Extracto
La heterogeneidad de las células tumorales y su alteración durante el curso de la enfermedad urge la necesidad de caracterización en tiempo real de las células tumorales individuales para mejorar la evaluación de las opciones de tratamiento. Las nuevas generaciones de terapias se asocian frecuentemente con alteraciones genéticas específicas que impulsan la necesidad de determinar la composición genética de las células tumorales. A continuación, presentamos un dispositivo de microfluidos para toda sola célula de amplificación del genoma paralelo (pscWGA) para obtener suficientes copias de un solo genoma de la célula para investigar la presencia de los objetivos del tratamiento y la frecuencia de su ocurrencia entre las células tumorales. Las células individuales fueron capturados primera y se cargan en ocho unidades de amplificación paralelas. A continuación, las células se lisaron en un chip y su ADN amplificados mediante la introducción sucesiva de reactivos dedicados mientras se mezcla de forma activa con la ayuda de los botones válvulas integradas. Se obtuvo el volumen de la cámara de reacción para scWGA 23.85 nl, ya partir de 6-7 pg de ADN contenida en una sola celda, alrededor de 8 ng de ADN después de la WGA, que representa más de la amplificación de 1.000 veces. Los productos amplificados a partir de células de cáncer de mama individuales se recogieron desde el dispositivo a cualquiera de investigar directamente la amplificación de genes específicos por qPCR o para la re-amplificación del ADN para obtener suficiente material para la secuenciación de todo el genoma. Nuestro dispositivo pscWGA proporciona suficiente ADN a partir de células individuales para su caracterización genética y, sin duda, permitir la preparación de muestras automatizado para sola célula cancerosa caracterización genómica
Visto:. Yang Y, Swennenhuis JF, Rho SA, Le Gac S, Terstappen LWMM (2014) paralelo Cancer Cell todo único de amplificación del genoma Utilización del botón de la válvula-Assisted de mezcla en nanolitros Cámaras. PLoS ONE 9 (9): e107958. doi: 10.1371 /journal.pone.0107958
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 30 de abril de 2014; Aceptado: August 16, 2014; Publicado: 18 Septiembre 2014
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Financiación:. Este estudio está financiado por NanoNextNL, un consorcio de micro y nanotecnología del Gobierno de los Países Bajos y 130 socios. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este estudio está financiado por NanoNextNL, un consorcio de micro y nanotecnología de empresas, universidades, institutos de conocimiento y centros médicos universitarios. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Para la caracterización de los tumores, la expresión de proteínas o genes específicos se suele realizar como presente o ausente, por ejemplo, ER + o ER-, HER2 + o HER, y EGFR mutación presente o ausente. Esta determinación tiene consecuencias importantes para las decisiones terapéuticas inmediatas y de someter a los pacientes a las terapias específicas. Por ejemplo, los pacientes cuyas células cancerosas tienen una amplificación del gen ErbB2 (HER2) tienen más probabilidades de beneficiarse de Her2 dirigir fármacos como el trastuzumab. [1] Por desgracia, los tumores son mucho más complejos: los niveles de expresión pueden variar ampliamente dentro de un tumor y están sujetas a cambios durante el curso de la enfermedad. [2] - [4] Por ejemplo, las mutaciones somáticas pueden estar presentes sólo en un pequeño subconjunto de las células tumorales del tumor [5] y se pueden volver resistentes a la terapia asociada con alteraciones genéticas. Para demostrar la presencia y extensión de esta heterogeneidad en el análisis de las células tumorales a nivel de células individuales que se requiere para no perderse esta importante información [5] - [7].
