Extracto
Los datos existentes sugieren que la señalización de NF-kappaB es un regulador clave de la pérdida de músculo esquelético inducida por el cáncer. Sin embargo, la identificación de los componentes de esta vía de señalización y de los factores de transcripción NF-kB que regulan la pérdida de masa está lejos de ser completa. En músculos del tumor C26 ratones portadores, la sobreexpresión de dominante negativo (D.N.) IKKβ bloqueado pérdida de masa muscular en un 69% y el represor I? B?-Super bloqueado perder por 41%. Por el contrario, la sobreexpresión de D.N. IKK o D.N. NIK no bloqueó la emaciación C26-inducida. Sorprendentemente, la sobreexpresión de D.N. p65 o D.N. c-Rel no afectó significativamente el desgaste muscular. En todo el genoma arrays de expresión de mRNA mostraron regulación positiva de muchos genes previamente implicados en la atrofia muscular. Para probar si estos genes regulados positivamente fueron blancos directos de NF-kB factores de transcripción, se comparó la unión al ADN en el control muscular y caquexia utilizando el chip-p65 secuenciación de todo el genoma. El análisis bioinformático de los datos de secuenciación de chip-control y los músculos C26 mostró muy poca unión a los genes en la caquexia y poco p65 para sugerir que las influencias de unión p65 regulada por incremento de la expresión génica asociada con la caquexia basado muscular. Los datos del chip-ss p65 son consistentes con nuestro hallazgo de ningún cambio significativo en la proteína de unión a un oligonucleótido NF-B en un ensayo de desplazamiento en gel, sin activación de un reportero NF-KB-dependiente, y ningún efecto de la sobreexpresión dnp65 en los músculos de tumor teniendo ratones. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la idea de que a pesar de la inhibición de la I? B? Y, en particular IKKβ, bloques pérdida inducida por el cáncer, no se requiere la vía de señalización de NF-kB alternativa. Además, los factores de transcripción corriente abajo NF-kappa B, p65 y c-Rel no aparecen para regular los cambios transcripcionales inducidos por el tumor C26. Estos datos son consistentes con la creciente cuerpo de literatura que muestra que existen sustratos NF-KB-independientes de I? B? IKKβ y que regulan los procesos fisiológicos
Visto:. Cornwell EW, Mirbod A, Wu CL, Kandarian SC, Jackman RW (2014) inducida por el cáncer C26 pérdida de masa muscular es IKKβ-dependiente y NF-kappaB-independiente. PLoS ONE 9 (1): e87776. doi: 10.1371 /journal.pone.0087776
Editor: Imed Eddine Gallouzi, McGill University, Canada |
Recibido: July 9, 2013; Aceptado 30 de diciembre de 2013; Publicado: 29 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Cornwell et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH) AR060217 premio. (Http://grants.nih.gov/grants/oer.htm.) Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses :. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la caquexia es una condición metabólica asociada con muchas enfermedades crónicas y se caracteriza por la grave pérdida de masa del músculo esquelético y tejido adiposo que no puede revertirse mediante el aumento de la ingesta calórica [1]. La caquexia por cáncer se ve en la mayoría de los cánceres avanzados, pero se observa con mayor frecuencia en los cánceres del tracto pulmonar y gastrointestinal superior [1]. Los pacientes de cáncer con caquexia tienen una menor calidad de vida debido a la función inmune comprometido, resistencia a la insulina, debilidad y fatiga [2]. Los pacientes con caquexia incluso leve no pueden tolerar el tratamiento de quimioterapia, lo que agrava aún más su enfermedad [3]. La caquexia se estima que contribuye a la muerte de aproximadamente el 30% de los pacientes con cáncer [4]. A pesar de la gravedad de esta afección, los tratamientos siguen siendo paliativo. Dado que las consecuencias más graves de la caquexia parecen residir con la pérdida de músculo esquelético [1], el desarrollo de una mejor comprensión de los mecanismos y la regulación de genes de señalización celular en el músculo podría producir nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de esta condición.
