Extracto
Varios estudios han provocado el aumento de evidencia para apoyar la hipótesis de que los miRNAs juegan un papel fundamental en múltiples procesos de carcinogénesis, incluyendo el crecimiento celular, la apoptosis, la diferenciación y la metástasis. En este estudio, hemos investigado el papel potencial de miR-31 en el cáncer colorrectal agresividad (CRC) y sus mecanismos subyacentes. Encontramos que el miR-31 aumenta en las células CRC originado a partir de focos metastásicos y tejidos CRC primarios humanos con metástasis en los ganglios linfáticos. Por otra parte, el alto nivel de expresión de miR-31 se asoció significativamente con un fenotipo más agresivo y pronóstico pobre de los pacientes con CCR (
p Hotel & lt; 0,05). El estable sobreexpresión de miR-31 en las células CRC era suficiente para promover la proliferación celular, la invasión y la migración
in vitro
. Se facilitó el crecimiento del tumor y la metástasis
in vivo
también. Otros estudios demostraron que el miR-31 se puede unir directamente a la región 3 'no traducida (3'UTR) del SATB2 mRNA y posteriormente reprimir tanto en el mRNA y las expresiones de proteínas de SATB2. La expresión ectópica de SATB2 por transitoriamente transfectadas con el vector pCAG-SATB2 que codifica la secuencia codificante completa SATB2 podría revertir los efectos de miR-31 sobre la Convención tumorigénesis y progresión. Además, ectópico sobreexpresión de miR-31 en las células inducidas CRC transición epitelio-mesenquimal (EMT). Nuestros resultados ilustran que la sobre regulación de miR-31 juega un papel importante en la proliferación celular CRC, la invasión y la metástasis
e in vitro
in vivo a través
represora directa SATB2, lo que sugiere un potencial aplicación de miR-31 en la predicción del pronóstico y la aplicación terapéutica en el CCR
Visto:. Yang MH, Yu J, N Chen, Wang XY, XY Liu, Wang S, et al. (2013) elevada microARN-31 Expresión Regula la progresión del cáncer colorrectal mediante la represión de su objetivo de genes SATB2. PLoS ONE 8 (12): e85353. doi: 10.1371 /journal.pone.0085353
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Agosto, 2013; Aceptado: 25 Noviembre 2013; Publicado: December 30, 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (nº 81000953, 81172242, 81071735), los grandes proyectos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China ((. No 81090422), Programa Estado clave de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U1201226), Programa nacional de Investigación básica de China (973 Programa, Nº 2010CB529402), Programa clave de la Fundación nacional de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (2010B031500012) y la Fundación nacional de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (10451051501004710). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio , recopilación de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Todos los autores han leído y aprobado el documento de su presentación al PLoS ONE los autores han declarado que no existen intereses en competencia..
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más comunes en el mundo. Aunque varios tipos de tratamientos se han desarrollado recientemente para los pacientes con CCR, mal pronóstico sigue siendo en pacientes con CCR avanzado [1]. La mayoría de las muertes de CRC se han asociado con la invasión tumoral y la metástasis. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de CRC metástasis es de importancia crucial en el desarrollo de estrategias terapéuticas para los pacientes con CCR avanzado.
microRNAs (miRNAs) son una clase abundante de muy conservadas, corto, de regulación (aproximadamente 22 nt) ARNs no codificantes que se expresan ampliamente en los organismos vivos. Se unen a la 3'UTR de ARNm, haciendo que sea mRNA degradación molécula o inhibición de traducción [2]. miRNAs tienen diversas funciones, incluyendo la regulación de la diferenciación celular, la proliferación y la apoptosis [3,4]. Por lo tanto, un buen número de estudios han descrito el papel fundamental de miRNAs en los múltiples procesos de carcinogénesis, incluyendo metástasis [3,5,6]. Por otra parte, la expresión de los análisis han revelado característicos firmas de miARN en los cánceres humanos específicos [7-9].
