EGFR nanopartículas para el tratamiento de múltiples medicamentos
Extracto
El tratamiento del cáncer resistente a múltiples fármacos (MDR) es un reto clínico . Muchas células MDR receptor del factor de crecimiento epidérmico sobre-expresa (EGFR). Aprovechamos esta expresión a través del desarrollo de nanoportadores, de mezclas de polímeros EGFR para el tratamiento del cáncer utilizando paclitaxel MDR (un agente quimioterapéutico común) y lonidamina (un fármaco experimental; mitocondrial inhibidor de la hexoquinasa 2). Un modelo ortotópico de cáncer de mama humano MDR fue desarrollado en ratones desnudos y se utiliza para evaluar la seguridad y eficacia del tratamiento de nanopartículas. Los parámetros de eficacia incluyeron mediciones del volumen del tumor desde el día 0 a 28 días post-tratamiento, medidas de peso del tumor terminales, la densidad del tumor y la evaluación de la morfología mediante tinción de hematoxilina y eosina de los tumores extirpados, e inmunohistoquímica de secciones de tumores para los marcadores de proteínas MDR (P-glicoproteína, factor inducible por hipoxia, EGFR, hexoquinasa 2, y el factor de células madre). La toxicidad se evaluó mediante el seguimiento de los cambios en el peso corporal de los animales desde el día 0 a través de 28 días después del tratamiento, mediante la medición de los niveles plasmáticos de la enzimas hepáticas ALT (alanina aminotransferasa) y LDH (lactato deshidrogenasa), y por los glóbulos blancos y plaquetas. En estos estudios, este sistema nanotransportador demostró superior de eficacia relativa a la combinación de solución de fármaco (paclitaxel /lonidamina) y tratamientos con un solo agente en forma de nanopartículas y la solución. Las nanopartículas de combinación fueron el único grupo de tratamiento que disminuye el volumen del tumor, el mantenimiento de esta disminución, hasta el punto de tiempo de 28 días. Además, el tratamiento con las nanopartículas /paclitaxel lonidamina EGFR disminución de la densidad del tumor y altera el fenotipo MDR de los xenoinjertos de tumores. Estas nanopartículas combinación EGFR fueron considerablemente menos tóxicos que los tratamientos de solución. Debido al diseño flexible y química de conjugación simple, este sistema nanotransportador podría ser utilizado como una plataforma para el desarrollo de otras terapias contra el cáncer MDR; el uso de este sistema para, terapia EGFR combinación de paclitaxel /lonidamina es un avance en la medicina personalizada
Visto:. Milane L, Z Duan, Amiji M (2011) la eficacia terapéutica y seguridad de paclitaxel /lonidamina Loaded EGFR nanopartículas para el tratamiento de cáncer resistente a múltiples fármacos. PLoS ONE 6 (9): e24075. doi: 10.1371 /journal.pone.0024075
Editor: Dimitris Fatouros, Universidad Aristóteles de Tesalónica, Grecia
Recibido: 13 de mayo de 2011; Aceptado: August 1, 2011; Publicado: 8 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Milane et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer, Institutos nacionales de Salud a través de subvenciones R01 CA-119617 y CA-R01 119617S1 (ARRA Suplemento), y R21 CA-135594. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el desarrollo de cáncer resistente a múltiples fármacos (MDR) a menudo impide el tratamiento clínico del cáncer, ya que da lugar a la enfermedad no responde que puede llevar a la metástasis [1], [2]. MDR se refiere a un estado de resistencia frente a fármacos estructuralmente y /o funcionalmente vinculados [1]. MDR a menudo se adquiere a través de la exposición a agentes quimioterapéuticos pero MDR también puede ser intrínseca (innata) [1].
La hipoxia es una presión de selección microambientales establecido que puede resultar en MDR y resistencia a la terapia de radiación [3], [ ,,,0],4]. En condiciones de hipoxia y estrés celular inducible por hipoxia Factor alfa (HIF-1α) se transloca desde el citoplasma al núcleo; complejos de HIF-α entonces con HIF-β, formando un factor de transcripción activa [3], [4]. Este complejo de HIF activo es entonces capaz de inducir la transcripción mediante la unión a elementos de respuesta a hipoxia (de HRE) en los genes diana; genes diana incluyen P-glicoproteína (P-gp), factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR), y muchas proteínas glicolíticas tales como hexoquinasa 2 (Hxk2) [3], [4]. factores de oxígeno-independientes, tales como la ciclooxigenasa-2 actividad, factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR), proteína de choque térmico 90, y fosfatidilinositol 3-quinasa también pueden estabilizar HIF [4], [5], [6].