Para investigar el genoma de una sola célula en una manera extensa y fiable, todo el genoma se debe amplificar la vez que mantiene la representación original de los genes para llevar a cabo análisis de aguas abajo tales como la secuenciación de todo el genoma [6] - [8], matriz comparativo del genoma de hibridación (aCGH) [9], [10] , o PCR en tiempo real cuantitativa (RT-qPCR) [11], [12]. En este momento todas estas técnicas requieren decenas de nano-gramos a unos pocos microgramos de material de todo el genoma. amplificación del desplazamiento múltiple de phi 29 de la polimerasa es un enfoque atractivo para la amplificación de todo el genoma sola célula en condiciones isotérmicas. [13] amplificación de ADN usando la enzima phi29 tiene la ventaja de que puede producir cadenas de ADN de largo (& gt; 10 kb) en grandes cantidades (hasta 1~2 g) en un tiempo relativamente corto (2 horas). [14] - [16] Sin embargo, el extremadamente baja concentración de ADN encontrado en un solo genoma de la célula en el todavía gran volumen de la mezcla de WGA (20-50 l) a menudo da lugar a la amplificación y amplificación sesgos no específicos. [17] - [19] Además, la clasificación y manipulación de células individuales para realizar el análisis de células individuales puede ser muy difícil y cada manipulación puede dar lugar a la pérdida de material. células activadas por fluorescencia (FACS) [8], [20], micromanipulación [10], [11], la captura microdissection láser (LCM) [9], [21] y la matriz de DEP [22], [23] han sido todos aplicada para el aislamiento de células individuales, pero el procesamiento de las células para obtener ADN para el análisis de aguas abajo (por ejemplo, la lisis, el aislamiento de ácido nucleico y la amplificación) no ha o no puede ser integrado. Por otro lado, la microfluídica y estructuras microfabricados permiten la manipulación de células individuales al ser acoplada fácilmente a una sola etapa de análisis celular. [24] - [26] Además, la microfluídica presenta una clave-ventaja para WGA, ya que las reacciones tienen lugar en un volumen mucho más pequeños que cuando se utiliza el pipeteado y microtubos (pico-litros frente a los micro-litros) tradicional. Esta ventaja ha sido especialmente destacado por WGA de las células bacterianas individuales utilizando volúmenes de reacción de 60 nl resultantes en un fondo más bajo y una mayor cobertura con menos sesgo de amplificación [27].
En los dispositivos de microfluidos, la mezcla se produce de forma natural por difusión pasiva . Especialmente la difusión de las moléculas grandes tales como phi29 polimerasa lleva más tiempo que las moléculas más pequeñas y limita la velocidad fiable y reacción en los dispositivos de microfluidos. mezclador rotatorio se ha utilizado para acelerar este proceso de mezcla en dispositivos de microfluidos. [28], [29] Sin embargo, el tamaño total de estas estructuras limita el número de reactores en paralelo que se pueden colocar en un dispositivo y la mezcla de muestra debe ser transportado a otro reactor para el siguiente paso del análisis. Además, el área de superficie de un reactor es mucho más grande, lo que puede aumentar los problemas de pérdida de muestra debido a que se pega a las paredes del canal. Alternativamente, las estructuras de las válvulas se pueden implementar en un reactor continuo de mezcla activa de los reactivos.
A continuación, se introduce un dispositivo de microfluidos para WGA unicelular paralelo. Para la demostración de un dispositivo con 8 cámaras de reacción paralelas fue diseñado y probado para cargar ocho células tumorales individuales que se lisaron posteriormente bajo condiciones alcalinas, seguido de la etapa de neutralización y WGA. ADN de las células individuales fueron amplificados utilizando la polimerasa Phi29 en la cámara de PDMS confinado para el análisis de aguas abajo fuera del chip. válvula asistida botón mezclador logra WGA de las células tumorales individuales con un volumen de reactivo de ~ 20 nl en comparación con 20 l en reacciones de WGA tradicionales.
E.coli
ADN se utilizó primero como un sistema modelo para adaptar WGA usando phi29 polimerasa, seguido por las células individuales a partir de líneas celulares de cáncer de mama para tumor scWGA. Calidad del chip de ADN amplificado se evaluó mediante qPCR focalización 10 genes diferentes.