Varios investigadores informó que el miR-31 hasta reguladas en el CCR [10-12] y el carcinoma de células escamosas de la lengua [13], pero las reguladas en el cáncer de mama [14], cáncer gástrico [15], mesotelioma maligno [16] y el cáncer de páncreas [17] usando QRT-PCR. Sin embargo, el significado pronóstico clínico, la función y la actividad reguladora de miR-31 en el CRC no se han entendido completamente todavía. En este estudio, hemos explorado el papel inequívoco de miR-31 en el CCR y encontramos que la sobre regulación de miR-31 se asoció con los fenotipos agresivos de CRC y mal pronóstico en los pacientes. Otras investigaciones revelaron que la expresión excesiva de miR-31 en el CCR llevó a aumentar la proliferación de células tumorales y la motilidad
in vitro
y
in vivo
. El presente estudio determina una función positiva de miR-31 en la carcinogénesis, la invasión y la migración, a través de la represión de la expresión SATB2 en el CCR.
Materiales y Métodos
Ética declaración
La utilización de tejidos para este estudio ha sido aprobado por el Comité Ético del Hospital Nanfang, Universidad Médica del Sur. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado antes de su uso de estos materiales clínicos con fines de investigación. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad Médica del Sur (Número de Permiso: SYXK2011-0074). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Preparación de tejidos y cultivos celulares
frescos y fijados en formalina,, muestras de tejido tumoral colorrectal fueron incluidos en parafina obtenidos de pacientes con un diagnóstico de CCR primario y luego se sometió a cirugía electiva en el hospital Nanfang, Universidad médica del Sur (Guangzhou, china). La utilización de tejidos para este estudio ha sido aprobado por el Comité Ético del Hospital Nanfang, Universidad Médica del Sur. Un total de 31 casos de CCR tejidos frescos estaban recién congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su uso posterior. Y se recogieron 143 casos de muestras de tejido archivadas CRC y se usan en la investigación clínico-patológico y pronóstico de miR-31. Ningún paciente recibió ninguna quimioterapia preoperatoria o radioterapia. Un conjunto completo de datos clínico-patológicos se poseía, incluyendo la edad, el sexo, el tamaño del tumor primario, la diferenciación del tumor, estadio T, metástasis en los ganglios linfáticos y metástasis a distancia. Seguimiento completo, que van desde 1-96 meses, estaba disponible para la cohorte de 143 pacientes, y la mediana de supervivencia fue de 56 meses
.
Las células embrionarias de riñón humano 293T y las líneas celulares de CRC humano DLD-1 , HCT116, SW480, SW620, Lovo se obtuvieron a partir de un banco de células en la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). En estudios anteriores, hemos descrito un subclon llamado M5 con capacidades mejoradas metastásicos en el hígado. También hemos descrito un subclon llamado SCP 51 con altas capacidades metastásicas en ganglios linfáticos y el hígado. Estos subclones se aislaron por
in vivo
selección de células SW480 a través de un proceso descrito en estudios previos [18-20]. Todas las líneas celulares de CRC se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD, EE.UU.) con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, EE.UU.) y 100 U /ml de penicilina /estreptomicina (Gibco). Ellos se mantuvieron en una cámara húmeda con 5% de CO
2 a 37 ° C. 293T se mantuvo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% FBS.
aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR
El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). cDNA fue sintetizado con el kit de reactivos PrimeScript RT (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Un cuantitativa tallo-bucle RT-PCR se llevó a cabo para detectar la expresión de la madurez de miR-31 con la ABI TaqMan
® kit de microARN de ensayo (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.) y los cebadores específicos de genes (Applied Biosystems, Foster City , EE.UU.), utilizando un sistema de PCR en tiempo real ABI 7500. El ensayo se realizó por triplicado para cada caso para permitir la evaluación de la variabilidad técnica.
