Extracto
El cáncer colorrectal es uno de los tipos más comunes de cáncer con más del cincuenta por ciento de los pacientes que se presentan en una etapa avanzada. El ácido retinoico es un metabolito de la vitamina A y es esencial para el crecimiento normal de las células y el metabolismo del ácido retinoico aberrante está implicada en la génesis tumoral. En este estudio se ha perfilado la expresión de enzimas que metabolizan ácido retinoico utilizando un microarray de tejido de cáncer colorrectal bien caracterizado que contiene 650 cánceres colorrectales primarios, metástasis en los ganglios linfáticos 285 y 50 muestras normales mucosa colónica. La inmunohistoquímica se realizó en el microarray de tejido usando anticuerpos monoclonales que hemos desarrollado para el que metaboliza el ácido retinoico enzimas cyp26a1, CYP26B1, CYP26C1 y lecitina retinol acil transferasa (LRAT) utilizando un sistema de puntuación semicuantitativo para evaluar la expresión. expresión moderados o fuertes de CYP26A1was observado en 32,5% de los cánceres en comparación con 10% de muestras de epitelio de colon normal (p & lt; 0,001). CYP26B1 fue moderada o fuertemente expresada en 25.2% de los tumores y fue significativamente menor expresa en el epitelio del colon normal (p & lt; 0,001). CYP26C1 no se expresó en cualquier muestra. LRAT también mostró aumentado significativamente en carcinomas primarios de colon en comparación con el epitelio normal del colon (p & lt; 0,001). CYP26B1 expresión fuerte se asoció significativamente con un mal pronóstico (HR = 1,239; IC del 95% = 1,104 a 1,390, χ
2 = 15,063, p = 0,002). Fuerte LRAT también se asoció con peor pronóstico (HR = 1,321; IC del 95% = 1,034 a 1,688, χ
2 = 5,039, p = 0,025). En los tumores con dominio de reparación de genes fuerte CYP26B1 (HR = 1,330; IC del 95% = 1,173 a 1,509, χ
2 = 21,493, p & lt; 0,001) y fuerte LRAT (HR = 1,464; IC del 95% = 1,110 a 1,930, χ
2 = 7,425, p = 0,006) fueron también se asocian a un peor pronóstico. Este estudio ha demostrado que el ácido retinoico metabolizante de enzimas de cyp26a1, CYP26B1 y LRAT se sobreexpresa significativamente en el cáncer colorrectal y que CYP26B1 y LRAT están significativamente asociados con el pronóstico tanto en la cohorte total y en aquellos tumores que son desajuste de reparación competente. CYP26B1 era independiente de pronóstico en un modelo multivariado, tanto en toda la cohorte de pacientes (HR = 1,177; IC del 95% = 1,020 a 1,216, p = 0,026) y en la reparación de desajuste tumores dominio (HR = 1,255; IC del 95% = 1,073-1,467, p = 0,004)
Visto:. Marrón GT, Efectivo BG, Blihoghe D, P Johansson, Alnabulsi a, Murray GI (2014) la expresión y significado pronóstico de ácido retinoico enzimas que metabolizan en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (3): e90776. doi: 10.1371 /journal.pone.0090776
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Noviembre 2013; Aceptado: February 4, 2014; Publicado: 7 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Brown et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiado por la Universidad de Aberdeen Development Trust (http://www.abdn.ac.uk/giving/) y rodean (http://www.encompass-scotland.co.uk/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Graeme Murray es un asesor científico de vertebrados anticuerpos, que contribuyeron a esta investigación. No hay remuneración económica ha sido o está recibida para esta posición ni tampoco poseen acciones de esta empresa. Beatriz efectivo y Ayham Alnabulsi son empleados de vertebrados anticuerpos. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer colorrectal es uno de los tipos más comunes de tumores malignos cuya supervivencia a 5 años se mantiene en aproximadamente el cincuenta por ciento a pesar de la introducción de los programas de cribado del cáncer de colon [1]. Si bien la patogénesis molecular de este tipo de tumor es cada vez más entendida y define especialmente las primeras etapas de desarrollo del cáncer colorrectal, donde los cambios moleculares han sido delineadas con un alto grado de detalle [2] - [4]. Sin embargo, todavía hay una clara necesidad de identificar biomarcadores de cáncer colorrectal, incluyendo marcadores de pronóstico, predicción y diagnóstico [5] - [15].
