Extracto
esporádica carcinoma colorrectal aparición temprana (EOCRC), que tiene, por definición, no hereditaria identificado predisposición es un problema creciente que sigue siendo poco conocida. El análisis molecular podría mejorar la identificación de los distintos subtipos de cáncer colorrectal (CCR) con implicaciones terapéuticas y por lo tanto puede ayudar a establecer que EOCRC esporádica es una entidad distinta. De 954 pacientes resecados para el CCR en nuestra institución, se seleccionaron 98 pacientes. Los pacientes de 45-60 años fueron excluidos para ayudar a definir "jóvenes" y "viejos" grupos. Treinta y nueve casos de EOCRC esporádica (patients≤45 años con tumores de microsatélites estables) se compararon con los dos microsatélites estables tumores de pacientes de edad avanzada (36 casos, los pacientes & gt; 60 años) y para grupos de pacientes con inestabilidad de microsatélites. Cada grupo fue probado para
TP53
,
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
mutaciones y la presencia de un fenotipo methylator. Perfiles de expresión génica también se utilizaron para el análisis de la vía. En comparación con los microsatélites estables CRC de pacientes viejos, esporádica EOCRC se caracteriza por la localización distal, metástasis sincrónicas frecuentes y adenomas sincrónicos poco frecuentes, pero no tienen las características morfológicas específicas. Una historia familiar de CCR fue más frecuente en los pacientes esporádicos EOCRC a pesar de la falta de condiciones hereditarias identificados (p = 0,013). Los estudios genéticos también mostraron la ausencia de
BRAF
mutaciones (p = 0,022) y el fenotipo methylator (p = 0,005) en EOCRC esporádica en comparación con pacientes de mayor edad. La expresión de genes implicados vías clave como catenina Wnt /beta, MAP quinasa, la señalización del factor de crecimiento (EGFR, HGF, PDGF) y la vía TNFR1 en EOCRC esporádica. activación de señalización /beta catenina Wnt aberrante fue confirmada por inmunotinción beta catenina nuclear (p = 0,01). Este estudio sugiere fuertemente que EOCRC esporádica es un clínico-molecular distinta entidad que presenta como una enfermedad distal y agresiva asociada con la inestabilidad cromosómica. Además, varias vías de señalización, incluyendo la vía de TNFR1 se han identificado como potenciales biomarcadores tanto para el diagnóstico y tratamiento de esta enfermedad
Visto:. Kirzin S, Marisa L, Guimbaud R, De Reynies A, Legrain M, Laurent -Puig P, et al. (2014) esporádica inicio temprano del cáncer colorrectal es una específica subtipo de cáncer: Un morfológica, molecular y estudio genético. PLoS ONE 9 (8): e103159. doi: 10.1371 /journal.pone.0103159
Editor: Pe Yean Cheah, el Hospital General de Singapur
Recibido: 18 Marzo, 2014; Aceptado: June 26, 2014; Publicado: 1 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Kirzin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Los datos están disponibles en el NCBI, número GEO repositorio de adhesión:. GSE39084
Financiación: Este trabajo fue apoyado por una beca de la Ligue Contre le Régionale Cáncer, Comité du Gers y el programa Carte d'Identité des Tumeurs de la Ligue Nationale Contra el cáncer. Los autores agradecen al Instituto Nacional del Cáncer Contre le por su apoyo a la genetista clínico y de laboratorio. Los autores agradecen a Cancéropôle Grand Sud-Ouest para proporcionar anotaciones clínicas. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es más frecuente en los adultos de edad avanzada con una edad media al diagnóstico de 70 años [1]. Sin embargo, de acuerdo con EE.UU. los registros de la incidencia de CCR en adultos jóvenes está aumentando constantemente, a una tasa del 1,5% anual entre 1992 y 2005 en los adultos de 20-49 años de edad [2]. CCR precoz inicio (EOCRC) es una enfermedad agresiva con pobre diferenciación y está clásicamente situado en el colon izquierdo. Las personas pueden estar predispuestas a través EOCRC enfermedades hereditarias y inflamatorias del intestino. Las formas hereditarias más bien definidas de CRC son el síndrome de Lynch y la poliposis adenomatosa familiar (FAP) que dan cuenta de 2-4% y menos del 1% de los casos de CCR totales, respectivamente [3]. La contribución relativa de las enfermedades inflamatorias del intestino y FAP a EOCRC es modesta desde ambas condiciones pueden ser fácilmente identificados por sus características clínicas y gestionados por el cribado y el tratamiento profiláctico de acuerdo con las directrices establecidas. Por el contrario, el síndrome de Lynch no muestra un fenotipo específico y con frecuencia conduce a carcinoma, que forman un tercio de los casos EOCRC [4]. Por lo tanto, la mayoría de EOCRC son casos esporádicos que carecen de marcadores genéticos que indican predisposición
CRC es una enfermedad heterogénea que está clásicamente dividido en tres sub-tipos [5], de acuerdo con los mecanismos moleculares de conducción su transformación:. ( i) la inestabilidad cromosómica (CIN), el mecanismo predominante, que se caracteriza por tumores de microsatélites estables (MSS), pérdida de heterocigosidad y los principales cambios cromosómicos en genes supresores de tumores y oncogenes [9]; (Ii) Un cambio epigenético conocida como la isla CpG methylator fenotipo (CIMP) que hace que el silenciamiento transcripcional por la metilación de las regiones ricas en CpG en el promotor de los genes supresores de tumores. CIMP es responsable de la gran mayoría de los tumores MSI esporádicos a través de silenciamiento del promotor del gen MMR
hMLH1
[7], [8]; (Iii) la inestabilidad de microsatélites (MSI), que es el sello de síndrome de Lynch y se caracteriza por la acumulación de mutaciones de desplazamiento de marco en las secuencias de microsatélites debido a una deficiencia en la reparación de apareamientos erróneos (MMR) genes [6]. Sin embargo, esta clasificación molecular utilizada actualmente del CRC se basa en sólo unos pocos marcadores de ADN común.
Hasta el momento los marcadores moleculares de EOCRC esporádica no se han explorado a fondo y sus contribuciones individuales hacia la carcinogénesis no se han caracterizado. perfil de expresión análisis del genoma (GEP) podría mejorar la clasificación molecular de la CRC y ayudar a identificar entidades clínicas y marcadores biológicos que podrían predecir la respuesta al tratamiento. Recientemente hemos utilizado este tipo de enfoque para identificar seis subtipos moleculares de CRC que surgen a través de vías biológicas distintas [10].
El objetivo del presente estudio fue investigar EOCRC esporádica mediante un enfoque integrado que combine clínico exhaustivo -pathological de datos con análisis genéticos con el fin de determinar las características clínicas y perfiles moleculares de esta entidad específica. Para este estudio se identificó por primera vez un grupo homogéneo de EOCRC esporádica que se define por tener un diagnóstico de cáncer en menores de 45 años de edad, que no tienen predisposición hereditaria identificados hasta la CRC y que tiene un perfil SMS. A continuación comparó datos específicos genética, epigenética y la expresión de genes de este grupo con la de otros grupos bien definidos de CRC.
Materiales y Métodos
Este estudio fue diseñado para investigar los casos esporádicos EOCRC ( MSS tumores de pacientes jóvenes) y compararlos con los tumores del SMS de contrapartida de los pacientes de mayor edad. También se incluyeron los CRC con MSI (ambos de pacientes jóvenes y ancianos), ya que constituyen un modelo bien caracterizado de CRC oncogénesis.