La hibridación in situ y la evaluación de la tinción de miR-31
En la hibridación in situ (ISH) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca). secciones de parafina embebido (4 m de espesor) se deparaffinized con xileno y rehidratada con etanol diluida de grado reactivo. Los portaobjetos se tratan con proteinasa K a 37 ° C durante 20 minutos. A continuación, se hibridaron previamente en una solución de hibridación a 50 ° C durante 2 horas. Posteriormente, 40 nM de un modificado con ácido, 'digoxigenina 5 nucleico bloqueado (DIG) marcado con sonda de oligonucleótido de hsa-miR-31 o una sonda de control mezclado (Exiqon) se añadió a la solución de hibridación y se hibridan a una temperatura de 50 ° C durante la noche. Se aplicó un fosfato alcalino anti-DIG anticuerpo conjugado (Roche, Mannheim, Alemania). Después de ser lavado en solución de tinción, las secciones se incubaron en /BCIP desarrollo de solución NBT (Roche) a 37 ° C durante 15 a 30 minutos. A continuación, se tiñeron por contraste con rojo nuclear.
Para evaluar las características clínicas de los pacientes, las secciones de tejido teñido ISH se revisó y anotó por separado por dos patólogos cegados. La tinción de miR-31 se evaluó mediante un método relativamente simple y reproducible de puntuación [21,22]. En una escala de 0 a 3, la intensidad de la tinción se puntuó como sigue: negativo (sin tinción, 0), débil (azul claro, 1), media (azul, 2), o fuerte (de color azul oscuro, 3). La extensión de la tinción se define como el porcentaje de áreas de tinción positiva de las células tumorales o células epiteliales colónicas normales en relación con toda la zona del tumor o sección completa para las muestras normales. El grado de tinción se puntuó en una escala de 0 a 4 como sigue: 0, 0%; 1, 1-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; y 4, 76 a 100%. La suma de las puntuaciones de tinción intensidad y la tinción-medida se utilizó como marcador final tinción de miR-31 (0-7). Para el análisis estadístico, un marcador final de tinción de ≥ 3 se considera alto.
Preparación del vector
Se seleccionó un fragmento de ADN de 184 pb correspondiente a pre-miR-31, y la flanquean secuencia se amplificó y se clonó en pLVTHM vector lentiviral (http://www.addgene.org/Didier_Trono) para generar pLV-miR-31 vector de expresión. pLVTHM vector lentiviral codifica proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) que ha sido optimizado para más brillante de fluorescencia y una mayor expresión en células de mamífero. El vector previamente descrito pCAG-SATB2 [19] fue utilizado para un máximo de regular la expresión SATB2.
La larga duración 3'UTR de SATB2 (2711bp) se clonó a continuación, inserta en la corriente abajo del gen indicador de luciferasa de pGL3-control de vector (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Esto se hizo para generar pGL3-SATB2-3'UTR. Dos de miR-31 supuestos sitios de unión en el 3'UTR de SATB2 se dirigen-sitio y mutados, respectivamente, utilizando GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen). Todos los plásmidos se verificaron mediante secuenciación. Todos primer secuencias de secuencias de detección y miARN se proporcionan en la Tabla S1.
Lentivirus la producción y la infección
Las partículas de virus se cosecharon 48 horas después de PLV-miR-31 de la transfección con el plásmido de la cubierta pMD2.G y el embalaje del vector psPAX2 en células 293T usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen ). células CRC se infectaron con las unidades de lentivirus de transducción recombinantes y de 8 mg /ml polibreno (Sigma, St Louis, Missouri, EE.UU.) y luego se sometieron a análisis FACS para la expresión de GFP para obtener células con CRC estable sobreexpresión de miR-31. El pLVTHM vector lentiviral vacío fue utilizado como control (miR-CON).
transfección de oligonucleótidos
miR-31 imita e inhibidores antisentido que contienen 2 'OMe (
O
metil) modificaciones fueron sintetizados por GenePharma (Shanghai, china). la transfección de oligonucleótidos se llevó a cabo con reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
reportero de luciferasa ensayo
En la presencia de cualquiera de miR-31 o el miR-con, el constructo de luciferasa de luciérnaga fue co-transfectadas con un control
Renilla luciferasa
vector pRL- CMV (Promega) en las células SW480. Un ensayo de luciferasa dual (Promega) se realizó 48 horas después de la transfección. Los experimentos se realizaron por triplicado de forma independiente.
