Extracto
Antecedentes
alteraciones de microsatélites elevada a tetranucleotide repite seleccionados (EMAST ) es una firma genética observada en el 60% de los cánceres colorrectales esporádicos (CRC). A diferencia de los CRC de microsatélites inestable en la hipermetilación del desajuste de reparación del ADN (MMR) genes
promotor de hMLH1 es causal, la causa precisa de EMAST no está claramente definida, pero apunta hacia
hMSH3
deficiencia.
Objetivo
para examinar si
hMSH3
deficiencia provoca EMAST, y explorar mecanismos para su deficiencia.
Métodos
Nos medimos -4 pb framshifts a
D8S321
y
D20S82
loci dentro de las construcciones que contiene EGFP-para determinar la formación EMAST en MMR-competente,
hMLH1
- /-
,
hMSH6
- /-
, y
hMSH3
- /-
células CRC. Hemos observado la localización subcelular de hMSH3 con el estrés oxidativo.
Resultados
D8S321
mutaciones ocurrieron 31 y 40 veces más altos y
D20S82
mutaciones ocurrieron
82 y 49 veces mayor en
hMLH1
- /- Opiniones y
hMSH3
- /-
células, respectivamente, que en
hMSH6
- /-
o células MMR-dominio.
hMSH3
caída en células de triple vírica con dominio implicaron más
D8S321
tasas de mutación (18.14 y 11.14 × 10
-4 mutaciones /célula /generación de dos clones independientes) que los controles revueltos (0 y 0,26 × 10
-4 mutaciones /célula /generación;
p Hotel & lt; 0,01). La secuenciación del ADN confirmó las mutaciones de cambio esperados con evidencias de mutaciones en curso de las construcciones. Debido a que los tumores EMAST-positivos están asociados con la inflamación, sometimos células MMR-competente con el estrés oxidativo a través de H
2O
2 para examinar su efecto en
hMSH3
. Se observó un cambio de poseedores de al citosol reversible de hMSH3 a H
2O
2 tratamiento.
Conclusión
EMAST depende de los antecedentes MMR, con
hMSH3
- /-
más propensos a las mutaciones de cambio que
hMSH6
- /-
, frente a frameshift mutaciones observadas para las repeticiones de mononucleótidos.
hMSH3
- /-
imita el fracaso triple viral completa (
hMLH1
- /-
) en la inducción de EMAST. Dada la expresión heterogénea observada de hMSH3 en los CRC con EMAST,
hMSH3
-deficiency parece ser el caso de que comienza EMAST. El estrés oxidativo, lo que provoca un cambio de localización subcelular de hMSH3, puede contribuir a un fenotipo hMSH3 la pérdida de función de secuestrar al citosol
Visto:. Tseng-Rogenski SS, Chung H, Wilk MB, Zhang S, M Iwaizumi, Carethers JM (2012) estrés oxidativo induce Shift nuclear a citosol de hMSH3, un mecanismo potencial para EMAST en células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (11): e50616. doi: 10.1371 /journal.pone.0050616
Editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, República de Corea
Recibido: 12 Agosto, 2012; Aceptado: 25 Octubre 2012; Publicado: noviembre 30, 2012
Derechos de Autor © 2012 Tseng-Rogenski et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Servicio de Salud Pública de Estados Unidos (DK067287 y CA162147) y el Centro Integral del cáncer Asociación SDSU /UCSD (CA132379 y CA132384). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
desajuste de reparación del ADN (MMR) disfunción conduce el proceso de inestabilidad de microsatélites (MSI), observado en casi todos los cánceres colorrectales síndrome de Lynch (CRC) y en el 15-20% de los CCR esporádicos [1]. MSI se observa cuando los dos alelos de un gen principal de ADN MMR es inactivada por mutación en los tumores Lynch o por hipermetilación en tumores esporádicos, causando la producción de proteínas MMR o función a fallar, y permitiendo que el marco de lectura a ocurrir en las secuencias de microsatélites de ADN en todo el genoma [1] - [3]. MSI Classic está determinado por la aparición de marco de lectura en los marcadores de mono /de dinucleótidos, y tiene un panel definido para los que comparar los estudios [4]. Este panel, o variaciones de estos marcadores mono /dinucleótidos, detecta fácilmente
hMLH1 CD - y
hMSH2
-deficiency (como la disfunción de estas dos proteínas inactiva completamente el ADN MMR), y de vez en cuando
hMSH6
-deficiency [1], [4]. El panel de MSI no es tan específica para detectar
hMSH3
-deficiency debido a la naturaleza de la reparación que esta proteína contribuye a la MMR, en base a estudios de levadura [5], [6]. ADN MMR es un sistema de enzimas cuya función celular principal es reparar mispairs de nucleótidos y de inserción /deleción bucles (IDL) durante la replicación del ADN. La especificidad de reconocimiento de falta de coincidencia es dirigida por hMutSα y hMutSβ; hMutSα (hMSH2-hMSH6 heterodímero) se une a mispairs individuales y las IDL pequeños (≤ 2 nucleótidos), mientras que hMutSβ (heterodímero hMSH2-hMSH3) se une IDL más grandes [1], [5] - [7]. Nosotros y otros han observado especificidades de unión de ADN lesión con hMutSα purificada y hMutSβ así como las observaciones concretas formuladas sobre la unión usando células CRC humanos de diferente origen ADN MMR-deficientes que albergan construcciones que contienen las IDL-longitud especificada o apareamientos de nucleótidos [8] - [12] .