El ácido retinoico (RA) es un metabolito de la vitamina A (retinol), que lleva a cabo funciones esenciales en el crecimiento celular normal y la diferenciación y el metabolismo del ácido retinoico dysregulated ha sido implicada en la génesis tumoral [16], [17]. Los retinoides, un término usado para describir compuestos naturales o sintéticos que muestran una semejanza estructural o funcional en retinol, tienen papeles importantes que desempeñar en el crecimiento celular, la diferenciación y la apoptosis [16]. La forma más activa de la AR, el ácido trans-retinoico (ATRA), tiene una función de regulación de genes y desempeña un papel crucial en el desarrollo de las múltiples órganos. 4-oxo-9-cis-retinoico ácido (9-cis-RA) y 4-oxo-13-cis-retinoico ácido (13-cis-RA) son estéreo-isómeros de ATRA y también juegan un papel importante en la señalización de RA . Algunos retinoides poseen propiedades anti-cáncer que ya han sido explotados para el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de cuello uterino y leucemia promielocítica.
El procesamiento intracelular de retinol implica lecitina de retinol acil transferasa (LRAT) que se encarga de la esterificación de retinol [18], [19] mientras que la hidroxilación de retinol se lleva a cabo por las hidroxilasas del ácido retinoico (cyp26a1, CYP26B1, CYP26C1), que son todos los miembros del citocromo P450 (P450) familia de enzimas [20], [21] .
los tres miembros de la familia CYP26 son todos capaces de metabolizar atRA en menos activas biológicamente 4-hidroxi, 4-oxo, y los intermedios 18-hidroxi-AR [22] - [24], de que, 4-oxo-RA es el metabolito más común [16]. Aunque estudios previos han investigado la expresión de P450 en tumores y se muestra tumoral expresión selectiva de los P450 individuales más notablemente CYP1B1 [25] de la familia CYP26 P450s ha recibido poca atención previa en relación con su expresión en tumores.
Este estudio tiene perfila la expresión de la metabolización del ácido retinoico enzimas cyp26a1, CYP26B1, CYP26C1 y LRAT usando un microarray de tejido de cáncer colorrectal bien caracterizado con anticuerpos monoclonales para cyp26a1, CYP26B1, CYP26C1 y LRAT respectivamente, que han sido desarrollado y caracterizado para su uso por inmunohistoquímica en formalina cera de tejido fijado incrustado.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos monoclonales fueron desarrollados
Los anticuerpos monoclonales para cyp26a1, CYP26B1, CYP26C1 y LRAT en colaboración con Vertebrados Los anticuerpos Ltd (Aberdeen, Reino Unido ) usando péptidos sintéticos. Se identificaron los péptidos dentro de las secuencias de proteínas putativas que eran antigénica, expuesto en la superficie y único para la proteína diana. Las secuencias de aminoácidos y la ubicación en las proteínas se indican en la Tabla 1. Los péptidos se obtuvieron de Almac Sciences Ltd, (Edimburgo, Reino Unido) y conjugan individualmente a la ovoalbúmina para las vacunas y a la albúmina de suero bovino para las pruebas ELISA [26]. La inmunización de ratones, la producción de células de hibridoma y de detección ELISA se llevaron a cabo esencialmente como se describe anteriormente [26], salvo que el antígeno fue dado por vía subcutánea. Los hibridomas se clonaron mediante dilución limitante hasta que una sola colonia ELISA positivo se cultivó en una placa de 96 pocillos. líneas de células individuales fueron luego cultivadas a alta densidad celular para la preparación de la población de anticuerpos que se utilizó posteriormente para su caracterización por inmunotransferencia e inmunohistoquímica.