Ensayo de proliferación celular y el análisis del ciclo celular
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 2 x 10
3 por pocillo. La proliferación celular se evaluó utilizando Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Para el análisis del ciclo celular, las células se sembraron en placas de 6 pocillos a 5 x 10
5 por pocillo. La distribución del ciclo celular se analizó mediante yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) tinción y citometría de flujo [23].
Colonia ensayo de formación de
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a 2 x 10
2 por pocillo y se mantuvieron en RPMI 1640 que contiene 10% de SFB durante 2 semanas. Después de 2 semanas, las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron con metanol y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta. El número de colonias se contó bajo un microscopio [24].
Heridas ensayos de curación y la invasión
La migración celular se evaluó midiendo el movimiento de las células en un raspado, zona acelular creado por un tubo de pipeta de 200 l, y se observó la propagación del cierre de la herida después de 0 y 48 horas, respectivamente. Se tomaron fotografías para evaluar el nivel de migración en cada grupo de células transfectadas. La migración se cuantifica contando el número total de células que migraron hacia el campo herida original. Para el ensayo de invasión, se utilizaron cámaras de matrigel recubierto de (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) que contienen 8 micras poros. Se sembraron las células en las cámaras superiores (recubiertos en matrigel) en 2 × 10
5 concentración en medio libre de suero. La cámara baja del transwell se llenó de medios de cultivo que contienen 10% de SFB como quimio-atrayente. Después de que las cámaras se incubaron a 37 ° C durante 48 horas, las células no invadidas en la parte superior de la transwell se rasparon con un hisopo de algodón. Translocados éxito células se fijaron con formalina al 10%. A continuación, se tiñeron con cristal violeta al 0,1% durante 30 minutos y se contaron con un microscopio óptico.
En vivo
funciones ensayos
Balb /C-nu /nu atímicos ratones desnudos (4-6 semanas de edad) se adquirieron del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad médica del Sur. Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos en un ciclo de 12 horas luz /oscuridad y
ad libitum
acceso a los alimentos y el agua filtrada. Los animales utilizados para la experimentación recibieron cuidado humano. Para el ensayo de crecimiento tumoral, un total de 2 × 10
6 células de SW480 con estable sobre-expresión de miR-31, o de control de las células, se inyectaron por vía subcutánea en el flanco izquierdo y derecho de ratones (n = 6 por grupo). A continuación, se recogió la fluorescencia emitida por las células y las imágenes se analizaron a través de un sistema de imágenes de GFP de todo el cuerpo (LightTools, Encinitas, CA) que podría visualizar el crecimiento del tumor en tiempo real. El tamaño del tumor se midió usando calibradores digitales cada tres días. Después de 30 días de seguimiento, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y se diseccionaron los tumores. El volumen del tumor se calculó de la siguiente manera:. Volumen = (D × D
2) /2, donde D significa el diámetro más largo y d significa el diámetro más corto
Para establecer el modelo metastásico, ciego de ratón se exterioriza laparotomía bajo anestesia con pentobarbital sódico (peso corporal de 6 mg /100 g). Los tumores subcutáneos fueron cortados en cubos en 1 mm
3 cubos y se implantan en el mesenterio en el extremo ciego de los ratones. A continuación, el intestino se volvió a la cavidad abdominal y se cierra con paños quirúrgicos. Los cojines de calefacción se utilizaron para ayudar a la recuperación postoperatoria de los ratones después de xenoinjertos de implantación. el estado de salud de los animales se controló después de la cirugía todos los días, incluyendo su actividad física, hidratación, alimentación y hábitos de consumo y la deambulación. El peso corporal de control y SW480 /miR-31 ratones también se registró cada tres días. puntos finales se habían planificado al final del experimento, y como un medio para revivir el dolor o la angustia. Un criterio integrado para la necesidad de la eutanasia se llevó a cabo en nuestro estudio, incluyendo déficit físico, la enfermedad, la angustia, la inmovilidad, pérdida de peso y el tamaño máximo del tumor. Cuando aparecieron déficit físicos evidentes, tales como ojos secos o sin brillo, membranas mucosas de mal gusto, encorvado, la reducción de la deambulación, observador hecho caso omiso, disnea o caquexia, los ratones se considera que cumplen los criterios de la eutanasia y se sacrificaron para minimizar el sufrimiento y la angustia. Al final del experimento (8 semanas), los ratones todavía vivos fueron sacrificados por dislocación cervical. Los órganos se retiraron y se fijaron con 10% de formalina tamponada neutral. Posteriormente, se obtuvieron secciones de tejido consecutivos y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H & amp; E) para observar los nódulos metastásicos de los órganos bajo el microscopio. Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad Médica del Sur. Todo se tomaron las medidas necesarias para minimizar el sufrimiento y la angustia de los ratones.