Métodos experimentales
fabricación de chips y dispositivos Preparación
Los dispositivos de microfluidos fueron fabricados por varias capas suave técnica de la litografía. [30], [31] En primer lugar, los diseños de máscaras se prepararon por el software CleWin (software WieWeb, Hengelo, NL) y se imprime en un vaso de limón "soda 5 por un generador de máscara LBPG Heidelberg DWL200 (Heidelberg Instrumentos Mikrotechnik GmbH). El maestro moldes se fabrican por una técnica fotolitográfica a base de resina fotosensible. fotorresistente positiva (AZ 40 XT, MicroChem Corp.) se aplicó por rotación sobre una oblea de 4 "de silicio, y se modela usando fotolitografía. Para las operaciones fiables de las microválvulas, la forma de sección transversal de los microcanales en los principales canales fluídicos se completó calentando el molde a 140 ° C durante un minuto después del desarrollo. La capa de fluido superior se produjo mediante el vertido de PDMS sin curar (GE RTV 615, de elastómero: reticulantes = 05:01) sobre el molde para conseguir un espesor de 7 ± 0,5 mm. La capa de control de fondo se hizo por PDMS sin curar el recubrimiento de spin-(elastómero: reticulante = 20:01) en el molde maestro a 2500 rpm durante 1 min. El espesor resultante de la capa de control fue de 25 ± 2 m. Las capas de fluidos y de control se curaron durante 45 min y 30 min, respectivamente, a 80 ° C. La capa de fluido se despegó del molde y los agujeros para las entradas y salidas se golpeó con un puñetazo de calibre 25 (Syneo Co., Angleton, TX, EE.UU.). Posteriormente, la capa de fluido se alineó sobre la capa de control utilizando las marcas de alineación de las capas de ambos bajo un estereomicroscopio y las capas alineadas se unieron por cocción ellos en 80 ° C durante 60 min. Las capas unidas fueron entonces pelados fuera del molde, y se perforaron agujeros para puertos de control. Por último, el dispositivo de PDMS de múltiples capas fue cubierta por una lámina de vidrio pre-limpiado (Fisher Scientific, Landsmeer, NL) y se mantuvo en el horno a 80 ° C durante 12 h para mejorar la adhesión. Antes de utilizar los dispositivos se pre-recubiertas por hacer fluir una solución de BSA (0,5 mg /ml) a través de los canales durante 20 minutos. soluciones de BSA fueron expulsados por el aire.
Total de amplificación del genoma
Kit Illustra GenomiPhi V2 amplificación de ADN (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) se utilizó para la WGA. La lisis (KOH 400 mM, EDTA 10 mM, DTT 100 mM), de neutralización (0,4 ml de HCl 1 M y 0,6 ml de 1 M Tris HCl, pH 7,5), y tampones de empuje (1X Tris · EDTA, 0,2% de Tween -20) se introdujeron a las entradas dedicadas en el dispositivo. La reacción de amplificación se realizó en un termociclador de diapositivas AmpliSpeed (Advalytix AG, Munich, Alemania) durante 2 h conjunto a 34 ° C. Después de la amplificación, las muestras se recogieron de las unidades de amplificación individuales y se transfirieron a una placa de PCR seguida de una etapa de inactivación a 65 ° C durante 10 min. Para volver a la amplificación de las muestras en el chip amplificados, se añadieron 17 l de la mezcla de WGA a 1 l de muestra en el chip amplificada basado en el protocolo del fabricante y la reacción se llevó a cabo a 30 ° C en un Bio-Rad CFX 384 Sistema de Tiempo real (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), durante 70 minutos. Esto fue seguido por una etapa de inactivación a 65 ° C durante 10 minutos.
La cuantificación y calificación
qubit 2.0 fluorómetro y Qubit dsDNA SA Kit de ensayo (Invitrogen, Breda, Países Bajos) fueron utilizados para cuantificar ADN de doble cadena. En tiempo real SYBR verde qPCR se utilizó para la cuantificación de ADN específica de la diana. Para
E.coli
WGA, se utilizaron cebadores contra un subunidad pequeña (SSU), 369 pb, del gen 16 S rRNA a una concentración de 500 nM. Para la amplificación de las células cancerosas sola, cebadores diseñados para la orientación de la subunidad pequeña de GAPDH (12p3), ErbB2 (17p12), CCND1 (11q13), MyC (8q24.21), PRMT2 (21q22.3), urb2 (1q42.13), FGFR1 (8p12), P53 (17p13.1), TRAM1 (8q13.3), y PAK1 (11q13-q14) se utilizaron a una concentración de 500 nM.
Cultivo de células y preparación
La línea celular de cáncer de mama, SKBR-3 (ATCCHTB-30) y las células MCF-7 (ATCCHTB-22), se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos), suplementado con 10% suero bovino fetal (Sigma Aldrich), 2 mM L-glutamina (Sigma Aldrich), 1% de penicilina-estreptomicina (Sigma Aldrich) a 37 ° C en atmósfera de 5% CO2. Antes de la experimentación, las células fueron teñidas con CellTracker Naranja CMTMR (Molecular Probes, Breda, Países Bajos) a 37 ° C durante 30 min y se separan mediante 0,05% de tripsina /EDTA (Gibco, Paisly, Reino Unido). Posteriormente, las células se lavaron una vez con medio de cultivo y se resuspendieron en solución de PBS.