Investigación en diferentes tipos de cáncer se ha sugerido un papel para la señalización de NF-kB y la regulación transcripcional de NF-kappa B en el músculo perder [5], [6], [7]. La inhibición de la vía clásica NF-kappa B, por la sobreexpresión de la súper represor IkappaBalpha (IκBαSR), bloqueado pérdida de masa muscular en los ratones portadores de tumor de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) en un 50% [5]. El prototipo del factor de transcripción NF-kB, p65 (Rel A), mostraron una mayor unión en un ensayo oligonucleótido NF-kB basado en ELISA en los músculos de ratones con LLC. El aumento de la unión se invirtió cuando IκBαSR se sobreexpresa en el músculo, lo que sugiere que p65 es un factor de transcripción NF-kB involucrado en pérdida de masa muscular debido a cáncer, al menos en ratones con LLC [5]. La fosforilación de p65 en la serina 536, pensado para aumentar la actividad transcripcional, se aumenta en el músculo de ratones portadores de tumores C26 [6] y en el músculo de los seres humanos con cáncer de páncreas [8]. Por otro lado, algunos de los resultados sobre el papel de NF-kB factores de transcripción en la caquexia han sido equívocos. Por ejemplo, los ensayos de cambio de gel mostraron pequeños aumentos en la unión de factores de transcripción a un oligonucleótido NF-kappa B en los músculos de los ratones portadores de tumores C26 [6], [9], y en otro estudio no hubo un incremento en la proteína de unión a una NF kappa B oligonucleótido en ratas caquécticos con hepatoma ascítico Yoshida [10]. Es posible que diferentes tipos de cáncer inducen pérdida de masa muscular a través de diferentes mecanismos celulares. Sin embargo, sólo una proteína NF-kB de señalización (I? B?) Y el factor de transcripción de un NF-kappa B (p65) se han estudiado en la atrofia muscular inducida por el cáncer, y, no sabemos la atrofia de la inducción de genes que están dirigidos por el NF-kB de transcripción factores.
el objetivo del presente estudio fue identificar las proteínas conocidas de mamíferos NF-kB de señalización y factores de transcripción NF-kB que regulan la pérdida de masa muscular debido a un cáncer. Un segundo objetivo fue identificar los genes diana NF-kB a nivel de todo el genoma con el fin de determinar si una red transcripcional de NF-kB regula la pérdida de masa muscular inducida por el cáncer. Hemos probado si se requieren proteínas de señalización NF-kB para la pérdida de masa muscular mediante la sobreexpresión de dominante negativo (D.N.) formas de quinasas aguas arriba de NF-kB. Estos son el inhibidor de quinasa kappaB alpha (IKK), IKKβ, y la quinasa que induce NF-kappa B (NIK). El papel de I? B fue probado por la sobreexpresión de una forma súper represor trans-dominante de I? B? (IκBαSR). Si la transcripción NF-kB factores de Rel A (p65) o c-Rel son necesarios para desgaste muscular fue probado por la sobreexpresión de D.N. p65 o D.N. c-Rel, respectivamente. factor de transcripción NF-kB unión a un oligonucleótido NF-kappa B y la actividad transcripcional de NF-kappa B de un reportero se midieron en los músculos caquécticos. Para determinar si los canónicos factor de transcripción NF-kappa B, p65, genes diana unidos que podrían estar relacionados con la regulación atrofia, se realizó chip-secuenciación en el músculo de los ratones de control y tumorales teniendo en conjunción con la medición de la expresión génica global como una medida funcional de caquexia mediada por la expresión de genes.
Este es el primer estudio en profundidad sobre el papel de la señalización de NF-kB y de NF-kB factores de transcripción en la regulación de la pérdida de masa muscular debido a un cáncer. Aunque la inhibición de la I? B? Y, particularmente, la actividad IKKβ, invierten de manera significativa pérdida de masa muscular, no hubo efecto sobre la pérdida de masa de la fibra debido a la inhibición de IKK o NIK. Sorprendentemente, la sobreexpresión de p65 negativa dominante o c-Rel mostró poco o ningún efecto en el desgaste de la fibra muscular. Además, no hubo ningún cambio en el factor de transcripción NF-kB de unión en un ensayo de desplazamiento en gel o en la actividad de reportero NF-kB. Es importante destacar que la regulación positiva de genes de citoquinas o atrofia que han encontrado los genes microarrays de expresión no estaba mediada por factores de transcripción que contiene p65-según la evaluación de chip-ss. Nuestros resultados son consistentes con los de Cai et al. [5] muestran un papel de I? B? En la emaciación cáncer, y para la primera vez que mostrar que IKKβ se requiere para el desarrollo de la caquexia por cáncer, pero IKK y NIK no lo son. Nuestro análisis en profundidad de la señalización NF-kB y la transcripción durante la caquexia por cáncer muestra que la IKKβ es la regulación de la expresión génica de factores de transcripción distintos de NF-kB, al menos en el músculo esquelético durante la caquexia por cáncer C26. Estos resultados revelan una faceta inesperada pero importante de la regulación de la pérdida de masa muscular inducida por el cáncer.
Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones en la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de la Universidad de Uso y Cuidado de Animales Charles River Campus Boston (número de protocolo: 12-016). Toda la cirugía se realiza bajo anestesia con ketamina /xilazina, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Todo el personal que trabaja con animales han recibido una formación obligatoria IACUC y revisión anual: http://www.bu.edu/orctraining/animal/lacf/
Células
células de adenocarcinoma C26 (Nacional del Cáncer. Instituto, Frederick, MD) se sembraron y se mantuvo a 37 ° C, 5% de CO
2 en la Dulbecco Modificado Medio Eagle, alto contenido de glucosa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Invitrogen), 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen), y 1% de L-glutamina (Invitrogen). Antes de la inoculación en ratones, las células C26 se trataron con tripsina y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se volvieron a suspender en una solución 01:01 de 1X PBS y Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).
Animales
Ocho semanas de edad, los ratones machos CDF1 comprados de Charles River Laboratories (Wilmington, MA, EE.UU.) se utilizaron para todos los experimentos. Los ratones fueron tratados en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Los animales se mantuvieron en un ciclo de 12:12 L /D, se alojaron individualmente y se les dio acceso a los alimentos y el agua
ad libitum
. Después de tres días de aclimatación, los animales fueron asignados al azar a un grupo de control no tumoral o un grupo portador de un tumor C26. Los animales de control recibieron un inóculo de 150 l 1 × PBS /matrigel (01:01) por vía subcutánea en la derecha y la izquierda flancos. animales portadores del tumor recibieron un inóculo de 5,0 x 10
5 C26 células en suspensión en 150 l de PBS /matrigel (01:01) inyecta por vía subcutánea en los flancos derecho e izquierdo; esto se realizó en ratones anestesiados ligeramente (40 mg /kg de ketamina 5 mg /kg de xilazina).
inyección de ADN plásmido en el músculo
ADN plasmídico se aisló usando el kit QIAGEN Mega endotoxina-Free según las instrucciones del fabricante. ADN plásmido se inyecta en el músculo 10 días después de las inoculaciones tumorales, como se describe anteriormente [11]. Brevemente, el ADN del plásmido se precipitó con etanol y se resuspendieron en 0,45% de solución salina estéril /ddH
2O. Todos los ratones que recibieron la cirugía recibieron tratamientos profilácticos con 0,1 mg de inyección /kg buprenorfina antes de la cirugía. Los ratones fueron anestesiados con ketamina (80 mg /kg) y xilazina (10 mg /kg). Los tibial anterior (TA) los músculos de cada animal fueron inyectados con 35 mg de plásmido de expresión en 25 l de 0,45% de solución salina estéril usando una jeringa de insulina 29 de calibre. Tras la inyección de plásmido, los músculos se estimularon con una corriente eléctrica de baja tensión por medio de electrodos de dos palas [12] que entregó 6 pulsos a 86 V /cm durante 20 ms con un intervalo entre impulsos de 200 ms (Electro Square Porator ECM 830, BTX) . Se trata de un protocolo de electroporación de baja dosis que no induce daños [13], [14], [15]. Al día 25 después de la inoculación, los músculos TA fueron retirados de tanto ratones portadores de tumores C26 control y, se pesaron, y, o bien se congelaron en nitrógeno líquido para el análisis bioquímico o montados en depresores de lengua, incrustado en medio de congelación de tejido, y se congelaron en isopentano enfriado con nitrógeno líquido para el análisis histoquímico. La inyección de plásmido reportero NF-kB se realizó en el mismo día como inoculación de células tumorales. La inyección de d.n.p65-EGFP se realizó el día 6 después de la inoculación del tumor
Los plásmidos