Paciente y muestra la selección
Entre abril de 1999 y diciembre de 2005, 954 los pacientes fueron tratados y seguidos durante CRC en nuestra institución. Los pacientes menores de 45 años (de aquí en adelante referidos como "pacientes jóvenes") y más de 60 ( "viejo") fueron considerados para la comparación. Los criterios de exclusión fueron: tejido congelado disponible; diagnóstico de FAP o IBD; preoperatoria quimioterapia /radioterapia; muestras que contienen células tumorales de menos de 50%; y desconocido estado de MMR. Debido a la alta proporción de tumores en etapa IV del SMS de pacientes jóvenes, SMS tumores de pacientes jóvenes y ancianos fueron agrupados de acuerdo a la etapa del tumor. Después de la selección de la muestra, 98 pacientes estaban disponibles para el estudio, como se muestra en la Figura 1. Se definieron cuatro grupos de pacientes: MSS-Y (MSS-tumoral & lt; 45 años), 39 casos; MSI-Y (MSI tumoral & lt; 45 años), 9 casos; MSS-O (MSS tumores & gt; 60 años), 36 casos; y el grupo MSI-O (MSI tumores & gt; 60 años)., 14 casos
diagrama que representa Consort la selección de los pacientes de una sola institución, sobre la base de tejido congelado disponible y después de aplicar los criterios de exclusión. Cuatro grupos se definieron teniendo en cuenta la edad y el estado de MMR. El estudio fue diseñado para permitir la comparación de MSS CRC de inicio temprano con otros grupos bien definidos de CRC. FAP: poliposis adenomatosa familiar. EII: Enfermedad Inflamatoria Intestinal. MMR estado: Estado de reparación de genes. SMS: microsatélites estables. MSI:. Microsatélites inestable
Comité de Ética Aprobación
A todos los pacientes se registraron prospectivamente en una base de datos central y segura declarado a la Comisión Nacional Informática y Libertad (1.365.952). El uso de los tumores recogidos fue aprobado por la junta del hospital de Toulouse (CRB-cáncer Toulouse, CC-2008-463, AC-2008-820, CPP2). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos.
Los parámetros del estudio
Setenta y nueve variables de interés fueron extraídos de la base de datos y analizados. Estos datos clínicos incluidos (pedigrí familiar, la localización del cáncer, presentación clínica en el diagnóstico, las modalidades de tratamiento, la supervivencia) y las características del tumor (datos patológicos completos, presencia de adenoma sincrónico en la pieza resecada, estado MMR, la presencia de alteraciones genéticas y epigenéticas). El seguimiento clínico de los pacientes se realizó de acuerdo con las directrices nacionales publicados [11]. Las curvas de supervivencia se establecieron a partir de la fecha de diagnóstico de acuerdo a los cálculos de Kaplan-Meier. Los detalles de las variables estudiadas se proporcionan en la Tabla S1.
Estado de la triple vírica y el pedigrí familiar
Estado de la triple vírica se determinó el momento del diagnóstico (previo al estudio) mediante la evaluación de estado de inestabilidad de microsatélites mediante una PCR y por Pentaplex mediante inmunohistoquímica (IHC) para probar para la expresión de MLH1, MSH2 y MSH6, como se describe anteriormente [12]. deficiencias de reparación de genes (tumores dMMR) fueron definidas por MSI y /o pérdida de la expresión de una de las proteínas MMR, mientras que los tumores (GMANS) MMR dominio correspondieron a tumores MSI-bajos o SMS que expresan las proteínas MMR.
el árbol genealógico de todos los pacientes jóvenes se evaluó mediante un único genetista clínico (RG). Las pruebas genéticas para las 2 principales genes MMR
hMLH1
y
hMSH2
se llevó a cabo en el caso de los tumores MSI o cuando la historia personal o familiar de cáncer estaba presente en pacientes jóvenes. El diagnóstico del síndrome de Lynch se confirmó formalmente por la identificación de una mutación germinal deletérea en un gen MMR. Los casos de tumores MSI que muestran una ausencia de MSH2 o MSH6 tinción con IHC se consideraron como síndrome de Lynch probable.
El análisis mutacional
El genotipado de mutaciones clave que ocurren en el cáncer colorrectal (
KRAS
,
BRAF
,
TP53
y
PI3KCA
) se llevó a cabo después de la extracción de ADN a partir de tejido congelado. Las siete mutaciones más frecuentes en los codones 12 y 13 del
KRAS
, y la mutación V600E en el codón
BRAF
se evaluó por hibridación usando sondas Taqman alélica, tal como se describe anteriormente [13]. La secuenciación directa de
TP53
exones 5 a 9 y
PI3KCA
exones 9 y 20 se llevó a cabo en paralelo con la técnica de Sanger (Beckman Coulter, Danvers, MA, EE.UU.).
methylator evaluación fenotipo
perfiles CIMP se determinaron utilizando un panel de cinco marcadores como se describe por Weisenberger
et al
:
CACNA1G
,
IGF2
,
Neurog1
,
RUNX3
y
SOCS1
. Después de tratamiento con bisulfito del ADN, se realizaron dos PCR específicas de metilación múltiplex. Análisis de fragmentos se llevó a cabo por electroforesis capilar en un secuenciador automático (Beckman Coulter, Danvers, MA, EE.UU.). Methylator casos fenotipo CIMP-positivo (+) tenía 3 o más metilados mientras que los promotores CIMP-negativos tenían menos de 2 metilado promotores, definida según los criterios establecidos [14].
