Extracto
Los niveles de proteínas que controlan el ciclo celular están reguladas por la degradación mediada por ubiquitina a través del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) por ligasas E3 ubiquitina-sustrato específico. El inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, p27kip1 (p27), que bloquea el ciclo celular en G1, se ubiquitylated por el E3 ligasa SCF Skp2 /Cks1 para la degradación por el SAI. A su vez, Skp2 y Cks1 se ubiquitylated por la ligasa E3 complejo APC /Cdh1 para la destrucción de lo cual se mantienen abundantes niveles de p27 nuclear. Anteriormente puso de manifiesto que perpetua la degradación proteasomal de p27 es un evento temprano en la carcinogénesis endometrial tipo I (ECA), un estrógeno (E2) inducida por el cáncer. Los presentes estudios demuestran que E2 estimula el crecimiento de las líneas de la CEPA celulares y células epiteliales endometriales primarios normales (Ingeniería Eléctrica e Informática) e induce la fosforilación de MAPK ERK1 /2 dependiente de p27 en Thr187, un requisito previo para p27 ubiquitylation por Nuclear SCF Skp2 /Cks1 y posterior degradación. Además, disminuye el E2 E3 ligase [APC] Cdh1 dejando intacta la Skp2 y Cks1 para causar la degradación de p27. Además, golpeando hacia abajo Skp2 impide E2 inducida por la degradación de p27 y la estimulación del crecimiento lo que sugiere que la patogénesis de la ECA E2 inducida depende de la degradación mediada por Skp2 de p27. Por el contrario, la progesterona (Pg) como un inhibidor de la proliferación endometrial aumenta p27 nuclear y Cdh1 en EECs primarias y células de ECA. Pg, también aumenta Cdh1 unión a APC para formar el E3ligase activo. Llamar a la puerta abajo Cdh1 evita la estabilización inducida por Pg de p27 y la inhibición del crecimiento. En particular, ni E2 ni Pg afectados transcripción de Cdh1, Skp2, Cks1 ni p27. Estos estudios proporcionan nuevos conocimientos sobre la regulación hormonal de la proliferación celular a través de la UPS. Los datos implica que la prevención de la degradación de p27 nuclear mediante el bloqueo de la degradación mediada por Cks1 Skp2 /o el aumento de p27 Cdh1 para mediar la degradación de Skp2-Cks1 son posibles estrategias para la prevención y el tratamiento de la CEPA
Visto:. Huang KT, Pavlides SC, J Lecanda, SV en blanco, Mittal KR, oro LI (2012) de estrógeno y progesterona a regular los niveles p27KIP1 a través del sistema ubiquitina-proteasoma: Implicaciones patogénicas y terapéuticas para el cáncer endometrial. PLoS ONE 7 (9): e46072. doi: 10.1371 /journal.pone.0046072
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Abril, 2012; Aceptado: 27 Agosto 2012; Publicado: 27 de septiembre 2012
Copyright: © Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud, Instituto Nacional del cáncer, R01 CA 89175 www.nih.gov (a LIG); y la Universidad de Nueva York (NYU) Cancer Institute Proyecto piloto Grant (a LIG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el estrógeno (E2) estimula la proliferación del endometrio y la progesterona (Pg) suprime la proliferación impulsado por E2. En línea con los efectos de estas hormonas en el crecimiento, E2 induce tipo I carcinoma endometrial (ECA; tasa de: 85% del total de las ACE) y por el contrario, Pg se utiliza como un agente terapéutico para la hiperplasia endometrial, el precursor de la ECA [1]. CEPA es la neoplasia ginecológica más común con una incidencia de 136.000 casos por año a nivel mundial [2]. Al menos el 50% de las mujeres con hiperplasia atípica del endometrio (AEH) tiene concurrente CEPA; un 30% adicional progresará a la CEPA [3]. Como alternativa a la histerectomía, las progestinas inversa AEH y bien diferenciado de la CEPA que conduce a una alta tasa de embarazos exitosos [4], [5]. Una comprensión a nivel molecular de la regulación del crecimiento normales y malignos de endometrio por E2 y Pg es importante para avanzar en el campo en términos de definir nuevas dianas moleculares preventivas y terapéuticas para esta enfermedad. Hemos informado anteriormente de que la quinasa dependiente de ciclina (CDK) inhibidor, p27kip1 (p27) fundamental para el crecimiento de detención, no se da en las glándulas de ambos AEH y ECA tisular debido a la rápida degradación y perpetua de p27 a través del sistema ubiquitina proteasoma (UPS) que implican la pérdida de p27 se produce a principios de la oncogénesis de la CEPA [6]. En línea con los efectos opuestos de E2 y Pg sobre la proliferación, puso de manifiesto, además, que E2 causado la degradación proteasomal de p27 en EECs primarios mientras que Pg aumentó notablemente p27 en las células endometriales primarios epiteliales (EEC) y las células de la CEPA. Estos datos sugieren que la p27 es una diana molecular significativa implicado tanto en la patogénesis y el tratamiento de la CEPA.