P-gp es una bomba de eflujo de fármaco transmembrana de la cassette (ABC) transportador de la familia de unión a ATP; P-gp expresión en el cáncer está asociado con MDR y mal pronóstico [2]. la expresión de EGFR en algunos tipos de cáncer también se asocia con enfermedad agresiva [7]. Más de expresión de EGFR conduce a la agrupación de receptores en la membrana celular lo que hace que una hiper-sensible de células a los sustratos de EGFR; esto ayuda a la supervivencia de las células MDR, regiones tumorales hipóxicas especialmente que pueden ser distal de un suministro de nutrientes continua [7]
Otra ventaja de supervivencia para las células del cáncer es la adquisición de energía a través de la glucólisis.; ya sea anaeróbico (el efecto Pasteur) o aeróbico (el efecto Warburg) [8]. Muchas proteínas glicolíticas tales como la hexoquinasa 2 son objetivos HIF [3], [4], [9]. Hexoquinasa cataliza el primer paso de la glucólisis; la hexoquinasa 2 isoforma está directamente asociada con mitocondrias y se sobreexpresa en muchos tipos de cáncer [4], [10], [11]. asociación mitocondrial de hexoquinasa 2 previene la unión de pro-apoptóticas Bcl-2 proteínas miembros de la familia a través de la inhibición espacial del complejo del poro de transición de permeabilidad mitocondrial; esto también ayuda a la supervivencia celular, ya que evita la liberación del citocromo c y la posterior cascada de la apoptosis [10]
El sistema de administración de fármacos actuales objetivos de forma activa las células cancerosas resistentes a múltiples fármacos a través de la unión de EGFR.; la superficie de los nanovehículos se han modificado con un péptido-EGFR específico. Este sistema trata el cáncer MDR mediante el uso de una combinación de paclitaxel y lonidamina. Paclitaxel (PTX) es un agente quimioterapéutico común que hiper-estabiliza los microtúbulos, lo que impide la división celular; PTX es un agente no específico y se asocia con una alta toxicidad residual. Lonidamina (LON) (1 - [(2,4-diclorofenil) metil] -1H-indazol-3-carboxílico) es un inhibidor de la hexoquinasa 2 que se ha demostrado que induce la apoptosis y tratar la MDR en varias líneas celulares de cáncer [12] , [13], [14]. En los Estados Unidos, la Fase II de ensayos clínicos de LON como un tratamiento para la hiperplasia benigna de próstata fueron suspendidas debido a la toxicidad hepática asociada [15], [16]. Este sistema de administración de fármacos tiene como objetivo mejorar la eficacia y reducir la toxicidad de PTX y LON a través del uso de la terapia de combinación y segmentación activo.
Este estudio examina la eficacia terapéutica y la seguridad de las nanopartículas dirigidas a EGFR (PN) cargada con PTX y LON. Estos nanovehículos polímero de mezcla se evaluaron en un modelo ortotópico de cáncer de mama MDR. El tamaño del tumor y la progresión de crecimiento se utilizó para evaluar la eficacia del tratamiento. La seguridad /toxicidad de este tratamiento se evaluó midiendo el cambio en el peso corporal, los niveles plasmáticos del hígado enzimas ALT (alanina aminotransferasa) y LDH (lactato deshidrogenasa), y glóbulos blancos y plaquetas. Para caracterizar aún más la eficacia de esta terapia, H & amp; E tinción de secciones de tumor de cada grupo se compararon. Además, se utilizó inmunohistoquímica (IHC) de las secciones de tumores para la expresión de P-gp, HIF-1α, EGFR, Hxk2, CD-31 y factor de células madre (SCF) para evaluar el carácter MDR de los tumores después del tratamiento. Como se ha demostrado por el esquema en la Figura 1, el tratamiento con la NPs EGFR cargado con PTX y LON disminución del volumen del tumor y la disminución de la expresión de hipóxico y proteínas MDR asociada en el modelo ortotópico de cáncer de mama. Ratones
desnuda con el , xenoinjertos de tumores de mama resistentes a múltiples fármacos ortotópico fueron tratadas con nanopartículas de mezcla de polímeros, EGFR cargadas con paclitaxel y lonidamina. Esta formulación de nanopartículas se internaliza a través del receptor EGFR; tratamiento conduce a una cascada de cambios celulares y una disminución en el volumen del tumor. Según la evaluación por inmunohistoquímica de xenoinjertos de tumores, el tratamiento de nanopartículas disminuyó la expresión de hipóxico y marcadores resistentes a múltiples fármacos (EGFR, receptor del factor de crecimiento epidérmico; HIF, el factor inducible por hipoxia; Hxk2, hexoquinasa 2; Pgp, P-glicoproteína; SCF, factor de células madre).