Western blot análisis
Proteína lisados se separaron por electroforesis en gel de SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a una membrana de PVDF (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, EE.UU.). La membrana se sondeó con los siguientes anticuerpos: anti-SATB2 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-E-cadherina (Cell Signaling Technology, Inc), anti-N-cadherina (Cell Signaling Technology), anti-vimentina (Señalización Celular tecnología), y anti-β-catenina (Cell Signaling Technology). Por último, la membrana se sondeó con HRP (peroxidasa de rábano picante) marcado con anti-ratón de cabra-IgG (Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.) y detectado por quimioluminiscencia. Un anticuerpo anti-β-actina policlonal (Santa Cruz Biotechnology) se utilizó como un control de la proteína de carga. La intensidad de fragmentos de proteína se cuantificó con el software Cantidad Uno (4.5.0 básica, Bio-Rad).
La inmunohistoquímica (IHC)
Los bloques de tejido fueron cortados en secciones de 4 micras y procesados para IHC de acuerdo con un protocolo descrito previamente [19].
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS 16.0. En al menos tres experimentos independientes, los datos se presentan en términos de media ± SEM. Las diferencias entre las variables fueron evaluadas por los siguientes tres pruebas estadísticas: χ
2 prueba, la prueba exacta de Fisher, o un modelo lineal. Para los pacientes con diferentes niveles de miR-31 expresión, las curvas de supervivencia se trazaron usando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. análisis de supervivencia multivariante se realizó en todos los parámetros que resultaron ser significativas en el análisis univariado utilizando el modelo de regresión de Cox. Un
valor de p
menos de 0,05 fue considerado como estadísticamente significativa.
Resultados
miR-31 fue hasta reguladas en las células y tejidos metastásicos CRC CRC primarios humanos con los ganglios linfáticos metástasis
primero examinamos la expresión de miR-31 por un tallo-bucle RT-PCR cuantitativa en un panel de líneas celulares de CRC y 31 pares de CRC y los tejidos de la mucosa no neoplásicas adyacentes. Los resultados mostraron que el miR-31 fue notablemente hasta reguladas en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos normales adyacentes no neoplásicas (
p = 0,0004
, Figura 1A). Se observó que la sobre regulación de miR-31 en muestras de tumores se asoció con metástasis en los ganglios linfáticos en una medida significativa (
p = 0,0045
, Figura 1B). En los pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos, la expresión relativa media de miR-31 era más de 7,82 veces mayor que en los pacientes sin metástasis (61,54 ± 16,68
vs
.7.87 ± 2,47). Además, el miR-31 fue baja en SW480 y células DLD-1, que se originan a partir de tumores primarios, mientras que fue relativamente alta en SW620, Lovo, M5 y SCP51 células, que se originan a partir de focos metastásicos (Figura 1C), especialmente en M5 y líneas celulares SCP51, que tienen un alto potencial metastásico entre las líneas celulares de CRC. Esta asociación ha indicado que el miR-31 bien podría tener un papel fundamental en la CRC metástasis.