extracción de RNA y análisis de microarrays
El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se comprobó la pureza, la integridad y la cantidad. Las muestras fueron luego se amplifican, se etiquetan y se hibridan en una GeneChip plus2 Affymetrix Genoma Humano U133, después de un ciclo de protocolo objetivo de etiquetado del fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). Los chips fueron escaneados con un escáner Affymetrix GeneChip 3000 y cruda intensidad fueron extraídos de las imágenes posteriores utilizando el software GCOS 1.4 (Affymetrix). Los datos se normalizaron utilizando el método robusto de promedio multiarray (RMA), implementado en el paquete R affy [15]. Los datos están disponibles en el NCBI Gene Expression Omnibus repositorio (número de acceso: GSE39084).
Sin análisis
Clase descubrimiento fue realizado por la agrupación consenso de los perfiles de expresión, tal como se describe anteriormente [16]. Probe conjuntos se filtraron primero para mantener los expresados (es decir, con un valor de intensidad normalizada sobre 15) en al menos 10% de las muestras con una varianza significativamente mayor que la varianza media de todos los conjuntos de sonda (p & lt; 0,01). Entonces, se obtuvieron 7 listas que incluía 1% a 50% de la sonda fija más variantes (basado en el robusto coeficiente de variación). Para cada lista sonda conjunto, las muestras se agruparon utilizando correlación de Pearson-1 para la distancia métrica y la vinculación Ward, obteniéndose 7 dendrogramas. Particiones en racimos k (k de 2 a 8) fueron derivados de cada dendrograma y una partición de consenso se calculó para cada valor de k, produciendo 7 particiones de consenso.
análisis supervisado
Las asociaciones entre la clínica y anotaciones moleculares y grupos de muestras se ensayaron para determinar la significación estadística mediante la prueba de Chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher cuando sea apropiado. Los genes expresados diferencialmente entre los tumores de pacientes jóvenes y ancianos del SMS fueron seleccionados en base a Limma los valores de p de la prueba t ajustados para múltiples pruebas por el Benjamini & amp moderado; método de Hochberg (& lt; 0,05) [17]. Caminos de la base de datos Biocarta se probaron para el enriquecimiento de los genes desregulados mediante la combinación de los métodos siguientes: Globaltest (R globaltest paquete), SAM-GS, y Tuckey [18], [19]. Los valores de p de cada método se convirtieron en filas y el rango promedio se calculó para ordenar las vías.
catenina beta activación de la vía
La inmunohistoquímica se realizó en bloques fijadas con formol y embebidos en parafina a partir de los 98 pacientes del estudio con el anticuerpo monoclonal de ratón beta catenina (clon 14, BD Biosciences, dilución 1/200, Ventana XT de tinción automática (Tucson, AZ, EE.UU.). Todas las diapositivas fueron revisados por dos patólogos ciego a los grupos de pacientes ( JS y SK). la activación de la vía de señalización beta catenina fue definida por una fuerte tinción nuclear en más de 50% de las células tumorales, con o sin tinción citoplásmica difusa y con una pérdida de la tinción de membrana de la célula [20].