Resultados
Nanopartículas Caracterización
el objetivo del diseño de este sistema nanotransportador era apuntar de forma activa las células MDR por la unión al receptor EGFR y posteriormente entregar PTX y LON a el sitio de un tumor. Para lograr la eficiencia de carga apreciable para ambos fármacos (aproximadamente ≥70%) PCL (policaprolactona) se utilizó como el constituyente de nanopartículas primaria (optimización de formulación se describe en nuestro trabajo publicado previamente [17]). Para lograr activa dirigidas a un constructo de PLGA-PEG-péptido se sintetizó y se incorporan en los PN PCL (policaprolactona). Tanto un PLGA-PEG y un PLGA-PEG-péptido constructo se incorporaron en la formulación para lograr la modificación de superficie con PEG y el péptido. El PLGA de la construcción interactúa con el núcleo PCL de las partículas, ayudando en lonidamina y paclitaxel encapsulado, mientras que el PEG y el péptido-EGFR específica sobresalen de la superficie de la partícula que permite la orientación activa y la protección del sistema reticuloendotelial. La síntesis y caracterización completa de este sistema se describe en nuestro otro trabajo [17]; NMR se utilizó para evaluar el proceso de injerto, ESCA se utilizó para confirmar la presencia del péptido en la superficie de la PN, la encapsulación de fármacos y cinética de liberación se cuantificó con el tiempo, y EGFR focalización se cuantificó en un panel de nueve líneas celulares con diferentes los niveles de expresión de EGFR. Como se muestra en la Figura 2, SEM de los NPs confirmó la escala nanométrica de las partículas que promediaron entre 120 -160 nm.
El tamaño nanométrico de las nanovehículos se confirmó con una micrografía electrónica de barrido de las nanopartículas. La barra de escala es de 2 micras.
El análisis de eficacia
MDA-MB-231 tumores establecidos a partir de células pre-acondicionado hipóxicas fueron cultivadas a 100 mm
3 tamaño y luego los ratones fueron tratados con uno de los siguientes 8 tratamientos; (1) dirigida PN cargado con PTX y LON, (2) SOL de PTX y LON, (3) dirigidos PN cargado con PTX, (4) PTX SOL, (5) dirigido PN cargado con LON, (6) LON SOL, (7) en blanco PN específicas (sin drogas), y (8) solución salina. El tratamiento continuó durante 28 días. Durante este tiempo, el tamaño del tumor y el peso corporal se controlaron y se recogió sangre para evaluar la toxicidad.
Figura 3.A ilustra el crecimiento del tumor en cada grupo de tratamiento desde el día 0 (fecha de iniciación del tratamiento) hasta el día 28. el crecimiento del tumor para los grupos de solución salina y del vehículo (NP blanco) tratada es similar; mientras que el tratamiento con LON LON SOL y PN generado una disminución en el volumen del tumor ligeramente. El tratamiento con PTX SOL y PTX PN dio lugar a una nueva disminución en el volumen tumoral. El tratamiento con la combinación (LON y PTX) SOL crecimiento del tumor en realidad reprimida durante 10 días, en el que el crecimiento se reanuda a punto un ritmo mucho más lento. Esto se ilustra en la Figura 3.B junto con el tratamiento NP combinación. Los NPs de combinación eran el único grupo de tratamiento que en realidad disminuyó el volumen del tumor, el mantenimiento de esta disminución hasta el punto de tiempo 28 días cuando el volumen del tumor se acercó al volumen inicial del tumor.