Immunoblotting
enteras lisados celulares de células (células de riñón embrionario humano) que sobreexpresan cyp26a1, CYP26B1, CYP26C1 y LRAT se utilizaron como controles positivos para la inmunotransferencia, mientras que los lisados de células que contienen vector solamente se utilizaron como controles negativos. El lisado celular cyp26a1 y su control se compraron de Abnova (Taipei, Taiwan) mientras CYP26B1, CYP26C1 y LRAT lisados que contienen células y sus controles correspondientes se obtuvieron a partir de (Novus Productos Biológicos, Cambridge, UK). Los lisados celulares (5 g de proteína /carril) se resolvieron por electroforesis en geles NuPAGE (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido) al 4-12% Tris-bis. Después de la transferencia de proteínas de las membranas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en tampón fosfato que contiene 1% (w /v) leche desnatada en polvo de solución salina-Tween-20 (PBST). Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con cyp26a1 (1/5 de dilución), CYP26B1 (dilución 1/2), CYP26C1 (dilución 1/2) o LRAT (dilución 1/2) anticuerpos monoclonales diluidos en PBST. Las membranas se lavaron (6 veces) durante 1 hora en 1% de leche desnatada. Las membranas se probaron posteriormente durante 1 hora con una IgG anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano conjugada (1/2000, Sigma-Aldrich, Dorset, UK). a continuación, las membranas se lavaron (6 veces) durante 1 hora en 1% de leche desnatada y bandas de proteínas visualizó usando el sistema de detección de quimioluminiscencia potenciada (Fisher Scientific).
colorrectal tejido de cáncer de microarray
Todos los casos de cáncer colorrectal incluidos en este estudio fueron retrospectivamente selecciona del banco de tumores colorrectal Aberdeen (ahora incorporan y governanced por el NHS Grampian biorepositorio, Aberdeen, Reino Unido). En total, las muestras tumorales de 650 pacientes participaron en este estudio, en cada caso, se ha hecho un diagnóstico de cáncer colorrectal primario, y los pacientes habían sido sometidos a cirugía electiva para el cáncer colorrectal primario, en Aberdeen, entre 1994 y 2009. Ninguno de los pacientes habían recibido ningún tipo de quimioterapia preoperatoria o radioterapia. En particular, los pacientes con cáncer de recto que habían recibido terapia neoadyuvante incluida la radioterapia curso corto fueron excluidos. Los datos de los pacientes y de sus tumores incluidos en este estudio se detallan en la Tabla S1. información de supervivencia (todas las causas de mortalidad) estaba disponible para todos los pacientes y en el momento de la censura de datos de resultados de pacientes que había habido 309 (47,5%) muertes. La supervivencia media de los pacientes fue de 115 meses (IC del 95%: 108-123) meses.
Los tumores se presentan según el Real Colegio de Patólogos guías del Reino Unido para el reporte histopatológico de muestras de resección del cáncer colorrectal y que incorpora la guía de la versión 5 del sistema de estadificación TNM [27]. El procesamiento histopatológico de las muestras de escisión del cáncer colorrectal se detalla en Materiales y Métodos S1.
A microarray de tejido de cáncer colorrectal fue construido que contiene muestras normales de la mucosa de colon (n = 50), primaria (n = 650) y colorrectal metastásico muestras de cáncer (n = 285) como se describe anteriormente [28] - [30]. Los detalles de la construcción de la micromatriz de tejido se dan en Materiales y Métodos S1.