Recientemente, una nueva forma de MSI se ha descrito hasta en el 60% de cáncer de colon esporádico [13] - [15] y más del 30% de los cánceres de recto [16]. A diferencia de clásico MSI, las alteraciones de microsatélites elevadas en repeticiones tetranucleotide seleccionados (EMAST) se determina mediante un panel de marcadores tetranuleotide [13] - [17]. EMAST parece ser más común de lo clásico MSI y parece ser una característica adquirida asociada con la inflamación en los CRC [14], [16]. CRC pacientes que tienen tumores EMAST-positivas tienen un peor pronóstico que aquellos con tumores que no son EMAST o MSI [16], [18]. EMAST se ha observado en varios tumores, incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas [17], de la vejiga [19], de ovario [20], de próstata [21], la piel [22], y de colon [13] - [16], pero estos los estudios no proporcionan evidencia completa sobre la causa de EMAST. En los informes iniciales de EMAST en el cáncer colorrectal, los autores observaron heterogeneidad nuclear de hMSH3 dentro de los tumores EMAST-positivas [13], [14]. Nuestros datos, combinados con la levadura [5], [6], y otros estudios en humanos [13] - [16], sugiere que los
hMSH3
-deficiency podría ser el conductor del EMAST en CRC
con el fin de probar si
hMSH3
-deficiency es una causa principal de EMAST, que genera tetranucleótido repetir que contienen construcciones que fueron fusionados fuera del marco con EGFP, de manera que cuando frameshifted por -4 pb ( es decir, la supresión de una unidad tetranucleotide), EGFP se expresó. Esto permitió la observación de la generación de EMAST en tiempo real, y nos dio la capacidad de calcular las frecuencias de mutación y las tasas de mutación en múltiples fondos MMR-deficientes. En este informe, nuestros datos muestran claramente que
hMSH3
-deficiency es una causa de EMAST en las células CRC humanos y nos proporcionan además un posible mecanismo que puede contribuir a la adquirida
hMSH3
-deficiency en CRC humanos.
resultados
Establecimiento de un sistema de medición para EMAST Tetranucleotide desplazamientos del marco
Debido a que algunos estudios han indicado que EMAST se asocia con la expresión heterogénea de hMSH3 en los tumores colorrectales [13 ] - [16], nuestro enfoque fue la generación de un sistema para medir EMAST de una manera cuantitativa como medio para examinar directamente si
hMSH3
-deficiency es la causa de EMAST. tetranucleótido humana
D8S321
y
D20S82
secuencias de loci (que contienen 12 y /o 16 repeticiones de AAAG, respectivamente) han demostrado la frecuencia más alta para un desplazamiento del marco -4 pb en los tumores colorrectales [14], [dieciséis]. Por lo tanto, estos dos loci fueron seleccionados para el estudio de la utilización de células de CRC con diferentes antecedentes genéticos MMR para determinar la mutación subsiguiente. Hemos establecido previamente un sistema experimental similar donde deleción de 1 pb de (A)
n conduciría a la expresión del gen reportero EGFP cuando una construcción se colocó 1 pb fuera de marco [10] - [12 ].