Hibridación Fluorescente In Situ (FISH)
SKBR-3 y las células MCF-7 se cultivaron y se recogieron como descrito arriba. Ambas líneas celulares se fijaron en suspensión usando fijador de Carnoy (Metanol (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido): ácido acético (Merck, Hohenbrunn, Alemania), 3:01) y se dejó caer sobre un portaobjetos de microscopio normal. Los portaobjetos se dejó secar durante 30 min antes de ser incubadas durante 15 min en 2 x SSC (20x SSC = cloruro de sodio 3 M (Merck), citrato de sodio 0,3 M (Merck), pH 7,0), 0,5% Igepal (Sigma Aldrich) después de lo cual los portaobjetos se deshidrataron en etanol graduado (70%, 85%, 100%) durante un minuto cada uno. 3,5 l Her2 /neu (ErbB2) (Kreatech, Amsterdam, NL) mezcla de sondas se aplicó a los portaobjetos, seguido de un Ø12 mm cubreobjetos (Thermo Scientific, Breda, NL). Después de que el borde del cubreobjetos se selló con cemento de goma (Kreatech), sondas y diana se desnaturalizaron durante 10 minutos a 76 ° C y se dejaron hibridar durante 16 horas a 37 ° C. Después de la hibridación, los cubreobjetos se retiraron y un lavado riguroso se aplicó usando SSC 0,4 x, 0,3% de Igepal a 72 ° C durante 2 min. Los portaobjetos se enjuagaron durante 5 min en 2X SSC 0,1% de Igepal y se deshidrataron en etanol graduado (70%, 85%, 100%) durante 1 min cada uno. Los portaobjetos se montaron finalmente en DAPI /Antifade (Kreatech).
Resultados y Discusión
Caracterización de dispositivos
El diseño y los principios de funcionamiento del dispositivo paralelo sola célula WGA se ilustran en Figura 1. El dispositivo incluye 8 unidades de amplificación con 6 entradas (abrir círculos azules) y 10 puntos de venta (círculos azules sólidos) (Figura 1A), y consiste en dos capas, una capa de fluido (en azul) y una capa de control (en rojo y rosa). Cada unidad de amplificación (véase la Figura 1B) se compone de tres cámaras circulares (1,2 nl) y una cámara cuadrada (20.25 nl). Las válvulas de corte (en rojo) son operadas neumáticamente y permiten tanto la manipulación de las células y la carga de las soluciones. Las válvulas de mezcla (en rosa) situados en el centro de las tres cámaras circulares se utilizan de la misma manera. El canal principal tiene tres entradas para la introducción respectiva de la suspensión de células, el tampón de lisis y el tampón de neutralización, que están conectados a multiplexar canales para empujar el contenido de las 8 unidades de amplificación individuales en el lado opuesto. Los productos de WGA se pueden recoger en los 8 reservorios de salida individuales. El proceso de funcionamiento del dispositivo se ilustra en la figura 1C, donde se introdujeron tintes de color en el dispositivo para fines de visualización, y la imagen en el microscopio. El tinte azul representa la mezcla de WGA, el tinte de color naranja la suspensión celular, el colorante verde el tampón de lisis, el tinte rojo el tampón de neutralización y el tinte púrpura empujando el buffer. En primer lugar el colorante azul se utiliza para llenar todas las cámaras rectangulares. A continuación, el tinte de color naranja se cargó en el canal principal y empujó en las ocho primeras cámaras circulares. La misma operación se realiza para el verde y los colorantes rojos. Finalmente, la solución presente en las tres cámaras circulares y el colorante azul en la cámara cuadrada se mezclaron. Los reactivos se mezclan alcanzado tras el accionamiento de las válvulas de tres botones, y este procedimiento de operación se muestran en una película (Película S1). Para scWGA, se utilizó el accionamiento de la válvula botón sólo para la etapa de reacción WGA en la Figura 1 (C-j). Debido al número de Reynolds bajo que se encuentra en los canales de microfluidos, la mezcla se produce tras la difusión pasiva. Para mejorar la eficiencia de mezcla para la amplificación de ADN, las