Inmunohistoquímica
Inmunohistoquímica para cada anticuerpo se realizó con el sistema de Dako Envision libre de biotina (Dako, Ely, Reino Unido) utilizando un sistema de tinción automática Dako (Dako) como se describe anteriormente [28] - [30]. Los detalles de la inmunohistoquímica se dan en Materiales y Métodos S1. Las secciones fueron evaluados por examen microscópico de luz y la intensidad de la inmunotinción en cada núcleo evaluaron de forma independiente por dos investigadores (GTB y GIM) utilizando un sistema de puntuación previamente descrito para la evaluación de la expresión de proteínas en microarrays de tumores [28] - [30]. La intensidad de la inmunotinción en cada núcleo se anotó como negativa, débil, moderado o fuerte. La localización subcelular (nuclear, citoplasmática o membranosa) de la inmunotinción también se registró. La variación en la inmunotinción entre los núcleos de cada caso no fue identificado. Cualquier discrepancia en la evaluación inmunohistoquímica de los núcleos de tejido entre los dos observadores se resolvieron mediante simultánea microscópica re-evaluación.
Evaluación del estado de reparación de genes
Estado de los genes de reparación (MMR) se evaluó mediante inmunohistoquímica el uso de anticuerpos para MLH1 y MSH2 como se describe anteriormente [28], [30]. estado de MMR se registró como cualquiera de competente o defectuosa.
Estadísticas
El análisis estadístico de los datos, incluyendo la prueba de Mann-Whitney, test de Wilcoxon, prueba de chi-cuadrado, la supervivencia de Kaplan-Meier análisis, log-rank test y análisis de variables múltiples Cox (variables introducidas como variables categóricas), incluyendo el cálculo de los coeficientes de riesgo y el IC del 95% se realizó a través de IBM SPSS versión 21 para Windows 7 ™ (IBM, Portsmouth, Reino Unido). Se utilizó la prueba de rangos logarítmicos para determinar las diferencias de supervivencia entre los grupos individuales. Un valor de probabilidad de p = 0.05 fue considerado como significativo. La influencia de los diferentes puntos de corte en relación con la supervivencia fue investigado por la dicotomización de la puntuación de intensidad para cada marcador. Los grupos que se analizaron fueron tinción negativa versus cualquier tinción positiva, tinción negativa y débil frente a la tinción moderada y fuerte y tinción negativa, débil y moderada en comparación con una fuerte tinción.
Ética
El proyecto tenía el La aprobación del norte de Escocia comité de ética de investigación (ref. Nos. 08 /S0801 /81 y 11 /NS /0015). El comité de ética de investigación no se requiere el consentimiento escrito del paciente para las muestras de tejido retrospectivos que se incluyeron en el microarray de tejido de cáncer colorrectal.
Resultados
Los anticuerpos monoclonales
La especificidad de la anticuerpos monoclonales para cyp26a1, CYP26B1, CYP26C1 y LRAT se determinaron mediante ELISA usando los péptidos inmunogénicos y también por inmunotransferencia (figura 1) usando lisados de células enteras a partir de células que sobreexpresan cada proteína. Se observó una banda que migraba a la espera de peso molecular para cada anticuerpo en un lisado preparado a partir de células que sobreexpresan la proteína correspondiente, mientras que no se detectaron bandas con el correspondiente lisado de control
.
El carril de la izquierda de cada panel contiene células de control lisado mientras que el carril de la derecha de cada panel contiene lisado preparado a partir de células que sobreexpresan la proteína correspondiente. 5 microgramos de proteína se cargaron por pocillo.
Inmunohistoquímica
cyp26a1, CYP26B1 y LRAT todos mostraron inmunoreactividad en tanto epitelio del colon normal y cáncer colorrectal primario y metastásico y en cada caso inmunotinción se localizado en el citoplasma de las células (Figura 2). No hubo imunoreactivity membrana nuclear o de la superficie celular. En inmunotinción normal de epitelio del colon se localizó predominantemente células epiteliales de la superficie y no se observó heterogeneidad intratumoral en cualquiera de los tumores colorrectales primarios o metastásicos. CYP26C1 no mostró ninguna inmunotinción en ninguna de las muestras de tejidos examinados.