resultados
características clínico-patológicas de esporádica EOCRC
El grupo EOCRC esporádica consistió en 39 pacientes, distribuidos de la siguiente manera: 17 eran de 40-45 años de edad, 13 eran de 35-40 años, 5 eran 30-35 años, 2 eran 25-30 años y 2 eran menores de 25 años de edad. Esta distribución de edad es compatible con los datos publicados en el registro de Estados Unidos [1]. En comparación con los tumores de los pacientes de edad del SMS, EOCRC (SMS pacientes jóvenes) esporádicos muestran rasgos distintivos. tumores rectales fueron más abundantes en EOCRC esporádico (41% frente a 8,3%, p = 7,4
e-04) con adenomas menos frecuentes observados en las piezas resecadas (8% frente a 33%, p = 0,013). Cabe destacar que 15 (38%) pacientes esporádicos EOCRC tenían una historia familiar (de primer o segundo grado) de CRC en comparación con 3 (9%) en el grupo de edad de los pacientes del SMS (p = 0,013). Un análisis del pedigrí de estos 15 pacientes reveló que 3 de ellos tenía un patrón de herencia autosómica dominante de transmisión clara con varios miembros de la familia afectados. Dos de los 3 eran de la misma familia, pero sin mutación germinal ha sido identificado hasta la fecha. Los restantes 12 pacientes tenían un modo de transmisión no determinado con sólo un miembro de la familia que tiene ascendente CRC, por lo general a una edad más avanzada (& gt; 60 años). De acuerdo con las recomendaciones francesas,
MUTYH
análisis de la mutación se realizó por sólo 1 paciente que presentó el 8 adenoma, pero este análisis fue negativo [21]. Se observó una historia personal de CRC sólo en pacientes de edad (incluyendo tanto el SMS y los tumores MSI). Todos los tumores de MSI pacientes jóvenes surgieron en el contexto del síndrome de Lynch, y 3 pacientes (21,5%) del grupo de edad de MSI también eran pacientes Lynch. Al considerar toda la población de estudio, las otras diferencias significativas entre los grupos estaban vinculados a la deficiencia de MMR, es decir, más frecuente la localización proximal (p = 2,0
e-05), una pobre diferenciación celular (p = 0,033) y el componente mucinoso frecuente ( p = 0,012). Las principales características de la población estudiada se presentan en la Tabla 1.
EOCRC esporádica es una enfermedad agresiva con frecuencia se presentan con metástasis al momento del diagnóstico. La ubicación de los tumores metastásicos era predominantemente en el hígado y los pulmones, como se observa para CRC. Se observó un perfil específico de supervivencia para cada grupo de pacientes, con una supervivencia general mejor para MSI que los pacientes del SMS. A pesar de una alta carga de la metástasis (con el 23,1% frente al 5,6% que tiene múltiples sitios de metástasis al momento del diagnóstico), los pacientes EOCRC esporádicos presentan una mejor supervivencia global a los 5 años de edad pacientes del SMS, aunque esto no fue significativo (69% versus 42%, p = 0,09). La tasa de supervivencia global a los cinco años fue aproximadamente el mismo para los pacientes MSI, aunque MSI jóvenes pacientes experimentaron recurrencia temprana más frecuente (Figura 2)
.
Cada grupo tenía un perfil específico de la supervivencia global, aunque ninguno fue significativamente diferente de los demás (p = 0,15). SMS: microsatélites estables. MSI: microsatélites inestable
Características genéticas y epigenéticas de esporádicos EOCRC
perfiles mutacionales de
KRAS
, TP53
BRAF
y
. , España y el estado CIMP se establecieron en todos los pacientes (Tabla 2).
PI3KCA
genotipificación se realizó durante 74 tumores. El perfil mutacional de los tumores esporádicos EOCRC fue similar a la de los SMS tumores de pacientes de edad para
KRAS
,
TP53 Opiniones y
PIK3CA
genes, pero era claramente diferente de
BRAF
mutaciones y perfiles CIMP. tumores esporádicos ni EOCRC contenida
BRAF
mutaciones (p = 0,022), ni se muestra un CIMP + perfil (p = 0,005) en comparación con los tumores de los pacientes de edad del SMS. MSI tumores en pacientes de edad tenían una alta tasa de
BRAF mutación
(36%) y con frecuencia muestran una CIMP + perfil (62%). MSI jóvenes pacientes diferían de los pacientes de edad MSI por la ausencia de un fenotipo methylator (p = 0,006) y
BRAF
mutaciones.