Los plásmidos de expresión utilizados fueron los siguientes:. D.N. IKK-EGFP, D.N. IKKβ-EGFP, IκBαSR-EGFP, D.N. NIK-GFP, D.N. p65-EGFP, y D.N. c-Rel-EGFP. El D.N. IKK-EGFP (K44M) y D.N. IKKβ-EGFP (K44M) plásmidos de expresión que codifican proteínas de fusión EGFP de formas muertos-quinasa de IKK y IKKβ que hemos descrito en detalle [11]. También se construyó el plásmido de fusión IκBαSR-EGFP que hemos descrito en detalle [16]. El D.N. p65 (313) es una forma truncada de p65 faltan los dominios de transactivación C-terminal y fue un regalo de D. Guttridge [17]. Hemos creado un D.N. p65-EGFP plásmido de fusión mediante la clonación de la secuencia de ADN de codificación de ácido-313 amino N-terminal de p65 en los sitios HindIII-SalI del pEGFP-N1 (313 + 238 = 551 A. A.). Verificamos la clonación mediante la secuenciación del plásmido y a prueba la función negativa dominante en miotubos C2C12, en el que el D.N. p65-EGFP fue capaz de bloquear la activación TNFa de un reportero de NF-kB por & gt; 90% (Figura S1 A). Para la creación de un D.N. c-Rel-EGFP, se utilizó una plantilla de c-Rel ratón, un regalo de T. Gilmore, la copia de la secuencia de ácido nucleico para el dominio de homología Rel del gen que contiene A.A. 1-288 (perderse los dos dominios de transactivación N-terminales) y la adición de sitios de restricción para clonar el fragmento en marco en los sitios EcoRI-KpnI del pEGFP-N1. El resultado D.N. c-Rel-EGFP inserción fue verificada por secuenciación y funcionó como un Rel dominante negativo porque su expresión redujo los niveles de reportero NF-kappa B en miotubos C2C12 (Figura S1B). El D.N. plásmido de expresión NIK-GFP, un regalo de A. Kumar, codifica una forma muerta quinasa de NIK y EGFP de un cistrones independientes [18].
inmunohistoquímica
zonas TA fibra muscular transversales de fibras de plásmidos transfectados que expresan las proteínas de fusión (fluorescencia verde) se compararon con las áreas de fibra en los mismos campos que no ocupan el plásmido tanto en ratones portadores de tumores y de control. Como se ha descrito anteriormente [11], se tomaron secciones congeladas de la parte media del abdomen de la AT (7,5 micras de espesor), montados en portaobjetos de microscopio Tack tisular (Polysciences, Inc., Warrington, PA, EE.UU.) y se fijaron en paraformaldehído al 4%. Las secciones transversales se lavaron, se bloquearon en 10% de BSA y se incubaron con anticuerpo de conejo anti-laminina 1:200 (L9393; Sigma-Aldrich) en 1% BSA seguido de un anticuerpo secundario Texas Red-X de cabra anti-IgG de conejo colorante fluorescente conjugado 1 :200 (T-6391; Invitrogen). Las secciones fueron montadas en un cubreobjetos con medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Las imágenes fueron visualizados a 20 aumentos utilizando un microscopio de luz invertida (Nikon Eclipse TS 100). Todas las imágenes fueron capturadas con una cámara SPOT RT (instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI, EE.UU.). Fibra de área de sección transversal se calculó utilizando el Sistema de Meta-Morph Imaging (Universal Imaging, Glendale, WI, EE.UU.). El número medio de fibras medidas por músculo era 200. Los controles
El aislamiento de extractos nucleares de crudo
extractos nucleares crudos de los músculos de las extremidades traseras de los ratones macho CD2F1 13 al 23 día C26-inoculados y emparejados por edad se aislaron de acuerdo con Kumar y Boriek [19] con algunas modificaciones. Todas las etapas de aislamiento y los giros se realizaron a 4 ° C utilizando tampones refrigerados. músculos congelados de Flash se suspendieron a 1 mg de peso muscular por 18 l de tampón (HEPES 10 mM [pH 7,9], KCl 10 mM, MgCl2 3 mM, EDTA 0,1 mM [pH 8], EGTA 0,1 mM, 0,1% de Triton X-100 , ditiotreitol 1 mM, 0,5 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y cóctel inhibidor de proteasa) e inmediatamente se homogeneizaron en hielo. músculos homogeneizadas se incubaron en hielo durante 5 min seguido de 20 s de vortex vigoroso. Los núcleos se centrifuga a 3000 ×
g
durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se almacena a -80 ° C. nódulos nucleares se lavaron con 1 ml de tampón de extracto citoplasmático modificado sin Triton X-100 y se centrifugaron a 3000 ×
g
de 3 min. Los sedimentos se resuspendieron en 4 l de tampón de extracto nuclear (HEPES 20 mM [pH 7,9], NaCl mM 420, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 25% de glicerol, ditiotreitol 1 mM, 0,5 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y la proteasa cóctel inhibidor) por mg de peso original del músculo. Resuspendieron gránulos nucleares se incubaron en hielo durante 30 min con 15 s de agitación vigorosa cada 10 min. Las muestras se centrifugaron a 16.000 x
g
durante 20 minutos y extracto nuclear (sobrenadante) fue retirado y almacenado a -80 ° C.