Para generar las construcciones experimentales, insertamos los loci
D8S321 gratis (D8) y
D20S82 gratis (D20) como 60-meros que contiene las repeticiones tetranucleotide y sus alrededores nucleótidos inmediatamente después del codón de inicio de EGFP [Tabla S1]. construcciones experimentales [D8-DE (D8-out-of-frame) y D20-DE] se hicieron +1 pb fuera del marco tal que la supresión de una repetición AAAG cambiará el marco de lectura EGFP (1 pb a -3 pb) en el marco correcto para causar la expresión de EGFP. resistentes (MR) plásmidos de mutación (MR-D8 y RM-D20), que sirven como controles negativos, se construyeron mediante la sustitución de los nucleótidos AA medias dentro de la AAAG repite con C nucleótidos /g en cada tercer AAAG, interrumpiendo la serie de tetranucleótido repite prevenir mutaciones de cambio. Se colocaron los plásmidos MR-D8 y RM-D20 fuera de marco (DE; D8 /D20-MR-DE) y /o en marco (SI; D8 /D20-MR-SI) para ser utilizado como negativa y positiva controles para la expresión de EGFP (también ver Materiales y Métodos). Estas construcciones se transfectaron en líneas celulares de CRC humanos con diferentes antecedentes genéticos MMR y líneas celulares estables fueron establecidos a través de la selección de higromicina B. clones de células individuales se establecieron posteriormente. La secuenciación del ADN se utilizó para confirmar correctamente las construcciones EMAST transfectadas (Tabla S1). Como era de esperar, las células que llevan MR-SI (control positivo) fueron EGFP positivas, mientras que las células que contienen MR-DE (control negativo) fueron EGFP negativo.
Para probar si
hMSH3
-deficiency podría causar EMAST, las células no fluorescentes que llevan las diferentes construcciones EMAST transfectadas de manera estable fueron ordenados por citometría de flujo y de manera exponencial cultiva durante cuatro a seis semanas. Cada semana, las células se analizaron por duplicado mediante citometría de flujo para la expresión de EGFP, presumiblemente como consecuencia de la supresión de una repetición de la AAAG transfectadas
D8S321
y /o
D20S82
loci. EGFP células positivas comenzó emergente tan pronto como una semana después de células negativas EGFP fueron ordenados y se sembraron (datos no mostrados). Para asegurar que nuestro sistema experimental nos ha permitido evaluar correctamente la ocurrencia de EMAST, las células negativas y positivas EGFP de
hMLH1
- /- Opiniones y /o
hMSH3
- /- células que albergan las construcciones experimentales (D8-D20-dE y dE) fueron ordenados para aislar el ADN genómico para la secuenciación. Como era de esperar, esencialmente todos los clones (superior al 96%) a partir de células negativas EGFP retenidos secuencias de tipo salvaje (WT) para cada uno de
D8S321
y
D20S82
loci en tanto
hMLH1
- /- Opiniones y
hMSH3
- /-
líneas celulares, mientras que los clones de células positivas EGFP supresión de una repetición AAAG (Figura 1A y Figura S1 a y S1B) adquiridos. También hemos observado mutaciones de cambio de expansión en cada locus por secuenciación del ADN (incluido en "otros" en la figura 1A). La más frecuente (que van desde el 12,5% hasta un máximo de 30% del total de células EGFP-positivo) fue la inserción de dos AAAG repite [(AAAG)
12 a (AAAG)
14] en
D8S321 Windows que cambia el marco de lectura de 1 pb a +9 pb (listado como "otros" en la Figura 1A y Figura S1 a). Además, se observa raramente más de una repetición de eliminación AAAG (por ejemplo, 4 o 10 AAAG repetición de eliminación) (& lt; 8% del total, que se enumeran en "otros" en la figura 1A). Es importante destacar que, mutaciones por deleción /inserción siempre se detectaron dentro de las secuencias microsatélites mientras que ninguna mutación se produjo en las secuencias de acompañamiento en torno a repetir AAAG (Figura S1). Estas observaciones indican que hemos establecido un sistema experimental fiable para vigilar la incidencia de EMAST en las células CRC
.