(A) Los niveles de expresión de miR-31 madura en emparejado CRC y los tejidos normales adyacentes. (B) La expresión de miR-31 en tejidos de CRC con o sin metástasis relativos a coincidir-tejidos normales. nmCRC denota tejidos CRC sin metástasis; CCRm denota tejidos CRC con metástasis en los ganglios linfáticos. (C) La expresión de miR-31 en líneas celulares y subclones CRC. abundancia miARN se normalizó a U6 ARN. (D) Análisis de la expresión de miR-31 en la mucosa colorrectal normal y tejidos CRC por
en
situ
hibridación. (A) la expresión negativa de miR-31 en la mucosa colorrectal normal, (B) Bajo la expresión de miR-31 en tejidos CRC; (C, d) de alta expresión de miR-31 en tejidos CRC; (E) control negativo; (F) el análisis de Kaplan-Meier para la supervivencia de los pacientes con CCR según la expresión de miR-31. Log Rank = 6,682,
p = 0,010
.
El exceso de expresión de miR-31 se asoció con un fenotipo agresivo y mal pronóstico de los pacientes con CCR
para investigar más a fondo el significado clínico-patológico y el pronóstico de los niveles de miR-31, que mide la expresión de miR-31 en una gran cohorte de 143 archivado CRC incluido en parafina y tejidos de colon normales utilizando ISH. Hemos observado que 75/143 (52.45%) CRC tenido alto nivel de expresión de miR-31, mientras que 11/55 (20%) los tejidos de la mucosa normales tenían alto nivel de expresión de miR-31 (
p Hotel & lt; 0,001). El análisis de correlación entre las características clínico-patológicos y miR-31 mostró el nivel alto nivel de expresión de miR-31 se asoció significativamente con la T-etapa (
p = 0,045
), metástasis de ganglios linfáticos (
p
= 0,001), y metástasis a distancia (
p = 0,026
) en pacientes con CCR, sin embargo, no asociada con la edad, sexo, localización del tumor, el tamaño del tumor y el grado de diferenciación tumoral (
p
& gt;. 0,05, Tabla 1) Características
n
miR-31 expresión
baja (%)
alta (%)
P
valor
Género Male8739 (44,83) 48 (55,17) 0,416 Female5629 (51.79) 27 (48.21) Edad (años) & lt; 506.535 (53,85) 30 (46,15) 0,169 ≥507833 (42.31) 45 (57.69) tumor sitio proximal colon4220 (47,62) 22 (52,38) 0,369 colon3721 distal (56,76) 16 (43,24) Rectum6427 (42,19) 37 (57,81) El tamaño del tumor (cm de diámetro) & lt; 54 519 (42,22) 26 (57,78) 0,387 ≥59849 (50,00 ) 49 (50.00) la diferenciación del tumor Good136 (46.15) 7 (53,85) 0,979 Moderate10450 (48.08) 54 (51.92) Poor2612 (46.15) 14 (53.85) T-stage1-22316 (69.57) 7 (30,43) 0,045 38740 (45.98) 47 (54.02) 43312 (36.37) 21 (63,63) N-stage05938 (64,41) 21 (35,59) 0,001 1-28430 (35,71) 54 (64,29) metastasis09451 a distancia (54,26) 43 (45,74) 0,026 14917 (34.69) 32 (65.31) Tabla 1. Correlación entre las características clínico-patológicos y la expresión de miR-31.
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para evaluar el valor pronóstico de miR-31 para CRC, se analizó la asociación entre el miR-31 expresión y la duración de la supervivencia mediante Kaplan -Meier análisis con la prueba de log-rank. Los resultados revelaron que el alto nivel de expresión de miR-31 se correlacionó con el corto tiempo de supervivencia de los pacientes con CCR (51,85 ± 3,78
vs
.76.64 ± 4,30,
p = 0,010
, Figura 1D ). Además, el análisis de regresión de Cox indicó que la expresión de alto nivel de miR-31 es un factor pronóstico independiente de mal supervivencia de los pacientes con CCR (Tabla 2).