Análisis del transcriptoma
Microarray datos fueron obtenida para 70 pacientes. Los análisis revelaron que no supervisadas, con independencia del número de grupos y el porcentaje de genes variantes se usan, las particiones subyacentes fueron consistente y fuertemente asociados con el estado y los grupos de MMR. Otras variables asociadas significativamente con las particiones no supervisadas fueron la localización del tumor, estado CIMP y BRAF mutado. Estas variables fueron ellos mismos estrechamente asociados con el estado de MMR. La edad se ligeramente asociado con algunas particiones sin supervisión (obtenidos utilizando 5% y el 20% de la mayoría de genes diferentes). La partición de consenso en los 5 grupos estaba relacionada más estrechamente con los cuatro grupos definidos en el estado de MMR y la edad (Figura 3). Grupo 1 (C1) se compone casi exclusivamente de los tumores deficientes de MMR. Cluster C2 se enriqueció con MMR competente y tumores BRAF mutado. Las agrupaciones C3 y C4 contenían más CIMP +, C4 está casi exclusivamente compuesto de tumores MMR dominio de los pacientes de edad. Grupo 5 (C5) se enriqueció en los tumores esporádicos EOCRC que se encuentran en el colon izquierdo
Clasificación no supervisada de los perfiles de expresión:. Dendrograma de la agrupación más cercana a la partición de consenso para k = 5. Leyenda: io, MSI /Viejo ; iy, MSI /Young; Por lo tanto, SMS /Viejo; sy, MSS /Young; d, deficiencia de MMR; p, dominio del MMR; R, colon derecho; L, colon izquierdo; Re, el recto; M, mutado; . W, de tipo salvaje
A continuación llevó a cabo un análisis supervisado de SMS tumores (n = 54) que proporcionaron una lista de 297 conjuntos de sonda que representan el 219 genes altamente discriminatorias (p & lt; 0,001). Este conjunto proporciona una clara distinción entre los tumores esporádicos EOCRC y tumores de los pacientes del SMS de edad (Figura 4). Para una descripción completa de estos genes se proporciona en la Tabla S2. La única clave gen oncogénesis CRC que fue altamente desregulado en EOCRC esporádica era la beta catenina (
CTNNB1
). El elevado número de genes discriminatorios nos permitió llevar a cabo vía de análisis para comprender mejor la carcinogénesis EOCRC esporádica. Cuarenta y nueve vías fueron significativamente enriquecido para la expresión diferencial de genes en EOCRC esporádica en comparación con los SMS tumores de pacientes de edad. Una descripción completa de ellos se proporciona en la Tabla S3. Entre ellos, 20 estaban involucrados en la señalización celular, 10 en la inflamación y apoptosis, 7 en la adhesión y /o la motilidad, 7 en la biología del desarrollo y 3 en la proliferación celular (Figura 5). Varias vías que eran hasta reguladas en esporádicos EOCRC estaban relacionados con las principales vías de señalización implicadas en el CCR como MAP quinasa y PI3KCA /AKT o están relacionados con factores de crecimiento (EGF, PDGF y HGFR) y la angiogénesis (VEGF). Dos vías principales implicados en la adhesión y /o la regulación de la motilidad (vías de señalización de integrinas y la señalización de la adhesión célula a célula) fueron reguladas en EOCRC esporádica. Curiosamente, la mayoría de las vías relacionadas con la inflamación y /o apoptosis que se han encontrado hasta regulado en EOCRC esporádica están directa o indirectamente relacionadas con la ruta de TNF-R1 (vía TNFR1, el VIH-1Nef, vía de señalización FAS, TNF /estrés relacionado con la señalización) .
el mapa de calor muestra la expresión de 219 genes. Sobre la base de los niveles de expresión, los genes se agrupan en cuatro grupos de genes altamente sobreexpresados (cajas rojas rodeadas por un borde negro) y un grupo de genes underexpressed en tumores MSS (cajas azules rodeado por un borde negro) de pacientes jóvenes en comparación con los tumores del SMS desde pacientes de mayor edad. SMS: microsatélite estable. MSI:. La inestabilidad de microsatélites
Pathway análisis agrupando los 49 vías enriquecido significativamente mayor para la expresión génica diferencial entre tumores esporádicos EOCRC y SMS de los pacientes de edad. Vías se agruparon en cinco categorías principales, a saber, la adhesión celular /la motilidad, la inflamación /apoptosis, proliferación celular, la señalización celular y la biología del desarrollo. La distribución de las principales vías canónicas entre las categorías se detalla así como su orden de importancia. Este orden de clasificación se indica mediante el símbolo#seguido del número de la fila (# 1 significa que esta vía es la más desregulado entre las 49 vías).
beta catenina inmunohistoquímica
La microarrays de datos por encima de la beta catenina identificados para ser el único gen clave oncogénesis CRC desregulado en EOCRC esporádica. Por lo tanto, tratamos de evaluar la activación de la beta catenina mediante inmunohistoquímica. Todos los casos de tumores del SMS de pacientes jóvenes (39 casos) y 33 casos (33/36) de los tumores del SMS de los pacientes de edad fueron validados para la activación de la beta catenina mediante inmunohistoquímica. la activación de la beta catenina se identificó en 17 casos (44%) de los pacientes y 5 casos (15%) MSS-joven de MSS de edad, los pacientes (p = 0,01) con una tinción nuclear +/- citoplasmática (Figura 6).