(A) El ADN genómico aislado de las células-negativas y positivas a EGFP que llevan construcciones experimentales (D8-DE y /o D20-dE) se utilizó para amplificar fragmentos de ADN que contienen EMAST loci para conocer si se habían producido las mutaciones de cambio. (B) las frecuencias de mutación se calcularon dividiendo el porcentaje de población EGFP positiva en el grupo experimental (DE) por el porcentaje de EGFP positivo en su control negativo (MR-DE) para calcular el aumento de la población EGFP-positivas en los pliegues. Hubo significativamente más células EGFP-positivas en
hMLH1 CD - y
hMSH3
deficientes en comparación con las células MMR-competente y /o células
hMSH6
deficientes. *:. P & lt; 0,05
Frameshift Las mutaciones en Tetranucleotide Repeticiones de
D8S321
y
D20S82
Loci dependen del Fondo MMR
Para examinar el efecto de fondo MMR en mutaciones frameshift en el tetranucleotide
D8S321
y
D20S82
loci, se calcularon las frecuencias de mutación de los marcadores mediante la comparación de cada grupo experimental (dE) para su control negativo (MR -OF) utilizando la siguiente fórmula: "(células EGFP positivas /células vivas totales de dE) /(EGFP células positivas /células vivas totales de MR-dE)".
hMLH1
- /- células (
completamente desprovistos de actividad de ADN MMR) y
hMSH3
- /- células mostraron frecuencias de mutación 7-12 veces más altos en comparación con los controles para ambos loci (Figura 1B). En particular, las frecuencias de mutación observados en
hMSH3
- /- fueron comparables a la de
hMLH1
- /- para ambos loci (Figura 1B). Las tasas de mutación -4 pb para ambos loci en cada fondo MMR también se calcularon (Tabla 1). Con MMR-deficiencia completa (
hMLH1
- /-
), las tasas de mutación para ambos loci fueron 27 y 56 × 10
-4 mutación /célula /generación. Del mismo modo,
hMSH3
- /-
células generan 33 y 34 × 10
-4 mutaciones /célula /generación. Por lo tanto, las tasas de mutación con
hMSH3
-deficiency son muy comparables a los observados para MMR-deficiencia completa. Esto está en marcado contraste con
hMSH6
-deficiency (& lt; 1 × 10
-4 mutación /célula /generación), esencialmente idénticas a las células MMR-dominio. Estos resultados sugieren fuertemente la
hMSH3
-deficiency es el controlador para la formación EMAST.
Derribo directa de hMSH3 expresión en células MMR-dominio Causas EMAST
Para confirmar un papel de hMSH3 en EMAST, derribaron
hMSH3
expresión en células MMR-dominio que alberga el
D8S321
EGFP construir mediante la transfección de plásmidos llevar a
hMSH3
específico de shRNA y /o control mezclado, a continuación, medido
D8S321
tetranucleótido mutaciones de cambio que el anterior. Antes de shRNA transfección, hMSH3 los niveles de expresión de los clones seleccionados MMR-dominio fueron comparables entre sí (Figura S2). Después de la generación de líneas celulares estables shRNA (clones de células individuales), la expresión hMSH3 se redujo significativamente en células transfectadas
hMSH3
shRNA (Figura 2; varía entre 26-34% de los niveles de proteína de los controles revueltos).
hMSH3
shRNA transfección con éxito y específicamente reduce los niveles de expresión hMSH3 en los clones de células CRC. Tenga en cuenta que los niveles de expresión de otros genes de reparación del ADN no coincide permanecen sin cambios.
El uso de las células transfectadas de forma estable-shRNA que contienen el
D8S321
lugar, hemos examinado las líneas celulares para la ocurrencia de EMAST por citometría de flujo. Una población EGFP-positivas apareció en las células donde
hMSH3
expresión fue derribado.
hMSH3
KD células mostraron 5 veces (clon 1) y 6 veces (clon 2) el aumento de las frecuencias de mutación (Figura 3A) en comparación con células de control shRNA codificados. Reducción en la expresión hMSH3 aumentó en gran medida las tasas de mutación de la
D8S321
construir 12.7 y 18.4 × 10
-4 mutación /célula /generación, en comparación con 1 × 10
-4 mutación /célula /generación en los controles revueltos (Tabla 2). EGFP-negativas y células positivas se separaron para la secuenciación de ADN para examinar mutaciones frameshift. En ambos clones, mayor que 90% de las células negativas EGFP retenido WT secuencia [(AAAG)
12], mientras que aproximadamente el 90% de las células EGFP-positivo reveló una deleción de una repetición de AAAG (Figura 3B). También se detectó la expansión de las repeticiones de microsatélites (incluido como "otros" en la Figura 3B). En general, nuestras observaciones indican que KD directa de
hMSH3
causando
hMSH3
-deficiency por sí solo es capaz de generar EMAST en las células CRC-MMR dominio anteriores.