Variables
análisis univariante
El análisis multivariado
P
valor
HR
95% intervalo de confianza
P
valor
HR
95% intervalo de confianza
Gender0.516 0,826 0,785 0.464-1.471Age0.391 0.451-1.366Tumor site0.915 0,982 0.707-1.365Tumor size0.581 1.190 0.642-2.207Tumor differentiation0.074 1.648 0.953-2.850T-stage0.001 2,262 1.419-3.6060.032 1,695 1.045-2.750 N-stage0.041 1,563 0,847 0.846-2.7280.604 0.453-1.586M etapa & lt; 2,441 a 7,707 0.0014.338 & lt; 0.0013.563 1.940-6.545miR-31 expression0.012 2.145 1.877 1.182-3.8900.048 1.007-3.488Table 2. análisis de la supervivencia global en el análisis de regresión univariante y multivariante de Cox.
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Exogenetic sobre-expresión de miR-31 promovido CRC crecimiento celular, la invasión y la migración
in vitro
Para explorar el potencial de la función biológica de miR-31 en el CCR tumorigénesis y progresión, SW480 y células DLD-1 fueron infectadas con pLV-miR-31 o pLV-aire, respectivamente. Esto se hizo para establecer dos líneas celulares de miR-31-sobreexpresión estables y dos líneas celulares falsos (miR-con). Un incremento en la expresión de miR-31 tras la infección en dos líneas celulares fue confirmada por tiempo real de RT-PCR (Figura 2A). Como se muestra en la Figura 2B-2D, la sobre-expresión de miR-31 aumento de la proliferación de células cancerosas y su capacidad para formar colonias que en las células simuladas y las células infectadas y no de tipo salvaje (
p
& lt; 0,001 ). La citometría de flujo y análisis del ciclo celular reveló una disminución significativa en el porcentaje de células en la fase G1 /G0 (
p = 0,004
en SW480
, p = 0,008
en DLD1) y un aumento de la fase S de las células tratadas con CRC miR-31 (
p = 0,002
en SW480
, p = 0,001
en DLD1, Figura 2E).
(A) en tiempo real RT-PCR análisis de miR-31 nivel de expresión en SW480 y células DLD-1 después ectópico sobreexpresión de miR-31. (B, C) Efecto de miR-31 en la proliferación celular se midió por CCK-8 ensayo. (D) Comparación de la colonia de efectuar la formación de las líneas celulares de CRC. (E) la distribución del ciclo celular de las células infectadas con el CRC miR-31 se detectó mediante análisis de citometría de flujo. (F, G) Efectos de miR-31 ectópico sobreexpresión de motilidad celular y la invasión se determinaron utilizando la cicatrización de heridas (F) y ensayos de invasión Matrigel (G). Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Los resultados fueron reproducibles en tres experimentos independientes. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p
. & Lt; 0,001
Después de observar el engrandecimiento de crecimiento mediada por el miR-31, el efecto de miR-31 en la capacidad invasiva de las células CRC se caracterizó por el ensayo de curación de heridas y la invasión de matrigel. Los resultados indicaron que la expresión exogenetic de miR-31 en las células de CRC causó un aumento significativo en la migración celular usando un ensayo de cicatrización de heridas (
p = 0,001
en SW480
, p
& lt; 0,001 en DLD1, la Figura 2F). ensayo de invasión de Matrigel también ilustra que la sobre-expresión de miR-31 invasividad marcadamente inducida de células CRC (
p Hotel & lt; 0,001 en tanto SW480 y DLD1, Figura 2G). Estos resultados indican que la sobre expresión de miR-31 era suficiente para promover tanto la proliferación celular y la migración
in vitro
.
miR-31 CRC facilitado el crecimiento de las células del tumor y la metástasis
in vivo
Dado que el miR-31 promueve el crecimiento, la migración y la invasión de las células CRC
in vitro
, nos tentados a determinar si el miR-31 podría facilitar el crecimiento del tumor y la metástasis
in vivo
. Para este propósito, células SW480 con estable sobreexpresión de miR-31 (SW480 /miR-31) y el control de las células (SW480 /miR-CON) se inocularon por vía subcutánea en ratones desnudos. Como se muestra en la Figura 3A, la velocidad de crecimiento del tumor en el grupo de SW480 /miR-31 era importante que la del grupo SW480 /miR-CON (
p
& lt; 0,05, Figura 3A y 3B). IHC tinción mostró que los tumores de grupo de control muestran mucho más bajo índice Ki-67 que el de grupo de miR-31 sobre-expresión (Figura 3B).