ensayos de movilidad electroforética (EMSA)
la concentración de proteína de los extractos nucleares de músculo crudo se determinó usando el ensayo de Bradford (Bio-Rad Protein ensayo tinte Reactivo, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Doble cadena NF-kB IRDye 700 colorante infrarrojo-oligonucleótido marcado en el extremo, 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 '(subrayado indica NF-kB sitio de unión), se adquirió de LI-COR Biosciences (Lincoln, NE, EE.UU.). Consenso competidor no marcado NF-kB oligonucleótido se adquirió de Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA, EE.UU.). EMSA reacción de unión se llevó a cabo utilizando Odyssey EMSA Buffer Kit (LI-COR Biosciences) con algunas modificaciones. volumen de reacción total se preparó en 20 l. Encuadernación reactivos de reacción se añadieron a agua purificada en el siguiente orden: 2 l de tampón de unión (Tris 100 mM, KCl 500 mM, DTT 10; pH 7,5), 2 l de TDT 25 mM /2,5% de Tween-20, 1 g /poli dI l • dC en Tris 10 mM, EDTA 1 mM; pH 7,5, 50 fmoles NF-kB IRDye 700 colorante infrarrojo oligonucleótido marcado en el extremo, y 15-20 g de extracto nuclear. En reacciones con no marcado competidor NF-kappa B, no marcado y oligonucleótidos marcados se mezclaron antes de la adición a la reacción de unión. Las reacciones de unión se mezclaron suavemente y se incubaron durante 25 min, a temperatura ambiente, en la oscuridad. Antes de cargar las muestras, 2 l de naranja colorante de carga (65% w /v de sacarosa, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 10 mM, 0,3% w /v Naranja G) se añadió a la reacción de 20 l y se mezcló suavemente.
complejos ADN-proteína se separaron del oligonucleótido libre de no desnaturalización del 5% de Tris-borato-EDTA, página lista Geles (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Las muestras se sometieron a electroforesis a 76 V durante 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Proteína unida a complejos de oligonucleótidos marcadas se visualizaron usando un de imágenes por infrarrojos Odyssey (LI-COR Biosciences).
reportero de la actividad de NF-KB dependiente
En los puntos de tiempo indicados, los músculos TA transfectadas con un NF-kB dependiente de informador de luciferasa se recogieron y luego homogeneizado en 1 ml de tampón de lisis pasiva (Promega, Madison, WI) con inhibidores de proteasa y de fosfatasa (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Los homogeneizados se centrifugaron a 5.000 x
g
a 4 ° C durante 20 minutos. Se recogió el sobrenadante y se mezcla con Luciferase Assay Reagent (Promega) según las instrucciones del fabricante. La actividad de luciferasa se midió con un luminómetro TD-20/20 (Turner Designs, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
se determinó Western blot
La concentración de proteína de lisados musculares en tampón de lisis pasiva utilizando el ensayo de Bradford (Bio-Rad Protein ensayo tinte Reactivo, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Cincuenta a 75 microgramos de proteína se desnaturalizó y se fraccionó por tamaños en 4-15% de geles de SDS-poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron a una membrana Immobilon-FL de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Bedford, PA, EE.UU.), bloqueada en Odyssey tampón de bloqueo (LiCor Biotechnology, Lincoln, NE, EE.UU.) y se incubaron con el anticuerpo primario apropiado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos fueron: anti-IKK /IKK1 (IMG-5477, imgenex, San Diego, CA, EE.UU.), IKKβ /IKK2 (# 2684), NF-κB2 (p100 /p52;#4882), y p-I? B? (# 9246 ) (Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.), I? B? (sc-371), NF-kB p65 (sc-7151), c-Rel (sc-6363), y NIK (sc-7211) (Biotecnología de Santa Cruz , Santa Cruz, CA, EE.UU.). Anti-GAPDH (G-9545) se utilizó como control de carga (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Alexa Fluor 680 colorante fluorescente conjugado se utilizó anticuerpo secundario (Invitrogen) para la visualización con el sistema de formación de imágenes de infrarrojos Li-Cor Odyssey se describe anteriormente [20].