( a) las células SW480 (MMR) competentes que llevan el constructo EMAST (D8-dE-D8 o MR-dE) fueron transfectadas con
hMSH3
shRNA construir (
hMSH3
KD) o control de mezcla aleatoria (scramble ) separadamente. Dos independiente
hMSH3 Opiniones y clones scramble KD, así como las células parentales fueron incluidos en este estudio. EMAST frecuencias de mutación se calcularon como se describe en la Figura 1B para los padres, scramble, y /o
hMSH3
KD células. Hubo significativamente más células EGFP-positivas en
hMSH3
KD células en comparación con los padres y /o células de control revueltos. *: P & lt; 0,001; **: P & lt; 0,05. (B) células positivas de
células hMSH3
KD llevan D8-DE-EGFP negativo y se clasifican para el aislamiento de ADN genómico para examinar mutaciones de cambio de secuenciación.
Estrés Oxidativo Causas subcelular Shift compartimental de hMSH3 desde el núcleo hasta el citoplasma
EMAST se ha observado que estar estrechamente asociada con la pérdida de la expresión heterogénea de hMSH3 así como la expresión heterogénea nuclear (Haugen
et al
., 2008; Lee
et al
., 210, Devaraj
et al
., 2010). Nuestros estudios proporcionan por encima de evidencia adicional de que la reducción de la expresión hMSH3 el único que puede inducir en las células EMAST CRC humanos. Comenzamos a explorar cómo hMSH3 podría llegar a ser deficientes en los tumores EMAST-positivas con la reducción observada de lleno a la expresión heterogénea. En CRC, EMAST se asocia con células inflamatorias [13], [14], [16] que puede facilitar el estrés oxidativo, que se ha demostrado para deteriorar la función MMR [23]. Usando H
2O
2 como un sustituto, se investigó el efecto (s) del estrés oxidativo sobre la expresión hMSH3. células MMR-dominio se trataron con concentraciones crecientes de H
2O
2 (50 M -500 M) para un máximo de 24 horas. No se detectó ninguna reducción en los niveles de proteína total hMSH3 en cualquier condición que probamos (datos no mostrados). Sin embargo, al tratar las células con 50 M de H
2O
2 durante 4 horas, se encontró hMSH3 homogéneamente tanto en el núcleo y el citosol en un porcentaje significativo de células (40 a 60%; columna segundo panel en la figura 4A). Sorprendentemente, se observó hMSH3 a desalojar por completo en algunos núcleos de las células [10-20% del total de células (columna tercer panel en la Figura 4A], en agudo contraste con las células no tratadas, donde permaneció hMSH3 predominantemente localizados en el núcleo (paneles de la izquierda en la figura 4A ). el cambio de hMSH3 localización podría ser detectado tan pronto como 2 horas después del tratamiento, y el efecto alcanzó su punto máximo entre 4 y 8 horas después de H
2O
2 el tratamiento iniciado (datos no mostrados). a diferencia de hMSH3, hMLH1, hMSH2 y hMSH6 no modificaron su localización celular y se mantuvo en los núcleos (Figura 4B y la figura s3a, S3B y S3C). fraccionamiento celular para separar las fracciones citosólicas y nucleares cumplan con nuestras observaciones de inmunocitoquímica (carriles 1-3 y 5-7 en la figura 4B).