Como un supresor de tumores y miembro de la familia Cip /Kip de inhibidores de CDK, la proliferación celular p27 detenciones en fase G1 el ciclo celular mediante el bloqueo de la actividad de ciclina /Cdk2 [7]. A diferencia de otros supresores de tumor y los reguladores negativos del ciclo celular, el gen p27
CDKN1B
, rara vez se encuentra mutado en los cánceres humanos, pero en lugar de p27 niveles están muy reguladas por modificaciones posteriores a la traducción [7]. La concentración, localización subcelular, y la fosforilación de aminoácidos específicos dentro de la molécula p27 en última instancia, regulan su efecto sobre la actividad Cdk2 y por lo tanto, la proliferación celular. traducción p27 y la estabilidad de la proteína son más altos en G0 y G1 temprana cuando p27 se une e inhibe la ciclina /Cdk2 para la detención del ciclo celular. A medida que el ciclo celular progresa a través de G1, disminuye incrementales en p27 aumentan la actividad de ciclina A CylcinE y unido a Cdk2, que activan los genes implicados en la progresión de G1 a S y el inicio de la replicación del ADN [8]. A concentraciones más bajas, p27 es fosforilada en T187 [p-p27 (T187)] por ciclina /Cdk2, que conserva p-p27 (T187) en el núcleo donde se ubiquitylated, que se requiere para la degradación de Skp2 /Cks1 de la SCF
Skp2 E3 ligase complejo [7], [9]. La fosforilación de p27 en T187 requiere anterior fosforilación de la tirosina de p27 en tres sitios en su dominio inhibidor CDK2, que se pueden conseguir por Abl o Src quinasas de la familia [10]. La fosforilación de p27 en otros residuos de aminoácidos por diferentes quinasas dicta su localización subcelular [7], [11], [12], [13], [14]. Ya sea que p27 se degrada en el núcleo o secuestrado en el citoplasma, la detención del ciclo celular no se producirá a menos que haya un nivel suficiente de p27 nuclear para inhibir Cdk2. Es importante destacar que, en el núcleo, p27 es supresora de tumor, sino en el citoplasma, es oncogénico como TI medica migración /metástasis [15], [16], [17]. Al igual que en la CEPA, la falta de p27 nuclear se ha encontrado en numerosas neoplasias epiteliales, [6], [7], [17], [18], [19] y ambos una relación inversa entre los niveles de p27 nuclear (bajo) y skp2 (alto) y el secuestro de p27 en el citoplasma se asocia con una menor supervivencia [7], [15], [20], [21]
el SCF (Skp1-Cul1-skp2 /fbox;. SCF -Skp2 /Cks1) y la promoción de complejos anafase (APC; APC /Cdh1; APC /Cdc20) son complejos de múltiples subunidades E3 ligase de la UPS que causan la degradación proteasomal de ciclina /Cdk y sus inhibidores de CDK con una sincronización precisa para sincronizar y regular la progresión y la detención del ciclo celular de una manera cíclica [22], [23]. conjugación de poliubiquitina de sustratos de proteína en lisinas se logra por tres enzimas, que transfiere /Activa (E1), los conjugados de (E2) y ligantes (E3) de la ubiquitina a la proteína para el reconocimiento selectivo y la degradación por el proteasoma 26S [24]. La proteína F-box, Skp2, es el módulo de reconocimiento de sustrato de SCF Skp2 /Cks1. interfaces de Skp2 con la proteína accesoria Cks1 formando una bolsa que identifica p-p27 (T187) y ubiquitylates la molécula de lisinas 134, 153, y 165 [22], [23], [25]; Skp2 y Cks1 son la limitación de velocidad de la degradación de p27 [9]. A finales de G1-S cuando el nivel de SCF Skp2 /Cks1 es más alta, y Skp2 Cks1 se convierten en blancos de reconocimiento de sustrato para APC /Cdh1 E3 ligasa compleja mediada por ubiquitina de degradación [26]. Esta degradación de Skp2 y Cks1 resulta en la acumulación nuclear de p27 para la detención en G1 [7], [9], [27]. Tomados en conjunto, un aumento de la APC /Cdh1 aumenta indirectamente los niveles de p27 nuclear, causando la degradación de Skp2 y Cks1 y esta disminución en Skp2 /Cks1 aumenta directamente los niveles nucleares de p27. Además, los niveles de Skp2 nuclear y p27 están inversamente correlacionados con la estimulación del crecimiento y la inhibición del crecimiento en el contexto de ser supresora prooncogenic o tumor, respectivamente.
