en medio condicionado (CM; Fig. 2B), con una cantidad más modesta y principalmente la forma 14 kDa en el lisado celular total (TL). Por el contrario, SW620 no expresó ninguna cantidades detectables de cistatina E /M ni secretada ni intracelular.
(A) inmunotransferencias de legumain en lisosomal (L) y las fracciones nucleares (N) enriquecidas a partir de células HCT116 y SW620 utilizando gradiente de densidad centrifugación. Todos los carriles se cargaron con 15 mg de proteína total de cada fracción. controles de pureza de las fracciones subcelulares fueron evaluados por tinción para BSRA (proteína lisosómica soluble) y SP1 (factor de transcripción nuclear). (B) inmunotransferencias de legumain (paneles superiores), la cistatina E /M (segundo paneles) y catepsina L (tercer panel) en compartimentos subcelulares enriquecidas aisladas a partir de células HCT116 y SW620 utilizando un kit comercial: citosol (C), membranas /lisosomas ( M /L), soluble nuclear (NS), la cromatina nuclear con destino (NC), lisado total (TL) y medio condicionado (CM). Todos los carriles se cargaron con 15 g de proteína total de cada fracción, excepto medios acondicionados donde se cargó proteínas precipitadas a partir de 1 ml. controles de pureza de las diferentes fracciones subcelulares fueron evaluados por la tinción de α-tubulina (proteína citosólica), BSRA (proteína lisosómica soluble), lámpara-2 (proteína asociada a la membrana lisosoma), SP1 (factor de transcripción nuclear) y la histona H3 (cromatina nuclear unido a proteínas). inmunotransferencias sin cortar de legumain y catepsina L (Fig. S2C).
(A) La actividad proteolítica de legumain determinado por escisión de sustrato (Z-Ala-Ala-Asn-NHMec) con respecto al contenido total de proteínas cada compartimiento subcelular de HCT116 (barras punteadas) y SW620 (barras a cuadros) células después de centrifugaciones de gradiente de densidad. Lisosomal y fracciones nucleares se prepararon y analizaron a pH 5,8 y 7,4, respectivamente, lo que demuestra la actividad proteolítica de legumain tanto en lisosomal y fracciones nucleares de las dos líneas celulares en ambas condiciones de pH, aunque más alta en el compartimento lisosomal ensayó a pH 5,8. (B) La actividad proteolítica de legumain medida a pH 5,8 en fracciones subcelulares preparados por un kit comercial se encontró que era más alta de las fracciones M /L, pero también estaba claramente presente en las fracciones de NS y se observó sólo con actividad menor en las fracciones C de ambas líneas celulares. legumain extracelular no demostró ninguna actividad en cualquiera de las líneas de células (datos no presentados). (C) Total de legumain cantidades (a favor y en forma activa) medidos por ELISA en las fracciones subcelulares (aislado utilizando un kit comercial) y relativa calculada para el contenido total de proteína en cada fracción también fueron más altas en las fracciones M /L, sin embargo, claramente presente en la fracción NS.
legumain activa está localizada a la endo-lisosomal y compartimentos nucleares
legumain se considera generalmente como una proteína específica de y residente en endo-lisosomas, y tiene también se ha informado para ejecutar importantes funciones celulares dentro de este compartimiento especializada [22], mientras que su distribución y características en otros compartimentos subcelulares no ha sido dilucidado. Para investigar más este hemos utilizado dos métodos para aislar y enriquecer las proteínas de los compartimientos subcelulares, un ser basado en la centrifugación en gradiente de densidad en un tampón de sacarosa y el otro es un kit de aislamiento de subcelular disponible comercialmente. Para examinar la distribución de legumain, inmunotransferencia se realizó en 15 g de lisado de proteína total de cada fracción subcelular enriquecido, además de lisado total de células y los correspondientes acondicionado medio de crecimiento (Fig. 2). Esto también habilita para el control de la pureza de las fracciones usando diversas proteínas de distribución limitada presunta, que muestra un alto enriquecimiento de cada compartimiento y casi sin contaminación cruzada detectable (Fig. 2, marcadores específica para el compartimento se muestran a continuación las líneas negras). En ambos métodos de enriquecimiento subcelulares el 36 kDa legumain activo estaba presente en cantidades sustanciales en la lisosomal (L) y la membrana /lisosomal (M /L) fracciones, así como en la nuclear (N) y las fracciones solubles nucleares (NS), tanto ambas líneas celulares. Se percibió más que HCT116 general en comparación con las células SW620 contenía un nivel más bajo de la pro-forma 56 kDa en todas las fracciones subcelulares, lo que confirma las observaciones realizadas a partir de lisados de células totales (Fig. 1 y 2), mientras que el prolegumain 56 kDa fue también observado en las fracciones nucleares en ambas líneas celulares. células HCT116 también muestran cantidades más pequeñas de 36 kDa legumain en el citosólica (C) y la cromatina nuclear con destino (NC) fracciones (Fig. 2B y Fig. S2C, izquierdo paneles medios). Se encontró que la pro-forma 56 kDa de legumain a ser secretada y se detecta en medios acondicionados (CM; Fig. 2B), pero sólo de HCT116. De particular interés fue la clara presencia de la 36 kDa legumain activa en las fracciones nucleares de las dos líneas celulares, además de la presencia anticipada en las fracciones lisosomales. Además, el enriquecimiento subcelular se realizó con un segundo kit de aislamiento de subcelular disponible comercialmente (Qiagen), que demuestra también la localización nuclear de 36 kDa madura legumain (Fig. S2B). En cuanto a la expresada endógenamente cistatina inhibidor de E /M, sólo pequeñas cantidades de la forma 14 kDa se observó tanto en la M /L y la fracción de NS de HCT116. Finalmente, la distribución subcelular de la catepsina L también se evaluó y se encontró que esta proteasa a ser mucho menos prominente en SW620 comparación con las células HCT116 (Fig. 2B y Fig. S2C, paneles inferiores), como también era aparente en lisados de células totales (Fig. 1 y 2B). En HCT116 el presunto 25 kDa forma de dos cadenas activo de la catepsina L [37] estaba claramente presente en el M /L y las fracciones NS, así como en TL y CM, pero también en cierta medida en las fracciones C y NC. Aunque está presente de forma activa en el CM, esta fracción también mostró la pro-forma de la catepsina L visto por una fuerte banda de aproximadamente 38 kDa. La forma de una sola cadena de catepsina L de 30 kDa era principalmente presente en los M /L y NS fracciones de ambas líneas celulares. En SW620, se observaron bandas más débiles de la catepsina L sólo en el M /L y las fracciones NS, así como en TL, y también con una débil presencia de la pro-forma en la CM.