(a) se privaron de suero durante 24 horas y después se trata con 50 M de H
2O
2 durante 4 horas. Después de la fijación, se tiñeron las células SW480 MMR-dominio células con anti-anticuerpo hMSH3 y luego Alexa 488 anticuerpo anti-ratón conjugado para observar la localización subcelular de hMSH3. Para probar si el efecto es reversible, las células se cultivaron durante 24 horas adicionales después de la eliminación de H
2O
2. (B) las células SW480 se privaron de suero durante 24 horas y luego se trató con H
2O
2 durante 4 horas (FBS + H
2O
2). células de los padres (los padres) y las células que fueron suero de hambre y sin la posterior H
2O
2 de tratamiento (FBS) se utilizaron como controles. Las proteínas celulares se separaron en fracciones nucleares y citosólicas utilizando un kit de fraccionamiento nuclear. Se utilizó un volumen igual de proteínas a partir de cada grupo para SDS-PAGE y posterior transferencia Western para verificar los niveles de hMSH3. H3 anti-histona se utilizó para la igualdad de carga fracción nuclear, y la tubulina se utilizó para la igualdad de carga fracción citosólica.
Para examinar si el efecto de H
2O
2 en hMSH3 era reversible , reemplazamos H
2O
2 que contiene los medios de comunicación por medio nuevo después de 4 horas de tratamiento. hMSH3 se encontró que era nuclear por 24 horas después de la eliminación de H
2O
2 (paneles de la derecha en la figura 4A y carriles 4 y 8 en la Figura 4B). Este resultado puede indicar que el efecto de H
2O
2 en hMSH3 era reversible, donde se permite hMSH3 para volver a entrar en el núcleo una vez que el estrés oxidativo disminuyó. Alternativamente, el hMSH3 que estaba en el citosol podría haber sido dañado y degradado y por lo tanto era incapaz de volver a entrar en los núcleos, y puede indicar que la hMSH3 nuclear observada fue recién sintetizado. Para determinar qué escenario podría ser correcta, se trataron las células con 20 g /ml de ciclohexamida tras la retirada de H
2O
2 para detener la síntesis de proteínas durante 24 horas. hMSH3 se encontró que en el núcleo (datos no mostrados), lo que demuestra que la hMSH3 que se desplaza hacia el citosol era de hecho capaz de volver a entrar en el núcleo.
Discusión
ADN MMR Los estudios de bacterias y levaduras indican que hMutSβ, un heterodímero de hMSH2 y hMSH3, se une y dirige la reparación de inserción-deleción bucles ± 2 nucleótidos [1], [5], [6]. Por lo tanto,
hMSH3
-deficiency se esperaría para permitir grandes mutaciones de cambio de bucle de inserción-deleción, lo que ha llevado a sugerir que en estudios anteriores [13] - [16]. La determinación de la consecuencia de
hMSH3
-deficiency no era previamente de gran importancia, ya que nunca se ha descrito una mutación germinal para
Síndrome de Lynch hMSH3
causar, y no había ninguna correlación con CCR esporádico hasta la descripción de EMAST en CRCs [13] - [16]. La vinculación de EMAST con la pérdida de la expresión heterogénea de hMSH3 en los CCR esporádicos sugiere que esta proteína ADN MMR podría conducir EMAST. En nuestro estudio, nos dispusimos a probar esto mediante la creación de un modelo celular humano para medir la formación de EMAST de una manera cuantitativa. Nuestro estudio muestra que (a) la formación EMAST depende de los antecedentes MMR, con
hMSH3
-deficiency a juego completa MMR-deficiencia en la causa de EMAST, (b)
hMSH3
-deficiency tasas de mutación para formación EMAST son marcadamente más alta en comparación con la de
hMSH6
-deficiency (esencialmente nulo para la formación EMAST), (c) desmontables de
hMSH3
solo inicia la formación de EMAST, y (d) el estrés oxidativo puede ser uno de los factores que causan la deficiencia de hMSH3, ya que esta proteína MMR cambia su localización subcelular con H
2O
2. En conjunto, nuestro estudio ofrece un fuerte apoyo a la idea de que
hMSH3
-deficiency impulsa la formación EMAST y proporciona un posible mecanismo que puede contribuir a hMSH3-deficiencia en los CRC humanos.