válvulas de botón-forma se integraron en las unidades de amplificación de cerrado del dispositivo, en el centro de las tres cámaras circulares. Presurización de las tres válvulas de botón secuencialmente ayuda a mezclar los reactivos de las cámaras circulares y cuadradas. La eficacia de la mezcla de las válvulas de botón se evaluó por primera vez en la mezcla de pruebas utilizando un tinte de color azul. Después de la cámara de WGA plaza se llenó con el tinte de color azul, las tres cámaras circulares se llenaron con agua MiliQ y la válvula de cierre se abrió entre las cámaras circulares y cuadradas. Entonces, las válvulas de botón se abren y cierran secuencialmente a una frecuencia dada. Mediante la observación de la mezcla de los colores de la secuencia de apertura y cierre de válvulas de botón fue optimizado. Para acceder a la eficiencia del mezclado, el valor de brillo de la primera cámara círculo se registró durante la mezcla en el área indicada como una línea círculo rojo en la figura 2A. El tiempo de mezcla completa por difusión únicamente se encontró que era aproximadamente 30 min mientras que la válvula botón Prestó asistencia a la mezcla a 2 Hz fue mucho más rápido y sólo tomó aproximadamente 4 min, como se muestra en la Figura 2B. Finalización de la mezcla se ajusta de tal manera que el valor de brillo medido usando el software Image J en la primera cámara alcanzó 110 (color azul) de la 220 medida desde el MilliQ transparente. Las válvulas que operan se ensayaron a frecuencias comprendidas entre 0,1 y 30 Hz durante 5 minutos y los resultados de mezcla se presentan en la Figura 2C. eficiencia de mezcla disminuyó por debajo de 0,5 Hz y por encima de 5 Hz, y que se necesita al menos 4 min accionamiento de la válvula para una mezcla óptima. A medida que el peso molecular influye en el coeficiente de difusión molecular y puesto que el peso molecular del colorante color de los alimentos es considerablemente más pequeño que el de la phi29 polimerasa (MW 68,000), que también se utiliza rodamina dextrano conjugado (MW 70.000) y naranja de acridina ADN marcado para evaluar la mezcla en el dispositivo por microscopía de fluorescencia. La mezcla era de hecho más lento en comparación con el tinte color de los alimentos y llegó a completarse en aproximadamente 20 minutos a 1 Hz. (Figura S1).
(A) Vista esquemática del dispositivo. El dispositivo consta de 8 unidades de amplificación con 6 entradas y 10 salidas. (B) La vista ampliada de dos unidades de amplificación. El color azul representa los canales de flujo, el color rojo representa las capas de control de las válvulas de corte y el color rosa representan las capas de control de las válvulas de botón. Las unidades de amplificación consisten en tres cámaras circulares (1,2 nl) para la suspensión de células, un tampón de lisis, y el tampón de neutralización y una cámara cuadrada (20.25 nl) diseñado para la mezcla de WGA. válvulas de mezcla se encuentran en el centro de tres cámaras circulares. proceso de operación (C) de dispositivos. imágenes de campo claro de una unidad de amplificación con tintes de color demuestran proceso de operación. (A-j).
imagen de campo claro de una unidad de amplificación, donde la cámara de plaza se llena con un tinte de color azul y tres cámaras circulares con agua, tomada en t = 0. media (A) valor de brillo de la primera cámara (círculo rojo) se controló como una función del tiempo después de la apertura de la válvula. (B) mezclar la eficiencia de las válvulas de botón. Medido valores medios de brillo en la primera cámara circular con válvula de operación-indica como negro y sin mezclar funcionamiento de la válvula como se indica verde mezclado. (C) mezclar prueba de eficiencia en varias frecuencias de funcionamiento de la válvula de mezcla. Los valores promedio de brillo de la primera cámara miden durante 5 min.