Las diversas fracciones subcelulares de células HCT116 y SW620 se analizaron posteriormente por su capacidad para escindir proteolíticamente un legumain específica sustrato de péptido respecto a la cantidad total de proteínas presentes en cada fracción medido. En lisosomal y fracciones nucleares separadas por gradientes de densidad de sacarosa, se midió la actividad tanto a pH 5,8 y 7,4, respectivamente, para imitar las condiciones fisiológicas (Fig. 3A). En conjunción con los estudios anteriores, las fracciones lisosomales demostraron una alta actividad proteolítica legumain, pero más imprevistos las fracciones nucleares de ambas líneas celulares medidos a pH neutro también mostraron una considerable actividad legumain. En las fracciones subcelulares aislado utilizando el kit comercial, la actividad proteolítica de legumain medida a pH 5,8 fue también más alto en el M /L (Fig. 3B) fracción, sin embargo, en correspondencia con los resultados anteriores, se encontró que la actividad legumain sustancial en las fracciones nucleares de ambas líneas celulares, en particular las fracciones solubles (NS). Además, la expresión legumain en las fracciones subcelulares obtenidas utilizando el kit comercial se evaluó mediante ELISA sándwich capaz de detectar legumain total (es decir, ambas formas pro y activo) (Fig. 3C). En todas las fracciones se observaron cantidades detectables de legumain (en relación con el contenido total de proteína en cada fracción), mientras que se observaron los niveles más altos en el M /L y fracciones NS, como también se observa en las inmunotransferencias (Fig. 2B). Un resultado inesperado fue la cantidad y la actividad de legumain en las fracciones subcelulares de 10 * 10
6 SW620 células que se midieron para ser aproximadamente dos veces tan alto como en las fracciones hechas de 5 * 10
6 células HCT116, aunque todos carriles se cargaron con 15 mg de proteína. Sin embargo, en los lisados totales de toda la cantidad de legumain (pro-y-forma madura) fue casi igual, sin embargo, las células HCT116 tenía mayor actividad legumain general en el total de los lisados de células que corresponde a la cantidad observada de legumain activo en las inmunotransferencias (Fig. 2B).
In situ
distribución de la expresión legumain
Para examinar la expresión legumain
In situ
, las células HCT116 y SW620 se cultivaron en portaobjetos de vidrio, immunofluorescently manchado y se visualizaron mediante microscopía confocal (Fig. 4A-4D y Fig. S3 A-S3 B). Legumain se distribuye principalmente en la región perinuclear, posiblemente, lo que sugiere la localización mayormente a la
trans
red -Golgi (TGN) y endo-lisosomas, y lo más claramente visible en las células HCT116 (Fig. 4A), mientras que en el células SW620 vesículas aparecieron más distribuida (Fig. 4C) que contiene legumain. Tanto HCT116 y SW620 también muestran legumain situado en los núcleos de las células. Al visualizar sólo el legumain localizada nuclear en los tres planos ortogonales de las células, se observó legumain para distribuir alrededor de las estructuras esféricas, posiblemente nucleolos, dentro de los núcleos (Fig. 4B y 4D). El uso de la aritmética de imagen en rodajas ópticos a partir de cinco z-pilas independientes, cada uno con 30-40 células immunofluorescently marcados, el porcentaje medio de legumain intracelular localizado en el núcleo de una célula se estimó en 12,8% en HCT116 y 16,5% en SW620 (Fig. 5). Un análisis adicional de las dos líneas de células cultivadas como xenoinjertos subcutáneos en ratones reveló resultados comparables a etiquetado de inmunofluorescencia cuando se tiñen inmunohistoquímicamente para legumain (Fig. 4E y 4F, y la Fig. S3C-S3F), con HCT116 que muestra tinción intensa granulado mientras que SW620 demostró una gran parte patrón de tinción más difusa. Además, en xenoinjertos de ambas líneas celulares legumain exhiben expresión heterogénea, con áreas intensamente teñidas, posiblemente tejido necrótico. localización nuclear era más visible en las células con expresión legumain alta en general, pero las manchas de tinción legumain también se detectaron en el interior de los núcleos de las células teñidas más débiles (flechas amarillas). El análisis inmunohistoquímico de parafina tejido tumoral de pacientes con CRC, también reveló la expresión heterogénea de legumain que era evidente tanto en las células tumorales y las células estromales circundantes (Fig. 4G y la Fig. S3G).