Eficacia de la terapia de combinación de nanopartículas se evaluó mediante la medición de los cambios en el volumen del tumor a partir de 0-28 días post-tratamiento y midiendo el peso del tumor de terminales a los 28 días post-tratamiento. Día 0 fue el primer día de tratamiento. El peso corporal se utiliza como un parámetro de toxicidad y se midió desde 0-28 días post-tratamiento. Para todos los gráficos, cada punto de datos representa la media ± SD con un
n
= 4. (A) El volumen del tumor. Los ratones se trataron con uno de los ocho tratamientos mediante inyección en vena de cola; solución salina (círculos negros), vehículo (nanopartículas en blanco; cuadrados grises), solución lonidamina (LON Sol; triángulos verdes), nanopartículas lonidamina (LON NP; triángulos invertidos púrpura); solución de paclitaxel (PTX Sol; los diamantes de color azul claro), las nanopartículas de paclitaxel (PTX NP; naranja círculos abiertos), lonidamina y solución de combinación de paclitaxel (LON + PTX Sol; asteriscos azul oscuro), y lonidamina y paclitaxel nanopartículas de combinación (LON + PTX NP; estrellas de color verde claro). (B) El volumen del tumor (de la terapia de combinación). Para aclarar la diferencia entre lonidamina y tratamiento de combinación con paclitaxel en forma de solución (LON + PTX Sol; círculos abiertos) en comparación con el tratamiento de nanopartículas (NP LON + PTX; círculos cerrados), se graficaron aquí por separado estos dos grupos. (C) El peso del tumor. El peso del tumor terminal (a los 28 días post-tratamiento) se trazan para cada grupo de tratamiento. El número encima de cada barra representa el volumen medio del tumor terminal (desde el panel A). Los asteriscos directamente encima de las barras de error indican significancia entre la solución salina y del grupo indicado (* p & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001). (D) El peso corporal. El peso corporal se midió y se representó como porcentaje de cambio (en relación con el peso corporal inicial) de 0-28 días posteriores al tratamiento. Los grupos incluyen; ningún tumor (círculos negros), solución salina (cuadrados grises), vehículo (triángulos verdes), solución lonidamina (LON Sol; triángulos invertidos de color púrpura), nanopartículas lonidamina (LON NP; diamantes de color azul claro), solución de paclitaxel (PTX Sol y en naranja círculos abiertos ); nanopartículas de paclitaxel (cuadrados de color azul oscuro), y la solución lonidamina combinación de paclitaxel (LON + PTX Sol, la luz verde triángulos abiertos) y lonidamina y paclitaxel nanopartículas de combinación (LON + PTX NP; rosa triángulos abiertos invertidos) guía empresas.
se utilizó una prueba de ANOVA de dos vías para analizar los datos; los resultados se presentan en la Tabla 1. No hubo significación para cualquier punto de tiempo entre la solución salina y los grupos tratados con vehículo. Por esta razón, las comparaciones de cada grupo con el grupo de tratamiento con vehículo no se incluyeron en la Tabla 1. La Tabla 1 compara los grupos de tratamiento y enumera los días post-tratamiento que se alcanzó un nivel específico de significado. En particular, entre los 4 y 12 días, no es significativa la diferencia entre ambos grupos, SOL combinación y el grupo NP combinación en comparación con solución salina, LON SOL, LON PN, PTX SOL, y PTX NP tratamientos. También hay significancia entre el grupo SOL combinación y el grupo NP combinación después de 10 días de tratamiento.
Los pesos del tumor de cada grupo se presentan en la Figura 3.C. El volumen medio del tumor en el día 28 (sacrificio) se indica encima de la barra para cada grupo. Los pesos de los tumores se corresponden con los datos de volumen de tumor terminales. La terapia de combinación con el PN EGFR fue significativamente más eficaz para reducir el volumen del tumor que el tratamiento con un solo agente.