Total de amplificación del genoma en una adaptación de la viruta
del protocolo de WGA para la amplificación isotérmica de ADN con la enzima Phi29 en un dispositivo de microfluidos se ha realizado mediante
toda E. coli
genoma como una muestra del modelo. En primer lugar, un
E.coli
solución de ADN (6 ng /l) se cargó en el canal principal, y mediante el cierre de las válvulas en el canal principal un volumen exacto de 1,2 nl se puede mide y se cargaron en la primera cámaras de las unidades de amplificación del dispositivo, que corresponden a la cantidad de ADN (7,2 pg) encontrado en una única célula de cáncer. Una solución tampón (1X Tris EDTA, 0,2% de Tween 20) se empuja a través de la primera cámara de cada unidad de amplificación para llenar las tres cámaras circulares, teniendo cuidado de las válvulas entre las cámaras circulares y cuadradas fueron cerradas correctamente para aislar la mezcla de WGA cámaras. La mezcla de WGA se introdujo posteriormente desde la entrada directa de todas las cámaras cuadradas antes de la reacción. válvulas laterales de las cámaras cuadradas separadas las unidades de amplificación individuales. Después de abrir las válvulas de aislamiento entre la circular y la cámara de cuadrado, la mezcla de reacción de amplificación que consta de Phi29 polimerasa, hexámeros aleatorios y dNTPs en la cámara de plaza y la
ADN de E. coli
en las cámaras circulares comenzado a difundirse y eran mezclado activamente con la ayuda de las válvulas de botón accionados a 1 Hz. Después de 2 h, las muestras fueron empujados a una punta de pipeta de carga de gel colocado en la salida del canal mediante la inserción de 5 l de tampón de empuje de la entrada, y el contenido de la punta de pipeta se transportan posteriormente a una placa de PCR. Después de la inactivación de las muestras recogidas a 65 ° C durante 10 min, qPCR dirigidas a la SSU de 16 gen S rRNA se realizó para comprobar la calidad del producto amplificado. Las curvas en tiempo real qPCR utilizando dieciséis muestras de 1 l de ADN en el chip amplificada se presentan en la Figura 3 (líneas verdes), y corresponden a una Cq promedio de 14,77 ± 0,55 (n = 16). Para la comparación, se analizaron catorce muestras de 6 ng /l de solución de ADN en la cámara nl 1,2 sin ninguna amplificación. Aquellos están representados por las líneas negras en la Figura 3, y dio lugar a un valor promedio de Cq 23,43 ± 0,02 (n = 14). mayor cantidad de ADN a partir muestran más adelante valor CQ en RT-qPCR y la diferencia de los valores Cq (ΔCq) puede cuantificar la diferencia del importe entre las muestras en función de las curvas de calibración. ΔCq de muestras sin amplificación y las muestras después de la amplificación fueron aproximadamente 9. Por lo tanto, la qPCR focalización de SSU rRNA gen S 16 dio lugar a una amplificación del ADN diana específica de 512 veces (2
ΔCq = 2
9, 100% eficiencia). Experimentos similares realizados sin mezclar usando las válvulas de botón resultaron en un valor medio Cq de 20,18 ± 2,07 (n = 7), lo que demuestra claramente la ventaja de la mezcla activa durante la etapa de amplificación (Figura S2).
Real- curvas de tiempo qPCR dirigidos SSU 16 S rRNA gen de muestras recogidas individuales desde el dispositivo. En el chip muestras amplificadas se representan como curvas verdes (n = 16), mientras que las muestras de control sin amplificación se representan como curvas negras (n = 14).
WGA de las células tumorales
para demostrar la viabilidad de la caracterización genética de células tumorales individuales en el dispositivo de microfluidos que usan células de la línea celular de cáncer de mama SKBR-3 y MCF-7. A medida que la cantidad de ADN (6-7 pg) contenido dentro de una sola célula es demasiado bajo para un examen directo de su composición, de todo el genoma se amplificó como se ha descrito antes. En el canal principal de la morfología y el inmunofenotipo de las células pueden ser examinadas y una vez comprobado que las células se ajusta a los criterios de selección de células individuales se pueden mover en la primera cámara de las unidades de amplificación. Una suspensión de células de SKBR-3 y MCF-7 células teñidas con CellTracker naranja se inyectó en el canal principal, y se identificaron las células que se sometieron para análisis adicional por su tinción de fluorescencia y la morfología tales como tamaño y forma. Después de la carga de las células individuales en la primera cámara de una unidad de amplificación, aire fue empujado para vaciar el canal principal. Como líneas