La intensidad de la inmunotinción fue significativamente mayor en el cáncer colorrectal primario en comparación con mucosa normal del colon para cyp26a1 (p = 0,002), CYP26B1 (p & lt ; 0,001) y LRAT (p & lt; 0,001) (Figura 3, tabla 2). No hubo diferencia en la intensidad de la expresión de cualquiera de cyp26a1 o CYP26B1 entre el cáncer colorrectal Dukes C y sus correspondientes metástasis en los ganglios linfáticos mientras que para LRAT hubo una disminución significativa en la inmunorreactividad en la metástasis de los ganglios linfáticos en comparación con los tumores primarios correspondientes (P & lt; 0,001 ) (figura 3 y tabla 2)
La expresión de cyp26a1 fue fuertemente correlacionada tanto con la expresión CYP26B1 (χ
2 = 192.2, p. & lt; 0,001) y la expresión LRAT (χ
2 = 89,54, p & lt; 0,001), mientras que la expresión CYP26B1 también se correlaciona con la expresión de LRAT (χ
2 = 144.88, p. & lt; 0,001)
Relación con los parámetros clínico-patológicas
las comparaciones de la expresión de cyp26a1, CYP26B1 y parámetros LRAT y clínico-patológicas se resumen en la tabla 3. CYP26B1 y LRAT ambos mostraron asociaciones significativas con la localización del tumor, el estadio del tumor (T), la invasión venosa y extramural etapa general. Por el contrario, cyp26a1 sólo mostró una relación con el sitio del tumor y no mostró una relación con cualquiera de los otros parámetros clínico-patológicas investigados.
El análisis de supervivencia
Total paciente cohorte.
la relación de la expresión de cyp26a1, CYP26B1 y LRAT con la supervivencia global fue investigada utilizando diferentes puntos de corte (v negativa débil v v moderada fuerte, v negativo, /v débilmente positivo negativo positivo moderado /fuerte y negativo /débil /fuerte moderada v) de la puntuación inmunohistoquímica y se resume en la tabla 4 y la figura entera 4.
a-D cohorte de pacientes. A. supervivencia global que muestra categorías CYP26B1 individuales. En B-D se muestra la influencia de las diferentes formas de presentación de los puntos. E-H reparación de apareamientos erróneos cohorte competentes. la supervivencia global E. mostrando categorías CYP26B1 individuales. En F-H se muestra la influencia de diferentes puntos de corte.
Hubo una asociación consistente y significativa entre la expresión CYP26B1 y el resultado (Figura 4). Teniendo en cuenta la intensidad de cada grupo CYP26B1 por separado, lo que aumenta la intensidad de la inmunorreactividad CYP26B1 se asoció con peor pronóstico (HR = 1,239; IC del 95% = 1,104 a 1,390, χ
2 = 15,063, p = 0,002). Para los tumores negativos CYP26B1 (n = 242) la supervivencia media fue de 133 meses (IC del 95% = 118-148 meses), para los tumores que expresan CYP26B1 débil (n = 216) la supervivencia media fue de 106 meses (IC del 95% = 95-116 meses), para los tumores que expresan CYP26B1 moderada (n = 106) la supervivencia media fue de 103 meses (IC del 95% = 85-120 meses) y para expresar firmemente tumores CYP26B1 (n = 58) la supervivencia media fue de 81 meses (IC del 95% = 60-101 meses).