Seguridad y toxicidad Perfiles
El peso corporal de cada grupo también se monitorizó durante todo el curso del tratamiento y se presenta en la Figura 3.D. Todos los grupos SOL sometieron a una disminución inicial en el peso corporal, que se mantuvo inferior a lo largo del curso del tratamiento. Este efecto fue la más pronunciada para la combinación SOL. Los grupos tratados con PTX PN y con la combinación PN también se sometieron a una disminución inicial en el peso corporal; Sin embargo, hubo una recuperación moderada de esta disminución entre 7-10 días después del tratamiento. El descenso inicial y sostenida de los grupos SOL es más probable debido a la solución Cremophor® EL. La disminución en el peso corporal asociados con los NPs de combinación y los NPs PTX es más probable debido a la citotoxicidad de PTX.
Las muestras de sangre también se recogieron en el día 0, día 14, y día 28 del tratamiento y se analizaron para los niveles de LDH y ALT, así como de glóbulos blancos y plaquetas. Los resultados del análisis de sangre día 14 se representan en la Figura 4; para los cuatro parámetros, no hubo significación entre cualquier grupo de tratamiento en el día 0. LDH (Figura 4.A) está elevada en el cáncer y debido a daños en los tejidos, como tal; es un marcador común para la enfermedad y la toxicidad. Al día 14 hubo significación entre el grupo de solución salina y el grupo tratado con SOL PTX, así como el grupo tratado con la combinación SOL. No había significación entre el grupo NO Tumor y todos los grupos de tratamiento en día 14 (p & lt; 0,01) y en el día 28 (p & lt; 0,05; Figura S1). Esto es más probable debido al crecimiento del tumor en sí, y no directamente asociado con el tratamiento administrado a cada grupo. Un aumento de ALT (Figura 4.B) se asocia a menudo con daño hepático. En el día 14, hubo significancia entre el grupo de solución salina y todos los grupos SOL. De importancia, en este punto de tiempo también había significación entre el SOL combinación y la combinación NPs. La terapia de combinación LON /PTX con resultados FEN en el menor toxicidad hepática que el tratamiento con la combinación SOL. También había significación entre el grupo sin tumor (y el grupo de vehículo) y todos los grupos de tratamiento SOL en día 14 (
p
& lt; 0,01 para la comparación No Tumor,
p
& lt; 0,05 para comparación de vehículo).
Las enzimas del hígado y los recuentos sanguíneos se utilizaron para evaluar la toxicidad. Para todos los gráficos, cada punto de datos representa la media ± SD con un
n
= 4. La daga doble representa la significancia entre Ningún grupo tumoral y todos los otros grupos (‡
p Hotel & lt; 0,05 , ‡‡
p Hotel & lt; 0,01, ‡‡‡
p Hotel & lt; 0,0001). El signo sección representa la significación entre el grupo indicado y todos los grupos de solución (§
p Hotel & lt; 0,05, §§
p Hotel & lt; 0,01, §§§
p & lt
; 0,0001). Los asteriscos directamente encima de las barras (sin paréntesis angulares) representa significación entre ese grupo y el grupo de solución salina, mientras que por encima de los asteriscos indican entre paréntesis significación entre grupos (*
p Hotel & lt; 0,05, **
p
& lt; 0,01, ***
p
& lt; 0,0001). (A) La lactato deshidrogenasa (LDH). (B) La alanina aminotransferasa (ALT). (C) Recuento de plaquetas. (D) de glóbulos blancos (WBC).
Una disminución en el recuento de plaquetas (Figura 4.C) se asocia a menudo con la toxicidad de la quimioterapia. En el día 14, hubo significancia entre el grupo sin tumor y todos los grupos SOL. En este punto de tiempo también había significación entre el grupo de solución salina (y vehículo) y todos los grupos SOL. el recuento de leucocitos elevados (Figura 4.D) son indicativos de daño tisular. En consonancia con los otros datos de toxicidad, existe significancia entre la solución salina y los grupos tratados con vehículo y todo el SOL grupos tratados. También hay significancia entre cada grupo SOL y el grupo NP correspondiente. Los tratamientos NP son menos tóxicos que los tratamientos con fármacos SOL. Hay un significado entre el grupo Sin tumoral y todos los demás grupos. Como esta diferencia es evidente en los grupos de solución salina y vehículo también, lo más probable es una indicación de daño tisular asociado con el desarrollo de tumores en los ratones. En conjunto, el análisis de sangre indica que la terapia de NP es significativamente menos tóxico que el tratamiento farmacológico SOL.