de flujo multiplexadas están conectados al canal principal de cada línea se puede abrir de forma individual mediante la operación de combinación de las válvulas y sólo las células de interés pueden ser tratados posteriormente. [32] Las imágenes de una célula SKBR-3 en una cámara de amplificación se muestran en las figuras 4A & amp; B. Después de la celda se trasladó a la unidad de amplificación otro, el tampón de lisis se cargó, como se muestra en la Figura 1C, medida por el cierre de las válvulas, y empujó usando 1X Tris · EDTA, 0,2% de Tween-20 para mezclarlo con la célula . Para acomodar el volumen de la válvula entre la primera y la segunda cámaras de círculo se abrió y la lisis se llevó a cabo en las dos primeras cámaras de 10 min por difusión. De la misma manera, se introdujo el tampón de neutralización y la neutralización se llevó a cabo en las tres cámaras de círculo, también para 10 min basado en la difusión. el accionamiento de la válvula para la mezcla no era necesario para la lisis y neutralización como tiempo de difusión entre 2 o 3 cámaras circulares era lo suficientemente rápido para llevar a cabo la reacción. lisis efectiva de las células se controló por microscopía. La mezcla de WGA se cargó en las cámaras de cuadrados mediante el uso de entradas y salidas separadas, y a partir de entonces, las válvulas de botón se hicieron funcionar a 1 Hz durante 2 h la reacción para mezclar el lisado de células y la mezcla de WGA, y amplificar el ADN. Aproximadamente se obtuvo 8,27 ng de DNA de la amplificación en el chip, y, como una sola célula contiene 6-7 pg de ADN, se logró la amplificación de más de 1000 veces. Validación de ADN plantilla específica se realizó mediante qPCR focalización el locus del gen GAPDH como alteraciones de GAPDH no se han reportado en ambas líneas celulares. La línea celular de cáncer de mama RBSK-3 y MCF-7 se utilizaron para demostrar diferencias en la amplificación del gen ErbB2. La Figura 4C muestra las curvas en tiempo real qPCR de GAPDH para seis células individuales SKBR-3 (curvas negras) y seis células MCF-7 individuales (curvas verdes), analizó utilizando dos dispositivos diferentes. Los valores de CQ por la amplificación GAPDH cuantificado en base a las curvas de calibración fueron 23,22 ± 0,6. Esto implicaba que el 33% de la cantidad total de ADN, medido por el ensayo de Qubit, fue producto de la plantilla-dependiente. En las figuras 4D y E FISH imágenes después de la hibridación de sondas de ErbB2 (rojo) y centrómero del cromosoma 17 (verde) de una célula RBSK-3 y MCF-7 se muestran. Considerando 2 copias del cromosoma 17 y 2 copias del gen de erbB2 se observaron en la célula MCF-7, cuatro copias del cromosoma 17 y & gt; Se encontraron 10 copias del gen de ERBB2 en la célula SKBR-3. A continuación, el mismo análisis se realizó utilizando scWGA en nuestro dispositivo de microfluidos usando erbB2 qPCR específica, por SKBR-3 individual y células MCF-7. Como se muestra en la Figura 4 F, el valor de ERBB2 Cq promediado en el ADN amplificado de las células individuales SKBR-3 fue 24,95 ± 0,68 (n = 6) frente a 29,80 ± 1,96 (n = 5) para las células MCF7 individuales mientras que el valor GAPDH Cq para ambas líneas celulares fue de 23,22 ± 0,6 (n = 12) que se muestra en la Figura 4C. El valor inferior Cq medido para SKBR-3 células se correlaciona bien con las múltiples copias del gen ErbB2 observado por FISH (figura 4D), lo que sugiere que nuestro WGA en el chip, seguido de qPCR para genes específicos se puede utilizar para determinar si o no un gen se amplifica.
imagen de microscopia de campo brillante de una sola célula RBSK-3 aislado en una cámara de microfluidos (a), se combinó con una imagen de fluorescencia. imagen (B) de la fluorescencia de una sola célula SKBR-3 teñidas con CellTracker naranja en la cámara de microfluidos. (C y F) qPCR orientación GAPDH y genes ERBB2 de chip en el ADN para la cuantificación y caracterización amplificó usando 1 l de muestras en el chip amplificados (5 l) de individuo SKBR-3 (n = 6) y MCF-7 (n = 6) como plantillas. (C) en tiempo real de las curvas de qPCR de la amplificación del gen GAPDH. ADN amplificado de un solo RBSK-3 se representa mediante curvas negras mientras que la de simples células MCF-7 se representa como las curvas de color verde. línea de umbral es de color gris. Imágenes de hibridación in situ fluorescente (FISH) con sondas de ErbB2 (rojo) y centrómero del cromosoma 17 sondas (verde) para la persona RBSK-3 (D) y MCF-7 (E) (D y E). Los núcleos se tiñeron con valores (F) Cq del gen ErbB2 en un gráfico de caja Hoechst (azul). cq valores de ErbB2 han estado representados cuadro negro en RBSK-3 (n = 6) y la caja roja en las células MCF-7 (n = 5, * 1 Cq de la muestra no se encuentra debido a un error de PCR). . (25% -75%: □, Valor medio: -, Valor medio: □, Min /Max: °, rango de Min /Max: I)