la comparación de los tumores negativos CYP26B1 con tumores que mostraron ninguna inmunorreactividad CYP26B1 entonces una peor supervivencia se asoció con la expresión CYP26B1 (HR = 1,352; IC del 95% = 1,054 a 1,735, χ
2 = 5,707, p = 0,017). Para los tumores negativos CYP26B1 (n = 242) la supervivencia media fue de 133 meses (IC del 95% = 118-148 meses), mientras que para los tumores positivos CYP26B1 (n = 380) la supervivencia media fue de 107 meses (95% CI = 98-116 meses ). La comparación de los tumores negativos y positivos débiles CYP26B1 con CYP26B1 moderados y fuertes tumores que expresan mostró que había una asociación altamente significativa con la supervivencia (HR = 1,465; IC del 95% = 1,151 a 1,865, χ
2 = 9,832, p = 0,002). La media de supervivencia para los tumores negativos /débiles (n = 458) fue de 125 meses (IC del 95% = 115-135 meses), mientras que la supervivencia media para el grupo fuerte moderada /de los tumores (n = 164) fue de 96 meses (IC del 95% = 108-124 meses). CYP26B1 débiles tumores negativos //moderados expresan en comparación con CYP26B1 tumores expresan fuertemente también mostraron una asociación altamente significativa con la supervivencia (HR = 1,737; IC del 95% = 1,248 a 2,418, χ
2 = 11,092, p = 0,001). La supervivencia media para el grupo negativo /débil /moderada CYP26B1 (n = 564) fue de 119 meses (IC del 95% = 111-128 meses) mientras que la media de supervivencia para los tumores sólidos CYP26B1 (n = 58) fue de 80 meses (IC del 95% = 60-101 meses).
Para LRAT hubo una relación significativa con la supervivencia (HR = 1,321; IC del 95% = 1,034 a 1,688, χ
2 = 5,039, p = 0,025) cuando la inmunohistoquímica puntuación de intensidad se dichotomised en LRAT casos negativos y débiles (n = 239) frente a LRAT casos moderados y fuertes (n = 383) (figura 5). Para LRAT casos negativos y débiles supervivencia media fue de 132 meses (IC del 95% = 119-146 meses) mientras que para LRAT casos moderados y fuertes supervivencia media fue de 106 meses (IC del 95% = 96-116 meses). No hubo asociación entre cyp26a1 y la supervivencia en toda la cohorte de pacientes.
A. La relación de LRAT y la supervivencia de todos los cánceres colorrectales y B. La relación de LRAT y la supervivencia en tumores con dominio de reparación desajuste.
La relación detallada entre cyp26a1, CYP26B1 y expresión LRAT, parámetros patológicos y la supervivencia global se muestra en los cuadros S2, S3, S4 y S5.
en CYP26B1 análisis multivariante se mantuvo independiente de pronóstico (p = 0,026), mientras que no hubo significación pronóstica independiente de la expresión LRAT (tabla 5). Si el modelo de análisis multivariante sólo contiene las variables que estaría disponible a partir de una biopsia de cáncer colorrectal (es decir, ninguna información con respecto estadio pT, etapa pN y EMVI), entonces CYP26B1 es un marcador pronóstico independiente significativo (p = 0,017, Tabla S6)
MMR cohorte competentes.
En los tumores con dominio MMR había una relación consistente entre la intensidad de la expresión CYP26B1 y la supervivencia global (tabla 6, figura 4). El aumento de la intensidad de la inmunorreactividad CYP26B1 se asoció con peor pronóstico (HR = 1,330; IC del 95% = 1,173 a 1,509, χ
2 = 21,493, p & lt; 0,001). Para los tumores negativos CYP26B1 (n = 200) la supervivencia media fue de 143 meses (IC del 95% = 127-158 meses), para los tumores débiles CYP26B1 (n = 186) la supervivencia media fue de 106 meses (95% CI = 94-116 meses ), para los tumores moderados CYP26B1 (n = 87) la supervivencia media fue de 96 meses (95% CI = 82-112 meses) y para expresar firmemente tumores CYP26B1 (n = 49) del medio de supervivencia fue de 77 meses (IC del 95%: 56- 98 meses).