Histología
A fin de evaluar la toxicidad, hematoxilina y eosina de secciones de tumor de cada grupo de tratamiento fueron examinados ( Figura 5). Se adquirieron imágenes tanto del perímetro del tumor y el núcleo del tumor. Común a todas las secciones de tumores, es la matriz desordenada de crecimiento celular. Cada tumor tiene una clara demarcación de aumento de la densidad celular en el perímetro del tumor. Este perímetro, sin embargo, no es consistente entre los grupos de tratamiento. El grupo tratado solución salina, el grupo tratado con NPs en blanco, y el grupo tratado con SOL LON parecen tener un límite de tumor mucho más gruesa de las células. Esto aparece ligeramente disminuyó en el grupo tratado LON NP, y más marcadamente disminuida en los grupos tratados con PTX SOL, PTX PN, combinación SOL, y la combinación de los PN. La densidad del núcleo parece seguir un patrón similar al perímetro de la densidad en los grupos de tratamiento. La densidad celular en las secciones de núcleo del tumor del grupo de solución salina, el grupo blanco NP, el grupo LON SOL, y el grupo LON NP parecen mucho más alta que las densidades de células del grupo PTX SOL, el grupo PTX NP, el grupo SOL combinación , y el grupo NP combinación. La densidad celular disminuida del grupo NP combinación puede explicar la disminución dramática en el peso del tumor final. Estas disminuciones en la densidad puede ser un sello distintivo de un tratamiento eficaz.
Las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los núcleos se tiñeron con hematoxilina (color azulado), mientras que otras fracciones celulares se tiñeron con eosina (rojo y rosa colores) guía empresas
IHC de la sección del tumor de cada grupo se analizaron para la expresión de los siguientes seis proteínas.; P-gp, HIF-1α, EGFR, CD-31, Hxk2, y SCF (Figura 6-8). Para cada sección, F-actina se tiñó con faloidina (rojo), los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (azul), y la proteína de interés se marca con anticuerpos secundarios que son Alexa Fluor ® 488 conjugado (verde).
las secciones de tejido se sondearon con anticuerpos primarios contra la proteína de interés, a continuación, marcado con Alexa Fluor ® 488 conjugado con anticuerpos secundarios (verde). F-actina se tiñó con Alexa Fluor ® 568 faloidina (rojo) y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (azul).
Las secciones de tejido se sondearon con anticuerpos primarios contra la proteína de interés, a continuación, marcado con Alexa Fluor ® 488 conjugado con anticuerpos secundarios (verde). F-actina se tiñó con Alexa Fluor ® 568 faloidina (rojo) y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (azul).
Las secciones de tejido se sondearon con anticuerpos primarios contra la proteína de interés, a continuación, marcado con Alexa Fluor ® 488 conjugado con anticuerpos secundarios (verde). F-actina se tiñó con Alexa Fluor ® 568 faloidina (rojo) y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (azul).
P-gp expresión (Figura 6) fue muy alta en el grupo de solución salina, el grupo NP en blanco, y en el grupo LON SOL. No parece haber una ligera disminución en el grupo NP LON, el grupo PTX SOL, el grupo NP PTX y el grupo SOL combinación. Había una más notable disminución en el grupo NP combinación. Es posible que un mes de tratamiento con la terapia de combinación comienza a invertir la MDR cuando se administra como SOL (ligera disminución en la P-gp), pero invierte más completamente MDR cuando se administra como tratamiento NP (dramática disminución).
HIF -1α (Figura 6) fue muy alta en el grupo de solución salina, blanco grupo NP tratado, grupo PTX SOL, y el grupo NP PTX. En estas secciones con alta expresión, HIF-1α parece ser co-localizada con tanto la fracción celular citoplasmática (amarillo y verde) y con el núcleo de las células (blanco). LON tratamiento SOL y más notablemente, el tratamiento LON NP disminución de la expresión de HIF-1α. Como LON inhibe hexoquinasa 2 (y el efecto Warburg), esta disminución en la expresión de HIF-1α puede ser debido a el bucle de realimentación entre las vías glicolíticas y HIF. Hay una nueva disminución en la expresión de HIF-1α con el tratamiento combinado. LON puede disminuir el efecto Warburg, disminuir la actividad de la vía HIF, y sensibilizar el tumor a los efectos de la PTX, que conduce a la reversión MDR.