Los presentes estudios muestran un nuevo mecanismo por el cual los esteroides ováricos regulan el crecimiento del endometrio, que es a través de la manipulación de los niveles de proteínas de la UPS y no por la transcripción. En concreto, nos informan de que E2 provoca la fosforilación de MAPK ERK1 /2 dependiente de p27 nuclear en T187 y disminuye la APC E3 ligasa /Cdh1 dejando Skp2 /Cks1 intacta a ubiquitylate p27 nuclear para la degradación que resulta en la estimulación de la proliferación de líneas celulares de Ingeniería Eléctrica e Informática y la CEPA . Por el contrario, aumenta Pg Cdh1 y su unión a APC; la ligasa APC /Cdh1 E3 causa la degradación proteasomal de Skp2 y Cks1, dejando intacta la inhibición del crecimiento de p27. Proponemos que p27 es una diana molecular significativa en el control de la hormona de crecimiento guiado del endometrio y que la prevención de la degradación de p27 por cualquiera de bloqueo Skp2 /Cks1 o aumentar Cdh1 son enfoques racionales para la intervención terapéutica de AEH y ECA.
Resultados
estrógeno y la progesterona tienen efectos opuestos sobre la proliferación celular y los niveles de p27, proteínas Skp2 y Cks1
en consonancia con el crecimiento hormonal efectos reguladores sobre el endometrio, que anteriormente mostró que las hormonas ováricas, estrógenos (E2) y progesterona (Pg; en presencia de E2 para aumentar los receptores de Pg [PR] para una respuesta fisiológica que imita el ciclo menstrual [6], [28], [29]) tuvieron efectos opuestos sobre los niveles de p27 en EECs primarios tales que E2 disminuyó los niveles de p27 a través de la degradación mediada por ubiquitina y por el contrario, Pg indujo un marcado aumento en los niveles de p27 en ambos EECs y las células primarias de ECA [6]. Desde Skp2 y Cks1, como componentes de la SCF
Skp2 E3 causa ligasa degradación de p27 [7], [9], [23], se propone que E2 y Pg serían similarmente inversamente efectuar los niveles de Skp2 y Cks1 para la estimulación y la inhibición de la proliferación celular, respectivamente. El uso de células ECC-1 que expresan tanto ER y PR, nos muestran que E2 indujo una disminución dependiente dependiente de la dosis y el tiempo de p27 en un 36% y un 33% con las respuestas de los picos del 1 y los niveles de Skp2 y Cks1 10 nM, respectivamente, e inversamente afectadas con un 5,4 veces y 3 veces aumento, respectivamente, con una respuesta máxima de 100 nM E2 (Figura 1A, B). La disminución de p27 se produjo a las 2 horas y se mantuvo durante 24 h, mientras que el aumento de la Skp2 y Cks1 produjo más tarde, con un pico a las 24 h. La línea celular KLE ER negativos no respondió a E2 pero en cambio, expresaron altos niveles de Skp2 y Cks1 dejando poco o nada de p27. El efecto contrario fue mostrado por Pg (más E2), que indujo un aumento de 2,8 veces en la p27 en 100 nM Pg y una concomitante 84% y 75% de disminución en Skp2 y Cks1, respectivamente (Figura 1C). p27 subido gradualmente de 12-48 h con un aumento de 3 veces a las 48 h que disminuyó a 2 veces a las 72 horas, mientras que la Skp2 y Cks1 disminuyeron con el tiempo y estaban casi ausentes por 24 h (Figura 1D). Es importante tener en cuenta, que los tiempos de exposición de los blots fueron menos después de la inducción por Pg en comparación con E2 ya que los niveles de p27 eran tan abundantes y no podría haber sido cuantificados en comparación con la actina. Por lo tanto, los niveles de p27 en el tiempo cero para las manchas que muestran disminuciones inducidas por E2 en p27 fueron sistemáticamente mayores y los que muestran los aumentos inducidos por Pg fueron consistentemente más bajos. Para estimar más cuantitativamente los efectos de E2 y por separado, Pg (más E2) en p27 y la estabilidad Skp2, células ECC-1 se incubaron con cicloheximida (CHX) solo o en presencia de E2 o Pg. Como se muestra en la Figura 1E, después de 6 h en cultivo, E2 disminuyó los niveles de p27 por 61% en comparación con 47% en CHX solo produciendo una disminución estimada en p27 vida media en 1,5 h (6,2 h frente a 4,7 h, el tiempo de incubación total = 18 h). En consonancia con la más rápida degradación de p27 inducida por E2, los niveles de proteína Skp2 se aumentaron en 1,3 veces en este punto de tiempo. Por el contrario, Pg estabiliza p27 como el nivel de proteína p27 se incrementó en 1,5 veces a las 6 h, mientras que los niveles de proteína Skp2 se redujeron en 45% en comparación con 24% en CHX solo rendimiento y disminución de Skp2 vida media estimada en 6,2 h (12,9 h frente a 6.7 h de incubación total de tiempo = 48 h).