A. Corte transversal de un tumor de un paciente MSS-Old sólo muestra la tinción de membrana. B. Sección transversal de un tumor de un EOCRC esporádica (MSS-Young) paciente muestra una fuerte tinción citoplasmática y nuclear con una pérdida de la tinción de la membrana, lo que refleja la activación catenina Wnt /beta.
Discusión
los resultados del presente estudio sugieren que esporádica EOCRC es una entidad clínica y molecular distinta. Por primera vez, proporcionamos un análisis integrado de los datos clínicos extensos y la genómica de una serie cuidadosamente seleccionadas de pacientes consecutivos que habían sido tratados y seguidos en una sola institución. Este enfoque traslacional nos ha permitido precisar la descripción hasta ahora limitado a esta forma específica de CRC y arrojar una idea de su biología tumoral específica.
Por el momento no existe una clara definición aceptada de la edad temprana de inicio en el campo de CCR. Por lo tanto, la mayoría de los estudios que informan sobre este tema incluyen a los pacientes en los 40-50 años de rango de edad [22], [23]. Sin embargo, hay un aumento progresivo de la frecuencia de CRC entre 40 y 50 años de edad por lo que es probable que en estos estudios no es una mezcla de entidad EOCRC específica y finales de CRC inicio. Para abordar esta cuestión se utilizó una definición más restrictiva de ambos CRC aparición temprana y tardía: pacientes entre 45 y 60 años de edad fueron excluidos con el fin de garantizar una partición clara de las dos entidades y evitar cualquier superposición de estas dos formas de CRC. Otro factor de confusión en el análisis de EOCRC en muchos estudios es la falta de distinción entre las formas hereditarias de CCR, en particular el síndrome de Lynch, y la verdadera forma esporádica de CRC. Sin embargo, el síndrome de Lynch en sí representa un tercio de los casos EOCRC [24]. Por lo tanto, en el presente estudio un pedigrí completo fue establecida por un genetista clínico para todos los pacientes jóvenes. Se identificaron los casos de síndrome de Lynch utilizando criterios sólidos y estaban claramente separadas de EOCRC esporádica. A pesar de ello, en este estudio los pacientes esporádicos EOCRC tenían una alta tasa de historia familiar (38%). Una minoría de los presentó con una herencia autosómica dominante de transmisión (8%), que probablemente corresponde a una enfermedad hereditaria para la cual aún no se ha identificado la susceptibilidad genética (síndrome X). Por otra parte, se reconoce cada vez más que unos pocos loci predisposición menor podría ser responsable de una forma compleja de CRC herencia [25]. Por lo tanto, una predisposición genética, tales también podría estar implicado en algunos pacientes con EOCRC. Esta hipótesis está apoyada por la baja tasa de adenoma sincrónico se observó en los pacientes EOCRC esporádicos que podría reflejar la carcinogénesis acelerado secundaria a condiciones predisponentes.
Desde hace tiempo se reconoce que las particularidades morfológicas de EOCRC son pobres diferenciación celular, el coloide componente y linfocítica reacción estroma [22], [26] - [29]. Una vez más, estos datos se probable confundidos por la inclusión de pacientes con síndrome de Lynch, que normalmente se asocian con estas características histológicas. En los dos únicos estudios que han analizado específicamente MSS-jóvenes pacientes (uno con 24 y otro con 55 casos), no hubo asociación entre la histología mucinosa, pobre diferenciación, los linfocitos infiltrantes de tumor y de aparición temprana de la enfermedad [30], [ ,,,0],31]. Nuestro estudio ha confirmado estos datos y, además, nos muestran que la mala diferenciación celular y un componente mucinoso están claramente asociados con el estado de MSI independientemente de la edad del paciente. Por el contrario, no se observó una asociación entre la invasión linfática, invasión perineural o histología de células en anillo de sello con esporádicos EOCRC, como se informó en los dos estudios anteriores mencionados anteriormente (datos no mostrados) [30], [31].