Había un muy alto nivel de EGFR (Figura 7) en la expresión todas las secciones de tejido; sin embargo, el grupo NP combinación parecía tener niveles ligeramente más bajos en relación a los otros grupos. Esto puede indicar que la agresividad y carácter general del tumor se ha transformado. Por otro lado, CD-31 (Figura 7) la expresión fue baja /no detectable en todas las secciones del tumor. CD-31 se incluyó como marcador de la angiogénesis.
La expresión de Hxk2 (Figura 8) siguió un patrón similar a la expresión de HIF-1α. Hubo un alto nivel de expresión en el grupo tratado solución salina, el grupo blanco NP, el grupo PTX SOL, y el grupo PTX NP. Hubo una disminución en la expresión de Hxk2 en el grupo tratado LON SOL y una disminución adicional en el grupo tratado LON NP, el grupo SOL combinación, y el grupo NP combinación. LON PN parecen tener más de un efecto sobre la expresión de Hxk2 LON SOL, y este efecto parece ser mayor con la terapia de combinación.
La última proteína que se examinó fue SCF (Figura 8). Había un nivel moderado de expresión de SCF en el grupo tratado solución salina; esta expresión parecía más co-localizado con F-actina (amarillo) en el grupo tratado con NP en blanco; y apareció más co-localizada con núcleos celulares (blanco) en el grupo LON SOL, el grupo SOL PTX, y el grupo NP PTX. No parecía que tanto F-actina y nucleico co-localización en el SOL combinación grupo tratado, mientras que hubo una marcada disminución en la expresión en el grupo NP LON y una disminución adicional en el grupo tratado combinación NP.
Colectivamente , la solución salina y los grupos tratados NP en blanco tienen altos niveles de expresión de P-gp, HIF-1α, EGFR, y Hxk2 relación a los otros grupos de tratamiento. El tratamiento con la combinación NPs resultó en una disminución en la expresión de P-gp, HIF-1α, EGFR, Hxk2 y SCF con respecto a los otros grupos. Aunque menos notable, el tratamiento con la combinación SOL demostró un patrón similar. Esto indica que el tratamiento combinado en efecto, transformar el carácter innato de los tumores resistentes a múltiples fármacos.
Discusión
La completa
in vitro
caracterización de este sistema de administración de fármacos demostró la eficacia mejorada de la terapia de combinación PTX /LON, EGFR unión de los PN, y la liberación sostenida del fármaco del sistema [17]. Hemos desarrollado un novedoso modelo ortotópico de cáncer de mama humano MDR utilizando células pre-acondicionado de hipoxia para establecer xenoinjertos de tumores en ratones desnudos (presentados para su publicación y brevemente descritos en este trabajo). El uso de este
in vivo
modelo, las evaluaciones de este sistema NP EGFR demostrado que estas partículas tienen un perfil farmacocinético superiores (T
½, AUC
0-∞, AUMC
0- ∞, y MRT
0-∞) con relación a un sistema de NP no específica comparable [18]. La investigación actual demuestra que el tratamiento con LON EGFR /PTX NPs es más eficaz que la combinación de tratamiento SOL (disminución de volumen del tumor y la disminución de peso del tumor). El aumento de la eficacia del tratamiento con NP puede ser debido al efecto de permeabilidad y retención mejorada y la orientación activa. Aunque la terapia de combinación con SOL fármaco fue también eficaz en relación con el tratamiento de agente único, la toxicidad asociada con el tratamiento SOL fue mucho más alta en comparación con el tratamiento NP. La combinación PN resultó en menos de una disminución en el peso corporal y más de una recuperación en el peso corporal, menos LDH, ALT menos, reducir los conteos de GB, y del recuento de plaquetas. La toxicidad más alta de tratamiento SOL en relación con los NPs es más probable debido a los efectos de Cremophor® EL. es más probable La significación entre el grupo de solución salina y el grupo PTX SOL, así como el grupo de combinación SOL debido a una combinación sinergista de la citotoxicidad de PTX y la toxicidad de la Cremophor® EL SOL. tratamiento NP es una alternativa más segura que la combinación de fármacos SOL. El análisis cualitativo demostró que la combinación de tratamiento NP resultó en una disminución más dramática en el núcleo del tumor y la densidad perímetro relativo a la combinación SOL. Este cambio en la densidad puede ser proporcional al efecto terapéutico
.