Tetranucleotide desplazamientos del marco que definen EMAST en CRC tumores pueden ser mediante la inserción o supresión de repeticiones tetranucleotide. En nuestros experimentos, hemos diseñado construcciones para detectar una deleción -4 pb; sin embargo a la secuenciación del ADN también se detectaron algunas inserciones (de expansión) de los microsatélites. De hecho, la mayoría de las mutaciones del marco de lectura detectado en nuestros experimentos eran debido a la eliminación de una unidad AAAG (Figura 1A y 3B). Elegimos el
D8S321
y
D20S82
loci para nuestros experimentos porque la supresión de una unidad AAAG había demostrado ser la mutación más prevalente encontrado entre los loci utilizados para detectar EMAST [14], [16 ]. Debido a que nuestro sistema ha sido diseñado para detectar sólo un tipo de mutación, nuestras tasas calculadas son probablemente una subestimación de la mutabilidad de estos loci con
hMSH3
-deficiency. contexto de secuencia individual y secuencias de acompañamiento también pueden contribuir a la diferente resultado de la mutación (por ejemplo inserción frente a su eliminación) [11], [12], [24]. En el
D20S82
locus, sólo alrededor de un tercio de EGFP-positivas
hMSH3
- /-
células demostrado una unidad de eliminación AAAG y esto podría ser debido a este clon particular que contiene múltiples copias de la construcción. Esto se contrasta en más de un 70% de las células positivas EGFP que llevan el mismo constructo en
hMLH1
- /-
que muestra la supresión de una unidad AAAG, indicando el constructo comportado como fue diseñado. Para
hMSH3
- /-
células, la mutación en una de las copias daría lugar a la expresión de EGFP, mientras que el resto se mantuvo WT, confundiendo el análisis de secuenciación. Esto, sin embargo, no afecta a la frecuencia de la mutación y la tasa de mutación como el cálculo se basa en el número de las células EGFP-positivas.
No es totalmente claro para los tumores EMAST-positivos cómo
hMSH3
está regulado por disminución de iniciar EMAST. Existe una clara evidencia de que los tumores EMAST-positivas están fuertemente asociados con las células inflamatorias, particularmente dentro de los componentes epiteliales del tumor y en el estroma que rodea el tumor (los llamados "nidos tumorales") [16]. Por lo tanto, una hipótesis es que la inflamación provoca una reducción adquirido de hMSH3, que posteriormente conduce EMAST. Curiosamente, H
2O
2 de tratamiento (control de estrés oxidativo) conduce a un cambio de hMSH3 en el citosol de distancia de su sitio funcional en el núcleo sin disminuir sus niveles globales de expresión. Con corto plazo H
2O
2 de tratamiento, no pudo demostrar niveles detectables de formación EMAST en nuestro modelo (datos no mostrados). Una presencia de estrés oxidativo más largo y coherente puede ser necesario para comenzar EMAST, considerando EMAST parece estar asociada con la inflamación crónica y con la histología de los tumores avanzada [14]. Alternativamente, otros componentes de la inflamación y /o el medio tumor pueden trabajar de forma sinérgica con el estrés oxidativo para causar EMAST. EMAST parece ser un factor de mal pronóstico para los pacientes con CCR [16], [18]. Esto está en contraste con clásico MSI para los que los pacientes con CRC tiene una mejor supervivencia al mismo por etapas tumor de pacientes con tumores del SMS [1]. Queda por determinar si esto es intrínseco al tipo de defecto MMR (
hMLH1
vs.
hMSH3
) o algunos otros factores, tales como el grado o el tipo de inflamación en el tumor.
En resumen, nos muestra a través de la creación de un nuevo modelo de células que
hMSH3
-deficiency impulsa EMAST. Nuestros datos complementa fuertemente la observación de la pérdida heterogéneo de expresión en los tumores hMSH3 EMAST-positivos, y sugiere que adquirió
hMSH3
-deficiency, impulsado por el estrés oxidativo, puede ser el defecto más común de ADN MMR entre los CRC humanos.
Materiales y Métodos
líneas celulares y reactivos
Las líneas celulares de cáncer de colon humano, HCT116 (
hMLH1
- /- hMSH3
- /-
), DLD-1 (
hMSH6
- /-
), HCT116 + CH3 (
hMLH1-
restaurado pero
hMSH3
- /-
), y SW480 (MMR)-competente células se cultivaron como se ha descrito anteriormente [10]. HCT116, DLD-1 y SW480 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, Virginia). Las células HCT116 + CH3 fueron amablemente proporcionados por el Dr. Minoru Koi, Baylor University Medical Center, Dallas, TX [10]. Los anticuerpos anti-hMLH1, hMSH2, hMSH3 y hMSH6 se compraron de BD Pharmigen (San Diego, CA). El anticuerpo anti-tubulina fue de Sigma (St. Louis, MO). anticuerpo anti-ratón conjugado con HRP se adquirió de Cell Signaling (Danvers, MA). Alexa 488 anticuerpo anti-ratón conjugado fue de Invitrogen (Grand Island, NY).