(A) imágenes de fluorescencia del cuerpo entero externos de SW480 /MIR ratones y tumores (superior) y las imágenes de los tumores subcutáneos de ratones -31 y SW480 /miR-CON (inferior) se obtuvieron. Las flechas indican los cánceres subcutáneos. (B) fotografías representativas de H & amp; E y tinción inmunohistoquímica para el anticuerpo Ki-67 de cáncer de los tejidos primarios (superior) y la curva de crecimiento de los volúmenes tumorales (inferior). Cada punto de datos representa la media ± SD. (C) Las imágenes de todo el cuerpo de la metástasis en ratones. P denota tumor primario. Las flechas blancas señalan los nódulos metastásicos. (E) Imágenes histológicas de nódulos metastásicos en los órganos. xenoinjertos de tumores con miR-31-sobreexpresión formaron significativamente la invasión de la pared cecal (a, b), la siembra de la metástasis de cáncer de colon (c), de la pared del estómago (d), la pared abdominal (e) y el diafragma (f), y metástasis de ganglios nodo (g), el hígado (h) y pulmón (i). (E) La incidencia de metástasis en ratones que implantados con células SW480 /miR-31 o el miR-Con. (F) El análisis de supervivencia de los ratones SW480 /miR-31 y SW480 /MIR-Con.
Para imitar CRC humana y evaluar el
in vivo
efecto de miR-31 sobre la metástasis del CRC, SW480 /miR-31 y células /MIR-con SW480 se implantaron orthotropically en el extremo ciego de los individuos. Entre 4 y 8 semanas después de la implantación xenoinjertos, 4/6 y 1/6 ratones experimentales ratones control tuvieron déficit físico evidente debido al aumento de la carga tumoral. Dado que cumplen el criterio de punto final humano, estos ratones fueron sacrificados para aliviar el sufrimiento y la angustia. Los ratones vivos restantes fueron sacrificados al final del experimento (8 semanas). Los resultados de los experimentos con animales demostraron que las células SW480 de miR-31-sobreexpresión exhibieron metástasis dramática de hígado y cavidad peritoneal, mientras que las células /MIR-con SW480 sólo causó tumor aumenta sin metástasis (Figura 3C). H & amp; E tinción mostraron claramente la invasión de la pared intestinal y metástasis de estómago, diafragma, pared abdominal, el hígado, los ganglios linfáticos y pulmón en grupos /miR-31cells SW480 (
p Hotel & lt; 0,05, Figura 3D y 3E ). Además, se reveló que el miR-31 sobre-expresión condujo a tiempos más cortos de supervivencia global de los animales (
p Hotel & lt; 0,05, Figura 3F)
La inhibición de miR-31 reducida. el crecimiento, la invasión y la migración de las células CRC
in vitro
Para confirmar los efectos de miR-31 en la modulación de los fenotipos malignos de células CRC, que también investigó el cambio de fenotipos agresivos de CRC células después de la reducción de expresión de miR-31. transfección inhibidor de miR-31-específica fue empleado para inhibir miR-31 expresión en células SW620 y M5, que tenían alta miR-31 expresión endógena. Como se muestra en la figura 4A, cuando se compara con las células de control, se observó una tasa de proliferación significativamente más lento en las células-31 de miR transfectadas inhibidor-(
p
& lt; 0,001). Además, la invasión de Matrigel y los ensayos de curación de heridas confirmaron que la inhibición de la expresión de miR-31 redujo la invasión y la migración de las células M5 y SW620, en comparación con las células de control (
p
& lt; 0,05, Figura 4B y 4C ).
(A) La inhibición de miR-31 inhibe la proliferación celular de las células SW620 M5 y mediante ensayo CCK8.