Desde el punto de vista clínico, nuestros resultados están de acuerdo con la descripción clínica de EOCRC esporádica recientemente publicado por Chang et al .: EOCRCs esporádicos se presentan como tumores con localización distal y enfermedad metastásica frecuente [30]. En el presente estudio, la sorprendentemente alta tasa de enfermedad metastásica sincrónica en el grupo EOCRC (41%) nos llevó a coincidir viejos pacientes del SMS para la etapa del tumor a fin de no polarización comparaciones de expresión génica. Aunque no es estadísticamente significativa, los pacientes jóvenes tienden a tener mejores tasas de supervivencia según la etapa de la enfermedad en comparación con los pacientes de mayor edad. Por supuesto, los pacientes más jóvenes son propensos a someterse a una terapia más agresiva incluyendo la quimioterapia o la resección quirúrgica repetida para la enfermedad metastásica que pueden mejorar el pronóstico más pobre dada por EOCRC. Aunque en parte contradictorias con los estudios más antiguos, algunos de los cuales eran los análisis globales basadas en registros, el presente trabajo ofrece resultados fiables por las mismas razones antes mencionadas [32] - [35]. En general, EOCRC esporádica presenta como una enfermedad agresiva con la ubicación distal, estadio tumoral alto y sin especificidad histológico clara.
El presente estudio es el primero en proporcionar una visión general de la frecuencia de un panel estándar de mutaciones genéticas, así como las alteraciones epigenéticas específicamente para EOCRC esporádica. Establecidas las clasificaciones de la carcinogénesis colorrectal, utilizando una combinación de mutaciones de KRAS y BRAF con CIMP y estado de MSI, permiten la identificación de tres a cinco subgrupos moleculares distintos de CRC [36], [37]. Por ejemplo, KRAS y P53 mutaciones se asocian clásicamente con cánceres colorrectales-CIN mientras que las mutaciones de BRAF están fuertemente asociados con las formas esporádicas de CIMP + /MSI + CRC. Unos pocos estudios han investigado las tasas de mutación en casos esporádicos y EOCRC demostrado que de 0 a 8% tiene
BRAF
mutaciones, de 0 a 4%
PIK3CA mutaciones
, de 6 a 78%
KRAS
mutaciones, y 64%
TP53
mutaciones [30], [31], [37] - [40]. Hemos identificado una tarifa para
KRAS
y
TP53
mutaciones (respectivamente 37% y 44%) en forma similar a la de los tumores de CIN pero con una ausencia de
BRAF
mutaciones y hay evidencia de un fenotipo methylator [41]. Las discrepancias con los datos de la literatura sobre las tasas de mutación en EOCRC podrían estar vinculados a la ausencia de una clara distinción entre los tumores MSS y MSI en estudios anteriores que pueden haber afectado a las tasas de mutación, en particular para los
KRAS
y
BRAF
[39], [40]. En general, nuestro estudio genético favorece la hipótesis de que EOCRC esporádica es un subgrupo de tumores CIN con ninguno de
BRAF mutación
ni methylator fenotipo.
La agrupación obtenida por análisis no supervisado mostró que las diferencias en el gen los perfiles de expresión (GEP) se determina principalmente por el estado triple vírica y en menor medida por el estado CIMP, mientras que la edad tenía poco impacto. Estos resultados han sido previamente demostrada por estudios que muestran que los tumores MSI y SMS tienen perfiles de expresión diferencial, lo que valida los resultados actuales [42]. Sin embargo, a pesar de BPA fueron altamente significativas en los análisis supervisados restringido a los tumores del SMS, que muestra un conjunto de 219 genes que diferencian a partir de pacientes de edad joven, los resultados de arrays de expresión deben ser considerados con cautela, ya que las listas de genes con frecuencia no logran reproducirse. En contraste, los análisis de la vía han demostrado ser reproducible, y llevar significado biológico de genes arrays de expresión [43]. Numerosas vías clásicamente implicados en la oncogénesis CRC son regulados hasta en EOCRC esporádica, como MAP-quinasa, mTOR y VEGF /la angiogénesis, pero vías relacionadas con la señalización del factor de crecimiento también están involucrados (EGF, receptor de HGF y PDGF). También se identificaron
CTNNB1
como uno de los más exceso de genes expresados en MSS-jóvenes pacientes en comparación con los pacientes de edad MSS y utilizamos técnicas de inmunohistoquímica para demostrar que esto conduce a una sobre-activación de la beta catenina en EOCRC esporádica.