Los detalles están en Materiales y Métodos y cada figura. A, E2 dosis-respuesta: células ECC-1 y KLE fueron tratadas con E2 y p27, Skp2, y los niveles de proteína Cks1 determinados por inmunotransferencia. B, curso de tiempo E2: células ECC-1 fueron tratadas con E2 durante los tiempos indicados y los niveles de proteína determina como antes. C, Pg dosis-respuesta: células ECC-1 fueron tratados con Pg /E2 y p27, y los niveles de proteína Skp2 Cks1 determina como antes. D, curso temporal Pg: células ECC-1 fueron tratados con Pg /E2 para las horas se muestran y los niveles de proteína que el anterior. exploraciones densitométricas de todas las bandas de proteínas se muestran en los gráficos a la derecha de cada transferencia. Cada banda se normalizó a la actina y a continuación, en comparación con 0 de tiempo o control no tratado. Los datos se expresan como intensidad relativa de cada banda de ± desviación estándar. E, el tratamiento E2 /Pg cicloheximida (CHX): células ECC-1 fueron tratadas con E2 durante 18 h o con E2 y Pg para 48 h. CHX se añadió 6 h antes de la cosecha final. Las células se recogieron en 0,1,2, y 6 puntos de tiempo h. CHX solo fue el control de línea de base. Los lisados se prepararon y se sometieron a inmunotransferencia para p27 y Skp2 y los niveles de cada banda de proteína determinada por densitometría (intensidad de la banda). El porcentaje de cambio dentro de cada parámetro de tratamiento se calculó basándose en el punto de tiempo cero para cada grupo. Protein turn-over se determinó por comparación de las células tratadas con CHX solo comparado con CHX en presencia de cada hormona en cada punto de tiempo. Los gráficos de líneas representan la intensidad relativa de cada banda normalizado a la actina para cada grupo. F, G: E2 estimula y Pg inhibe la proliferación: células ECC-1 fueron tratadas con E2 o Pg /E2 y la proliferación celular determinada por el ensayo de MTS (Materiales y Métodos) * p & lt; 0,05. H, la distribución del ciclo celular: las células ECC-1 fueron tratadas con E2 o E2 /Pg y el análisis del ciclo celular se realiza como Materiales y métodos descritos
En consonancia con las concentraciones máximas de E2 y Pg efectos sobre p27. , Skp2, y Cks1, la proliferación celular inducida por E2 con respuestas de los picos de 26 a 20% sobre los controles no tratados en 0,1 nM y 1 nM (Figura 1F), respectivamente, mientras que inhibió la proliferación Pg con una respuesta máxima del 27% con al 100 nM (Figura 1G). Tras el análisis del ciclo celular, se confirmó que las hormonas afectan a la proliferación celular como se refleja por sus efectos sobre la distribución del ciclo celular (Figura 1H). Después de 18 h de tratamiento con E2, el número de células ECC-1 en G1 disminuyó de 58% a 49% y aumentó en G2 y S del 14% al 15% y 29% a 36%, respectivamente. Después del tratamiento Pg a las 48 h, la fracción de células en G1 se incrementó de 58% a 67% y disminuyó en G2 y S del 13% al 10% y 27% a 23%, respectivamente.