Para el análisis genético como la secuenciación o se requiere el análisis conjunto de alto rendimiento, mayor cantidad de ADN (microgramos). Para evaluar la idoneidad de los productos de re-amplificado para la representación de genes, amplificado fuera de chip 1 l de 5 l en el chip amplificó ADN de una sola célula SKBR-3 en 17 l de mezcla WGA, seguido de qPCR de orientación 10 loci diferentes en el todo el genoma. Para ello elegimos 10 genes que son de interés para el campo de la investigación del cáncer y situados en distintos cromosomas. Los productos amplificados de estos genes pueden proporcionar información sobre la representación de la DNA a partir de los productos amplificados. 10 ng de 8 muestras de re-amplificado recogidos a partir de dos dispositivos (4 muestras por dispositivo) se compararon con 10 ng de ADN genómico (ADNg) de SKBR-3. La Figura 5A muestra el coeficiente de varianza (CV,%) de los valores CQ en 4 muestras en cada dispositivo presentado como barras verdes y negros para los 10 loci considerados. El promedio de la CV para los 10 genes fueron 3,8% para el primer dispositivo (verde) y 2,9% para el segundo dispositivo (negro), y se observó variación de menos de 7% en genes any10 entre las muestras en el mismo dispositivo. Los valores ΔCq para las 8 muestras individuales en comparación con ADNg se determinaron para los 10 genes (véase la figura 5B). Las líneas individuales en la Figura 5B corresponden a una reacción en el chip. ΔCq varió entre genes, pero los 10 genes se amplificaron en 10 ng de muestras scWGA (n = 8). Se estima que el número de copias de los genes diana sobre la base de las curvas de calibración de ADNg qPCR. Las barras grises en la Figura 5C representan los números de copias de scWGA individual en 10 ng de ADN, mientras que las barras negras representan los números de copias de ADN genómico en 10 ng. El número de copias promediados para los 10 genes en 10 ng de ADN son: 128 copias de erbB2, 47 copias de CCND1, 140 copias de MYC, 201 copias de PRMT2, 213 copias de urb2, 1182 copias de FGFR1, 42 copias de P53, 348 copias de TRAM1, 332 copias de PAK1, y 513 copias de GAPDH, que corresponde a los porcentajes de representación de 4,8%, 1,4%, 6,6%, 7,5%, 5,4%, 34,1%, 1,5%, 9,1%, 10,7%, y 15,5%, respectivamente. Tardías valores Cq y amplificación de fondo resultó en un menor número de número de copias de genes en comparación con gDNA en 10 ng. Desde que se observó el mismo resultado cuando se amplificaron copias pequeñas de ADNg, suponemos este sesgo es un artefacto causado por el kit comercial. Además, basado en la fluorescencia cuantificación de ADN, re-amplificación, los procedimientos de qPCR, y cuantificación en base a las curvas de calibración de ADN genómico pueden variar los resultados. Otros no isotérmica y métodos de amplificación de ADN isotérmicos pueden implementarse en nuestro dispositivo de microfluidos pesar de que los volúmenes de reacción y las etapas de reacción tendrá que ser adaptado y para el control de temperatura no isotérmica tendrá que ser introducido.
Valores
Cq de 10 ng plantillas de ADN se determinan por SYBR qPCR verde de orientación 10 genes. (A) El coeficiente de variación (%) de los valores Cq de 4 muestras amplificadas en el mismo chip. Las muestras en 2 dispositivos diferentes se indican como barras verdes y negros. (B) línea individual representa una muestra amplificada en un chip de una sola célula. eje Y representa valores Cq delta entre 10 ng de ADN amplificado en un chip de única célula y el ADN genómico. (C) el número de copias estimadas de muestras individuales se representan como barras grises. (N = 8) Las barras negras representan el número de copias estimadas de ADN genómico en 10 ng.
Conclusiones
A continuación, presentamos un dispositivo de microfluidos para el procesamiento paralelo de las células individuales para obtener cantidades suficientes de ADN mediante amplificación del genoma completo para el análisis de aguas abajo. membranas en forma de botón se implementan como válvulas mezcladoras, y el accionamiento secuencial de esas válvulas mejoran la eficiencia de mezcla. WGA en un volumen de reacción 23,85 nl se optimizó el uso de
E. coli
gDNA.