aislamiento de ARN
gastrocnemio y plantar músculos eran cosechado de control de anestesiado y ratones portadores de tumor (25 días después de la inoculación), se congelaron en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80 ° C hasta su posterior procesamiento. El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El ARN total extraído se purificó adicionalmente usando un kit de DNasa I libre de RNasa (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) y un kit RNeasy Mini (Qiagen) como se describe anteriormente [21]. ARN extraído se cuantificó por espectrofotometría UV y la calidad revisado por un 1% de desnaturalización en gel de agarosa. Las muestras también fueron verificadas mediante análisis Bioanalyzer 2100 y tenía un número RIN mínima de 8.0 (Agilent, Palo Alto, CA, EE.UU.).
Análisis de microarrays
Para el análisis de microarrays, las muestras de ARN se ha descrito anteriormente fueron enviados al Servicio de la Universidad de Boston Medical Center Microarray Core para la amplificación, el etiquetado y la hibridación de un ratón Affymetrix Gen 1.0 gama ST (Santa Clara, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante para medir la expresión de 28,132 genes bien anotado. Un total de 6 imágenes array (3 muestras de músculo de control y 3 C26 muestras de músculo) fueron adquiridos por escáner GeneChip 3000 TG y la calidad evaluada por la expresión Affymetrix consola (Santa Clara, CA, EE.UU.). valores de las señales de expresión génica fueron generados por el módulo creador Expresión de archivo de la plataforma GenePattern (Broad Institute, Cambridge, MA) y robusto algoritmo de análisis de múltiples matrices (RMA) se utilizó para pre-procesamiento de datos [22]. Brainarray MOgene 1.0 ST encargo archivo CDF v.13 se utilizó para la sonda de anotación [23]. . Tanto
cel
archivos y valores de expresión fueron depositados en MIAME compatible Ómnibus NCBI Gene Expression con el número de acceso: GSE48363 (enlace: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc. cgi token = rnupvmqqyocggpk & amp;? acc = GSE48363). La expresión génica diferencial se calcula utilizando el módulo de selección de marcadores comparativo en GenePattern que compara las diferencias de medias entre los grupos control y C26 por dos vías t-tests paramétricos. Los parámetros utilizados para identificar los genes que son expresados diferencialmente en los músculos de los ratones portadores de tumores fueron:
P
-value≤0.05,
q
-value≤0.05, y doblar cambiar superior a 1,5 veces . Las listas de genes regulados por incremento o disminución, se han subido a la base de datos DAVID Bioinformática para la anotación funcional y para la asignación de la ontología de genes basado en el proceso biológico de los genes en comparación con el de
mus musculus
genoma donde el umbral de la EASE el marcador (Fisher Exact modificado P-valor) se fijó en 0,01 y un recuento de genes mínimo de 2.