ERK inducida por estrógeno fosforilación dependiente de p27 en Thr187
la fosforilación de p27 en T187 confiere la conformación molecular por su ubiquitinación por SCF-Skp2 /Cks1 [22]. La Figura 2A ilustra que E2 indujo un aumento de 2,5 veces y 2,3 veces en la fosforilación de p27 en T187 (p-p27 [T187]) a 1 nM y 10 nM E2, respectivamente, en células ECC-1 (y en las células de HEC-1B; Figura S1A), con una respuesta máxima de 11 veces de p-p27 (T187) a 18 h post tratamiento (Figura 2B) que era MAPK dependiente (Figura S1B). Como se muestra aquí, esto es la dosis idéntica de pico y el tiempo de respuesta en el que p27 se degrada por E2 (de acuerdo con las Figuras 1A y 1C) en las células ECC-1. En los experimentos iniciales, ni el inhibidor del proteasoma, lactacistina y el inhibidor de serina /treonina fosfatasa, ácido okadaico eran necesarios para mantener la p27 en el estado altamente p-p27 (T187) lo que sugiere que la tasa de degradación proteasomal de p-p27 (T187) es más lento que la fosforilación de T187. Además, muestran que ERK se activa por E2 aguas abajo de MEK1 (bloqueado por U0126) (Figura 2C). A partir de estos datos, se concluye que la fosforilación inducida por E2 de p27 en T187 son respuestas MAPK /ERK-dependiente y ER-específicas. Finalmente, siRNA knock-down de ERK1 y por separado, ERK2 (82%, la eficiencia de 70%, respectivamente) disminuyó p-p27 (T187) en las células desmontables no tratados en comparación con el control de siRNA (Figura 2D). Como se muestra tanto en las células transfectadas siRNA no transfectadas y control, parece que ERK2 es más altamente expresado de ERK1 (n.b. esto podría ser debido a una mayor especificidad del anticuerpo para ERK2 de ERK1). El blot muestra que derribando ERK2 disminuyó la fosforilación de p27 en mayor medida que golpeando hacia abajo ERK1 (comparar los niveles de p-p27 (T187) en ERK1 y ERK2 ronda abajo para controlar siRNA). Debido a la eficiencia de derribo y la mayor expresión de ERKs por estas células con y sin E2-inducción, es difícil cuantificar la contribución de ERK1 y ERK2 en la fosforilación de MAPK impulsada inducida por E2 de p27 en T187. No obstante, parece que E2 activa tanto ERK1 y ERK2 de la fosforilación de p27 en T187 para el reconocimiento por SCF-Skp2 /Cks1 (Figura 2D y la Figura S1B)
A, E2 dosis-respuesta:. CEE-1 fueron tratados con E2 y análisis de inmunotransferencia realizó usando conejo fosfo-p27 anti-humano (p-p27 [T187]), como se describe en Materiales y Métodos. B, curso de tiempo E2: células ECC-1 se trataron con los niveles de E2 y proteínas determinados por inmunotransferencia como en A. C, E2, fosfo-ERK: células ECC-1 fueron tratadas con E2 en presencia de lisados U0126 o ICI y de células immunoblotted para p-p27 (T187), ERK fosfo (p-ERK), y ERK total de, como se describe en Materiales y Métodos. D, E2, Análisis de ERK1 y ERK2 activación después de su derribo con siRNA: células ECC-1 se transfectaron con ERK1, ERK2, o ARNsi de control, tratados con E2 en presencia o ausencia de ICI, seguido de fraccionamiento de la célula, y inmunotransferencia para el total y fosfo-ERK-1 (p-ERK1) y ERK2 (p-ERK2), tal como se describe en Materiales y Métodos.
El derribo de Skp2 aumentó p27 nuclear y citoplasmática y bloqueó estrógeno la degradación inducida de p27 [por SCF-Skp2 /Cks1] en ambos compartimentos celulares
mostramos claramente que a medida que se incrementan los niveles de Skp2 y Cks1, los niveles de p27 disminuyen con la estimulación del crecimiento en respuesta a E2 (Figuras 1A, B, MI). Como se muestra en la Figura 3A, derribando Skp2 (SKP2 siRNA; 80% de eficiencia) provocó un aumento de 8,2 veces en p27. La degradación de p27 por Skp2 se informa de que se produzca en el núcleo [9], [30]. Sin embargo, se encontró que E2 indujo un pliegue 2,5 y 1,9 veces de incremento en Skp2 en el núcleo y las fracciones citoplasmáticas, respectivamente, y una disminución del 50% en p27 en ambas fracciones (Figura 3B, paneles de la izquierda). Es importante destacar que, se demuestra que tras desmontables de Skp2, E2 inducida por la degradación de p27 fue bloqueada en el citoplasma y el núcleo (Figura 3B, paneles de la derecha y la Figura S2), que la estimulación de la proliferación celular por E2 fue completamente obviado (Figura 3C), y que la disminución inducida por E2 en p27 era ER- y proteasoma dependiente en ambas fracciones subcelulares (Figura 3B, panel izquierdo). Probablemente, la disminución en el crecimiento después de Skp2 caída se debe al aumento de los niveles de p27 (como se muestra en la Figura 3B, panel derecho). Estos experimentos implican Skp2 del SCF Skp2 /Cks1 como mediador directo de la degradación inducida por E2 de p27