Clonación de pIREShyg2-
D8S321
EGFP y pIREShyg2-
D20S82
EGFP plásmidos
los dos loci humanos,
D8S321
y
D20S82, España se han notificado a tener la más alta frecuencia de mutación en los tumores de colon EMAST [13] - fueron seleccionados [16], y para la construcción de plásmidos.
D8S321
y
D20S82
secuencias contienen 12 y /o 16 repeticiones de AAAG, respectivamente. oligonucleótidos sentido y antisentido que contienen
D8S321
o
D20S82
, secuencias, así como
Pme
me rodea y
Asc I
sitios de clonación (Tabla S1) se sintetizaron (Integrated DNA Technologies, Inc., San Diego, CA) y se sometió a reacciones de quinasa de T4-polinucleótido para fosforilar los extremos 5 '(Invitrogen). Los oligos de sentido y anti-sentido se permitió a recocido y se clonaron en plásmidos pIREShyg2-EGFP a través de
Pme
I-
Asc
sitios I inmediatamente después del codón de inicio del gen EGFP, como se describe anteriormente [ ,,,0],10] - [12], [24]. plásmidos experimentales se construyeron 1 pb fuera de marco, de tal manera que una deleción de una repetición de tetranucleótido dentro de
D8S321
o
D20S82 gratis (-4 pb mutación de desplazamiento) cambie el marco de lectura en el correcto marco para permitir la expresión de EGFP. plásmidos resistentes mutación [MR-fuera-de-marco (DE)] se construyeron utilizando el sentido y oligonucleótidos antisentido en el que dos nucleótidos dentro de cada repetición del tercer AAAG fueron modificadas para evitar que las mutaciones de cambio. El (MR-D8-IF) plásmido, un control positivo para la expresión de EGFP, mutación resistente en marco se construyó mediante la supresión de 1 pb de
D8S321
secuencia en el MR-D8-de plásmidos utilizando Quikchange II sitio-dirigido kit de mutagénesis (Stratagene, La Jolla, CA).
hMSH3
shRNA construcción
hMSH3
shRNA construir y su vector vacío emparejado fueron amablemente proporcionados por El Dr. Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Dallas, TX. La secuencia GFP de esta construcción se eliminó por digestión de la construcción con
Apa I y
Pac
I, de llenar usando el fragmento de Klenow para formar extremos romos, y después de realizar la ligadura de extremos romos. Para hacer un control mezclado, la secuencia de GFP del vector vacío se eliminó primero como se describe anteriormente y la secuencia codificada, retirado de una construcción disponibles en el mercado (GeneCopoeia, Rockville, MD), se insertó en el vector a través de
EcoR
I y
Xho I sitios
. La existencia y la exactitud de la lucha y /o
hMSH3
shRNA secuencias de los plásmidos fueron confirmadas por secuenciación del ADN.
La transfección y la generación de líneas celulares estables
Las células se transfectadas con los diferentes pIREShyg2-
D8S321
EGFP y pIREShyg2-
D20S82
EGFP plásmidos (descritos en la Tabla S1) mediante el uso de kits de nucleofector (Amaxa, Colonia, Alemania). Las líneas celulares estables se establecieron por selección de higromicina B (Invitrogen). Cada línea celular se sometió a una sola célula de clasificación mediante FACS ARIA (Becton Dickinson, San Jose, CA) para establecer clones individuales. Todos los clones de células individuales se examinaron mediante secuenciación del ADN para garantizar la existencia y exactitud de la construcción EMAST que llevaban.
hMSH3
desmontables células (KD), células MMR-competente (SW480) que lleva D8-dE y /o D8-MR-de las construcciones fueron transfectadas con plásmidos scramble acogida o
hMSH3
específico de shRNA utilizando Fugene 6 (Roche, Mannheim, Alemania), seguido de puromicina (Invitrogen) de selección para establecer estable líneas. Dos clones independientes de cada grupo se utilizaron para los estudios.
análisis de la mutación por citometría de flujo
Cuatrocientos mil células transfectadas estables no fluorescentes se clasificaron en cada pocillo en placas de 6 pocillos por