cualitativa IHC análisis de expresión de la proteína también demostró una disminución más pronunciada en la expresión de Pgp, HIF-1α, EGFR, Hxk2 y SCF después del tratamiento con combinación PN. SCF se incluyó en el análisis de IHC para examinar si el tratamiento tuvo un efecto sobre la expresión de SCF y para examinar si SCF es de hecho un marcador de MDR en este modelo de tumor. Parece que los dos conceptos fundamentales de las células madre del cáncer coexisten; hay cáncer de
iniciar
células que se originan como células madre, pero se transforman en células que causan cáncer y en segundo lugar, no son cáncer tallo
derivada
células que son células cancerosas que se desarrollan propiedades madre-madre similares, estas células son más conocidas como células resistentes a múltiples fármacos. En línea con el concepto de que las células MDR pueden desarrollar propiedades madre-como que se identifique como células madre del cáncer, diferentes estudios han demostrado que los factores de estrés de células tales como la hipoxia, que son eficientes en la inducción de la agresividad del cáncer y fenotipos resistentes a múltiples fármacos, también inducen propiedades madre-como en células de cáncer, tales como la expresión del factor de células madre (SCF) [3], [4], [9], [19], [20]. Puede ser que como los tumores se vuelven menos hipóxica (LON NPs y combinación NPs), SCF también disminuye. El diferencial de co-localización de SCF se puede atribuir a su papel en muchos diferentes vías señaladamente, tales como la vía de c-kit; también existe una forma soluble y transmembrana de SCF. Los diferentes tratamientos pueden alterar las vías señaladamente distintas dominadas por una de las isoformas de SCF.
En general, la IHC demostró que la combinación de tratamiento NP parece cambiar el fenotipo del tumor, disminuyendo el carácter MDR de los xenoinjertos (Figura 1 ). En conjunto, los NPs EGFR fueron más eficaces en el tratamiento de la MDR de SOL y los tratamientos con un solo agente y menos tóxicos que los tratamientos SOL. Este sistema nanotransportador es un paso en el camino hacia la medicina personalizada.
Comentarios finales
El tratamiento de la TB con un cóctel de agentes quimioterapéuticos es un enfoque clínico común. Sin embargo, como MDR es un estado de enfermedad dinámico, muchas de las combinaciones de fármacos actual serán ineficaces después de su uso perpetuo. Como tal, hay una demanda de nuevas combinaciones de fármacos para el tratamiento de la MDR. También hay una necesidad clínica de reducir la toxicidad asociada con estos tratamientos como la toxicidad a menudo exige la reducción de dosis y /o un aumento en el intervalo de dosificación que puede ayudar al desarrollo de MDR adquirida. Combinación de terapia LON /PTX usando EGFR PN representa un nuevo enfoque para el tratamiento del cáncer MDR; este enfoque se refiere a la demanda clínica de nuevas combinaciones de drogas y proporciona una solución a la toxicidad de la quimioterapia asociada a través del uso de un sistema de nanotransportador.
Materiales y Métodos
Polymer y el péptido Conjugación
Este sistema nanotransportador ha sido completamente caracterizado y descrito en nuestras otras obras [17], [18]. El GE11 péptido se utilizó para llevar a cabo la orientación activa del receptor EGF; este es un ligando de EGFR establecida con la siguiente secuencia: YHWYGYTPQNVIGGGGC [21], [22]. Conjugación del GE11 al constructo PLGA-PEG se consiguió usando linakge maleimida /cisteína (residuo PEG tiene una maleimida terminal mientras el péptido tiene una cisteína terminal). GE11 fue sintetizado por el Fondo para la Universidad de Tufts Core, Boston, MA. Para sintetizar tanto el PLGA-PEG-péptido y PLGA-PEG construye, 50:50 poli (DL-lactida
co
-glycolide) (PLGA) con una viscosidad inherente de 0,15 hasta 0,25 (Durect Lactel® Adsorbable se utilizó Pelham, AL); polímeros; poli amina (etilenglicol) PEG-maleimida (MW 2000; Tecnología jenkem; Allen, TX) se utilizó para la construcción de PLGA-PEG-péptido, mientras que m-PEG-amina (MW 2000; Arab, AL; LaysanBio) se utilizó para sintetizar el constructo PLGA-PEG.