A, B, E2, Skp2 caída:. Células CEC-1 se transfectaron transitoriamente con Skp2 o control de siRNA , tratados con E2 solo o en presencia de 1 mM lactacistina (Lac) o 10 nM ICI, sometido a la celda de fraccionamiento, p27 y los niveles de Skp2 determinados por inmunotransferencia, como se describe en Materiales y Métodos. En el panel A, la eficiencia knock-down se determinó mediante la comparación de los lisados de células de Skp2 siRNA y el control de siRNA células tratadas por inmunotransferencia. los niveles de p27 relativas se representan mediante el escaneo densitométrico por debajo de la mancha. E2, la proliferación celular en las células Skp2 desmontables: células ECC-1, transfectadas con Skp2 o controlar siRNA, fueron tratados con E2 o no tratada y la proliferación determinó por el ensayo MTS, como se describe en Materiales y Métodos. Los datos se presentan como la media de dos experimentos independientes. * P = 0.05
estrógeno y la progesterona tienen efectos opuestos sobre los niveles de proteína Cdh1 en última instancia, para regular el nivel de proteína p27 nuclear.; Pg y E2 no afectan a los niveles de ARNm de Cdh1, Skp2, Cks1 o p27
El ubiquitylation y la degradación de Skp2 y Cks1 por el E3 ligasa APC /Cdh1 impedirían la degradación de p27. Por lo tanto, la hipótesis de que los niveles de [APC] Cdh1 variarían directamente con p27 y por lo tanto se regulen de forma opuesta por E2 y Pg. Consistente con esta hipótesis, mientras que el tratamiento E2 de las células ECC-1 en función del tiempo disminuyó Cdh1 con un efecto máximo de 56% a las 18 h (Figura 4A), Pg-tratamiento aumentó Cdh1 en el tiempo con una respuesta máxima de 1,7 veces a las 48 h (Figura 4B). En contraste ni E2 ni Pg afectados transcripción de Cdh1, p27, Skp2, o Cks1 en puntos de tiempo tempranos a través de 24 h (Figura 4C), y 12 h (Figura 4D), respectivamente, mientras que la respuesta de ARNm de genes comunes que contiene elementos de respuesta transcripcional para ER y PR, es decir, relaciones públicas y glicodelina, respectivamente, es alta (Figura 4D).
a, B, Evolución temporal de E2 y Pg [más E2] tratamiento de las células CEE-1. células ECC-1 fueron tratadas con E2 y Pg más E2, los experimentos terminados en los tiempos indicados, lisados preparados, y los niveles de proteína Cdh1 determinados por inmunotransferencia, como se describe en Materiales y Métodos. C, los niveles de D, E2, PG, ARNm de p27, Skp2, Cks1 y Cdh1: células ECC-1 fueron tratadas con E2 o Pg /E2, el ARN total extraído en el momento que se muestran y cuantitativa en tiempo real RT-PCR realizado, todo en Materiales y Métodos. PR y glicodelina cebadores se utilizaron como controles para ER y PR genes diana, respectivamente. Los datos se presentan como la media de dos experimentos independientes.
Tras el tratamiento con E2 de las células ECC-1 y su posterior fraccionamiento subcelular, una disminución del 21% en Cdh1 se muestra en la fracción nuclear. Esta disminución en el nivel de Cdh1 fue revertida por la lactacistina (Figura 5A) lo que sugiere que E2 regula los niveles de Cdh1 por la degradación proteasomal. Curiosamente, el nivel de Skp2 se redujo en un 18% con el tratamiento E2 en presencia de lactacistina tanto en el núcleo como en el citoplasma y también, por lactacistina solo, que se muestra aquí en los lisados celulares totales (por 37%; inserción de la figura 5A). Este resultado es difícil de explicar y aunque lactacistina es ampliamente utilizado para inhibir la degradación del proteasoma, puede haber fuera de objetivo efectos, tales proteólisis de Skp2 por diferentes vías de degradación
A, E2.; B, Pg, fraccionamiento y análisis de Cdh1, Skp2, Cks1, las proteínas p27 y p-p27 (T187) Cell: Las células se dejaron sin tratar, tratado con E2, E2, más Lac o tratados con Pg /E2 con o sin 1 mM lactacistina ( lac) o RU486. Las células se fraccionaron y las proteínas se analizaron por inmunotransferencia, todo se describe en Materiales y Métodos. El
inserción en A
muestra que lactacystin disminuye los niveles de proteína Skp2. C., Pg, Cdh1 unión a APC: Se trataron las células con Pg /E2, lisados de células inmunoprecipitadas con anti-Cdh1 seguido de inmunotransferencia con anti-Cdc27, como se describe en Materiales y Métodos. D, diagrama representa APC /Cdh1 como la ligasa E3 aguas arriba que ubiquitylates Skp2 /Cks1 (del complejo SCF), que es la ligasa E3 aguas abajo que ubiquitylates p27 para regular los niveles de proteína p27.