chip-secuenciación
gastrocnemio y plantar músculos fueron aisladas de control (es decir, no tumoral -bearing) y C26 portadores de tumores de ratones en el día 25 posterior inoculación del tumor. Recién músculo disecado se picó y reticulado en 1% de formaldehído durante 15 minutos, se inactivó con glicina y después se congelan en nitrógeno líquido. Para cada condición (es decir, control o C26) flexor plantar músculo de cuatro patas se agruparon, se aisló homogeneizada, y la cromatina como detallamos anteriormente [21]. Este material se sometió a ultrasonidos para producir fragmentos de cromatina que eran en promedio de 250 pb. Una alícuota de la cromatina sonicado fue puesto a un lado para ser utilizado como la fracción de entrada para chip-PCR. El resto de la cromatina se diluyó en tampón de IP y se dividió en un grupo para la incubación con el anticuerpo p65 (Santa Cruz SC-372x) y un grupo sin ningún anticuerpo primario; esto se hizo por la cromatina de ambos grupos control y C26. Las muestras con y sin anticuerpo primario se incubaron durante 16 horas a 4 ° C con mezcla a baja velocidad constante y a continuación, los complejos anticuerpo-cromatina se capturaron con perlas magnéticas proteína G. La cromatina se eluyó de las perlas y reticulaciones invertidas, seguido de tratamiento con pronasa /RNasa y precipitación del ADN. Un décimo del material se utilizó para la PCR para un gen que se muestran a tener de unión con el fin de probar el chip p65 p65 robusta. Se hicieron tres bibliotecas de ADN diferentes: control de la viruta p65, p65 C26 chip y chip sin anticuerpo primario. Las bibliotecas se prepararon para la secuenciación de alto rendimiento utilizando el kit Biblioteca Illumina chip-ss. Una alícuota de cada biblioteca se examinó por electroforesis en acrilamida y tinción Sybr-oro para estimar la calidad por el tamaño y la intensidad del producto que aparece como una mancha con un tamaño medio de 350 pb. El procedimiento completo para la fabricación de las tres bibliotecas se repitió una segunda vez con nuevas muestras de músculo con el fin de tener dos bibliotecas ChIP-seq para cada uno de los tres grupos. Las bibliotecas fueron enviadas al Instituto Whitehead (Cambridge, MA) en el que se limpiaron de dímeros de adaptador usando perlas Ampure XL. Las bibliotecas limpiadas fueron probados por el control de calidad Bioanalyzer y qPCR se realizó con el fin de determinar la cantidad de cada biblioteca para usar. Las bibliotecas fueron secuenciados utilizando secuenciación de Illumina Solexa en un secuenciador GA II. Las secuencias resultantes de control y las muestras C26 fueron alineados con el genoma de ratón (versión mm9) utilizando ELAND. Las secuencias fueron enviados a nuestro laboratorio en el formato ELAND.
Las alineaciones de las dos muestras de control independientes se agruparon y se hizo lo mismo para las dos muestras C26. En cada caso, esto se hizo mediante la combinación de las formas .bam de las alineaciones en el sitio web Galaxy. Las secuencias se evaluaron a continuación con el paquete FastQC de pruebas de control de calidad, que se obtuvo como un programa independiente del Instituto Brabaham (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Tras el análisis inicial FASTQ se llevaron a cabo dos operaciones en los datos de chip-ss: 1. eliminamos duplicados PCR utilizando samtools rmdup a través de la galaxia, y 2. otra vez usando samtools, nos aprovechamos de las etiquetas de asignación de los datos de ELAND para aislar sólo lee mapeado en los sitios únicos en el genoma del ratón. Secuencia de lecturas eran 35 o 36 pares de bases. Los tres archivos de datos de chip-ss fueron: control de p65 chip (10,7 millones de lecturas), C26 chip p65 (11,1 millones de lecturas), y un archivo que representa la secuencia de fondo lee (8,5 millones) obtenido mediante la combinación de control y C26 sonicated cromatina que fue dirigido a través del chip sin anticuerpo primario (sin grupo de anticuerpos). Estos archivos de secuencia de tres post-QC .bam están disponibles en línea en: (https://drive.google.com/folderview?id=0B0Ph0YwXvamQektEaTFkcElSLTQ&usp=sharing) Las secuencias alineadas se convirtieron a .sam formato y luego se suben a la cima programa del buscador en ChIPseeqer [24] con los siguientes parámetros: 1. umbral = 5, 2 veces el cambio = 2 o mayor (en comparación con el fondo), 3. fragmento de longitud = 250 pb, 4. longitud pico de al menos 100 pb y 5 . de separación de pico de al menos 100 pares de bases. Además de la identificación de los picos de control y p65 C26 en relación con el fondo (sin anticuerpo), ChIPseeqer identifica la región del gen de la p65 picos de unión (es decir, localización genómica de los picos).