Es notable que a diferencia de Skp2, Cks1, y p27, Cdh1 no está presente en el citoplasma. Se observó una disminución concurrente en p27 tanto en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de 30% y 61%, respectivamente, en comparación con los controles no tratados (p27 basal fue mayor en el núcleo que en el citoplasma de las células no tratadas). Consistente con la disminución nuclear en p27, p-p27 (T187) se aumentó para la identificación y ubiquitylation de p27 por Skp2 /Cks1 para su degradación. Por otra parte, lactacistina inhibe la degradación de p27 tanto en el núcleo como en el citoplasma y el aumento de p-p27 (T187) por 2,4 veces sólo en la fracción nuclear de confirmar que p27 es fosforilada en T187 en el núcleo y, además, se mantiene y se acumula en el núcleo cuando su la degradación es inhibida por la lactacistina (igual que la Figura 3B, los paneles de la izquierda). Una relación inversa esperada entre p27 y los niveles de Skp2 se demostró después de E2-tratamiento, tanto en las fracciones nucleares y citoplasmáticas. Por el contrario, el tratamiento de las células Pg ECC-1 indujo un aumento de 1,65 veces en ambos Cdh1 y p27 en el núcleo, mientras que esta hormona disminuyó Skp2 por 66% en el citoplasma y tanto Skp2 y Cks1 por 62% en la fracción nuclear; estas respuestas fueron PR-específica (Figura 5B). A diferencia del tratamiento E2 en el que se produjo la degradación de p27 en ambos compartimentos celulares, p27 fue estabilizado en gran medida en el núcleo de PG (1,7 frente a 1,1 veces). Es posible que Skp2 y Cks1 se degradaron a través de la UPS desde lactacistina aumentó Skp2 y Cks1 en el núcleo y en el citoplasma Cks1 también. Mientras que nosotros mostramos niveles Cdh1 se incrementan en Pg, esta proteína debe estar enlazado al complejo APC [en un estado hypophosphorylated] para ejercer su actividad específica E3 ligasa [31], [32], [33]. Como se muestra en la Figura 5C, Pg de hecho aumentó la unión de Cdh1 a APC aumentando ostensiblemente su actividad ligasa E3 para Skp2 y Cks1 y por lo tanto, su degradación proteasomal. Tomados en conjunto, como se muestra en la Figura 5D, nuestros resultados implican Cdh1 como regulador aguas arriba de los niveles de p27 a través de la UPS (es decir, SCF-Skp2 /Cks1) y el enlace crítico para efectuar la regulación hormonal de crecimiento.
el derribo de la acumulación Cdh1 bloques mediada por Pg de p27 nuclear y la inhibición del crecimiento
Figura 6A ilustra que la anulación de Cdh1 (
FZR
gen; 87% de eficiencia) bloqueó completamente la Pg-inducida 1.6- las veces de aumento en p27 nuclear (Figura 6B, paneles de la derecha) y el efecto inhibidor del crecimiento del 30% (Figura 6C). Por otra parte, la proliferación fue bloqueado parcialmente en las células transfectadas no tratadas y tratadas con Pg Cdh1 siRNA. Considerando que Pg causó una disminución en Skp2 nuclear y Cks1 (figuras 5B, 6B), la falta de actividad de ligasa E3 Cdh1 en las células knock-down, como era de esperar aumenta los niveles basales de Skp2 nuclear y Cks1 (Figura 6B, paneles de la derecha). Además, Pg-tratamiento disminuyó citoplásmica Skp2 tanto en el control de siRNA y Cdh1 siRNA por 51% y 45%, respectivamente (Figura 6B, paneles de la izquierda). Estos datos proporcionan un fuerte apoyo para un mecanismo por el cual la acción Pg PR-mediada aumenta p27 nuclear para la inhibición de la proliferación elevando Cdh1 en el núcleo, que a su vez se degrada Cks1 y Skp2, como lo demuestra su aumento en la presencia de lactacistina y Pg [ ,,,0],más E2] (Figura 5B)
a, Pg, Cdh1 knockdown:. células ECC-1 se transfectaron transitoriamente con Cdh1 siRNA seguido de separación citoplásmico /nuclear, y la eficiencia caída determinado en cada fracción por el control de la comparación de siRNA y Cdh1 siRNA transfectadas lisados celulares. B, Pg, Cdh1 knock-down y fraccionamiento subcelular: células transfectadas se trataron con Pg /E2 con o sin RU486, sometido a fraccionamiento celular, y el análisis de inmunoblot realizaron en derribo y el control de las células siRNA para las proteínas que se muestran; todo se describe en Materiales y Métodos. exploraciones densitométricas (intensidad relativa) de cada banda de proteína que representa los niveles de respuesta en relación con la actina y la comparación con los controles no tratados se muestran en el siguiente gráfico. C, Pg, la proliferación celular en las células desmontables Cdh1: células transfectadas con Cdh1 o de control de siRNA se trataron Pg /E2 o no tratada y analizada por la proliferación de ensayo MTS como se describe en Materiales y Métodos; * P & lt;. 0,05
estrógeno y la progesterona tienen efectos opuestos sobre p27 y las proteínas del sistema ubiquitina-proteasoma en células epiteliales endometriales primarios
EECs de tejido endometrial produjeron respuestas idénticas para p27 , Cdh1, Skp2 y Cks1 como se muestra por la línea celular de ECC-1 después del tratamiento con E2 y Pg. En concreto, E2 a través de la sala de emergencia disminuyó en un 88% p27 (Figura 6A) y Cdh1 en un 71% y aumentó Skp2 y Cks1 un 1,2 y 2,3 veces, respectivamente. Por el contrario, Pg-tratamiento de EECs primarias aumentó p27 y Cdh1 por 2,7 veces y 1,8 veces, respectivamente, mientras que la Skp2 y Cks1 fueron ambos disminuyeron en un 69% (Figura 7B). El tratamiento de células primarias con E2 estimuló el crecimiento en un 18% y 15%, mientras que Pg (más E2) inhibe el crecimiento en un 33% y 29%, que fue casi completamente bloqueado por RU486 (Figura 7C y 7D) en ambos pacientes. fraccionamiento Nuclear-citoplásmica de EECs de un tejido endometrial normal, reveló que Cdh1 sólo estaba presente en el núcleo y que E2 disminuyó Cdh1 por 41%, la disminución de p27 principalmente en el núcleo (en un 50%), aumento de Skp2 en ambas fracciones, pero sobre todo en el núcleo (1,3 veces), y el aumento de Cks1 en ambas fracciones, pero con más en el citoplasma (1,5 veces; Figura 7E). En contraste directo, Pg aumentó predominantemente p27 nuclear en 2,6 veces y Cdh1 nuclear por 1,3 veces, mientras que Skp2 se redujo en el núcleo y el citoplasma en un 41% y 89%, respectivamente. Pg reduce Cks1 por 50% en el núcleo y menos en el citoplasma. Curiosamente, mientras que Cdh1 no se encontró en el citoplasma en la línea celular ECC-1 y EECs normales primario (n = 3), Cdh1 se detectó en el citoplasma de las células de la CEPA primaria (n = 3, los grados II, III; Figura 7F) , que se redujo en un 44% en esta fracción subcelular, mientras que se incrementó en el núcleo en un 44%, después del tratamiento Pg. El mismo patrón se muestra para p27, que estaba presente en el citoplasma y en el núcleo aumentó en 1,4 veces en respuesta a Pg. Las respuestas coherentes a E2 y Pg observaron entre los cuatro EECs primarios normales no sólo implicaría que la consistencia se pueden obtener a pesar de la heterogeneidad del paciente, pero sugieren que las respuestas hormonales que hemos detectado en las líneas celulares inmortalizadas son propensos fisiológica.
A, E2; B, el tratamiento de Pg EECs primarias: EECs normales de fase proliferativa fueron tratados con cualquiera de E2 sin o con ICI o tratado con Pg /E2 con o sin RU486, lisados de células preparados y inmunotransferencia de los niveles de proteína se muestran como se describe en Materiales y Métodos. A y B son pacientes diferentes que muestran diferentes niveles basales de p27 y Cdh1. C, D: E2, E2, más el tratamiento Pg, la proliferación celular (por el ensayo de MTS): experimento paralelo para el paciente#2, como se describe en Materiales y Métodos; * P & lt; 0,05. E, E2, el tratamiento Pg, fraccionamiento subcelular: EECs primarios de fase proliferativa fueron tratados con E2 o Pg /E2, se sometió a fraccionamiento subcelular, y análisis de inmunoblot para los niveles de proteína que se muestran y se realizan como se describe en Materiales y Métodos.