Los conjuntos de control y picos p65 C26 se realizaron en PeakAnalyzer [25] (http://www.ebi.ac.uk/research/bertone/software#peakanalyzer) a fin de encontrar el gen con la TSS más cercano para cada pico. Esto genera una lista de genes con picos de menos de 100 KB de la SAT. Las listas fueron comparados con las listas de aumento y disminución de la expresión del ARNm del control frente a los datos de microarrays C26 mediante el uso de un algoritmo de Perl se encuentra en una página web desarrollada por Jim Lund en la Universidad de Kentucky (http://nemates.org/MA /progs /compare.html).
control positivo para el chip
para confirmar la correcta unión del anticuerpo p65 estudiamos chip con PCR para dos promotor de NF-B altamente estudiado y verificado consecutiva sitios de unión en el ratón IP-10 (CXCL10) de genes [26]. Este chip experimento también se utiliza un anticuerpo para p50 (Santa Cruz SC-1190X). Un control positivo para la viruta se hizo con la cromatina de miotubos C2C12 que se habían tratado durante 4 horas con 10 ng /ml de TNFa de ratón. Anteriormente puso de manifiesto que este tratamiento fuertemente inducida por un reportero de luciferasa NF-kB y el aumento de la PI-10 niveles de mRNA, ambos de los cuales son dependientes de p65 [27]. Para el experimento de prueba hemos utilizado los métodos descritos en nuestro trabajo previo [21]. cromatina En pocas palabras, el formaldehído fija de miotubos C2C12 tratados y tratados con TNF-se inmunoprecipitó con anticuerpo p65, anticuerpos p50, o ningún anticuerpo y la proteína precipitados capturados-G fueron procesados para producir ADN que fue probada con PCR utilizando cebadores que flanquean los dos NF consecutiva -κB sitios en el gen de la IP-10. Además, también se evaluó p65 y p50 vinculante para el promotor IP-10 usando la cromatina de los músculos de control y C26.
chip-PCR para Fbxo6
chip-PCR se realizó a partir de tejido muscular fijo, se homogeneizó y se sometió a ultrasonidos como para chIP-seq, con la excepción de que el anticuerpo p65 se une a la proteína G perlas magnéticas de pre-incubación (durante la noche a 4 ° C) antes de la incubación con la cromatina, y los productos de ADN se utilizó como molde para PCR con cebadores que flanquean el sitio de unión diana del gen Fbxo6, determinado a partir de chIP-seq. El sitio de destino desde el chip-ss estuvo en el primer intrón del gen Fbxo6, 2 kb aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción. Las secuencias de los cebadores utilizados para la PCR fueron agctcgttgatgtggaccat (cebador de la izquierda) y cctcctgctttaggctcctt (cebador de la derecha) y producen un producto de PCR de 302 pb.
Estadísticas
Un ANOVA o un
t
-test fue utilizado para el análisis, en función del número de grupos que se comparan. Los datos se expresan como medias ± SE, y la significación se estableció en
P Hotel & lt; 0,05. Las estadísticas para los datos de microarrays se describen en la sección de microarrays.
Resultados
Caracterización de los ratones C26
La caracterización de este modelo de tumor en nuestro laboratorio portadores de tumores-implicó la inoculación de CDF1 ratones con células tumorales C26 en PBS /matrigel (n = 164) o con PBS /matrigel solamente (n = 142). Los ratones fueron sacrificados a las 12, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, y 26 días después de la inoculación de células tumorales. En la caquexia severa (días 23 a 26 después de la inoculación) ratones portadores de tumores pierden 22,1% ± 0,8% de la masa corporal inicial, mientras que los controles no tumorales ganaron 12,3% ± 0,7% de la masa corporal inicial (Figura S2A). A medida que la masa tumoral aumento tibial anterior (TA) de la masa muscular disminuido (figuras S2 B). La masa de músculo TA de los ratones severamente caquéctico fue de 40,4 ± 0,3 mg en comparación con 51,1 ± 0,3 mg para los ratones de control emparejados por edad. los ratones portadores del tumor en la caquexia severa tenido 214 ± 8,7 mg de masa almohadilla de grasa del epidídimo mientras que los ratones control tuvieron 465 ± 10 mg (Figura S2C). La masa del bazo de los ratones portadores de tumores fue de 205 ± 4,6 mg en comparación con 75,5 ± 0,7 mg en ratones no portadores de tumores (Figura S2D). masa tumoral aumenta como una función del tiempo después de la inoculación (Figura S2E).
Efecto dominante negativo de proteínas en la atrofia de las fibras musculares de señalización en ratones C26
El medio de fibra portadores de tumores NF-kB