la comparación de los tumores negativos CYP26B1 con tumores que mostraron ninguna inmunorreactividad CYP26B1 entonces una peor supervivencia se asoció con la expresión CYP26B1 (HR = 1,604; IC del 95% = 1,207 a 2,132, χ
2 = 10,796, p = 0,001). Para los tumores negativos CYP26B1 (n = 200) la supervivencia media fue de 143 meses (IC del 95% = 127-158 meses), mientras que para los tumores positivos CYP26B1 (n = 322) la supervivencia media fue de 104 meses (95% CI = 94-114 meses ). La comparación de los tumores negativos y positivos débiles CYP26B1 con CYP26B1 moderados y fuertes tumores que expresan mostró una asociación altamente significativa con la supervivencia (HR = 1,617; IC del 95% = 1,242 a 2,105, χ
2 = 12.962, p & lt; 0,001). La media de supervivencia de los tumores negativos /débiles (n = 386) fue de 130 meses (IC del 95% = 120-141 meses) y la supervivencia media para el grupo fuerte moderada /de los tumores fue de 92 meses (95% CI = 79-106 meses ). CYP26B1 débiles tumores negativos //moderados expresan en comparación con CYP26B1 tumores expresan fuertemente también mostraron una asociación altamente significativa con la supervivencia (HR = 1,948; IC del 95% = 1,366 a 2,777, χ
2 = 14.149, p & lt; 0,001). La supervivencia media para el grupo negativo /débil /moderada CYP26B1 (n = 473) fue de 123 meses (IC del 95% = 113-132 meses) y la supervivencia media de CYP26B1 fuertemente tumores que expresan fue de 77 meses (IC del 95% = 56-98 meses).
Para LRAT hubo una relación significativa con la supervivencia (HR = 1,464; IC del 95% = 1,110 a 1,930, χ
2 = 7,425, p = 0,006) cuando se dichotomised las puntuaciones de intensidad de inmunohistoquímica en LRAT casos negativos y débiles (n = 198) versus LRAT casos moderados y fuertes (n = 326) (Figura 5). Para LRAT casos negativos y débiles supervivencia media fue de 139 meses (IC del 95% = 124-156 meses) mientras que para LRAT casos moderados y fuertes supervivencia media fue de 106 meses (IC del 95% = 96-116 meses). No hubo asociación entre cyp26a1 y la supervivencia en la cohorte de pacientes dominio del MMR.
En CYP26B1 análisis multivariante se mantuvo independiente de pronóstico (p = 0,026), mientras que no hubo significación pronóstica independiente de la expresión LRAT (tabla 7). Si el modelo de análisis multivariante sólo contiene las variables que estarían disponibles a partir de una biopsia de cáncer colorrectal (es decir, ninguna información con respecto a la etapa del tumor, estadio ganglionar y la invasión venosa extra-mural) y luego CYP26B1 es un marcador pronóstico independiente altamente significativa (p = 0,001, Tabla S6) guía empresas
no hubo una relación de MMR tumores defectuosos con cyp26a1, CYP26B1 o expresión LRAT y la supervivencia global.
Discusión
el cáncer colorrectal es una de las más comunes tipos de cáncer, cuya incidencia sigue aumentando y mientras los eventos moleculares que caracterizan la etapa temprana del desarrollo del cáncer colorrectal se han descrito en detalle todavía queda clara necesidad de identificar, caracterizar y validar biomarcadores de cáncer colorrectal [4] - [6] , [12].
en este estudio se ha definido el perfil de expresión de la que metaboliza el ácido retinoico enzimas cyp26a1, CYP26B1 y CYP26C1 que son miembros de la familia de enzimas P450 y LRAT en una gran cohorte de cánceres colorrectales bien caracterizados. La importancia pronóstica de la expresión de estas enzimas que metabolizan ácido retinoico También se ha establecido
Los P450 son un gran grupo de hidroxilasas dependientes de NADP clasificado en familias, subfamilias y miembros individuales [31] - [34]. . Hay dos grupos funcionales distintos de P450s en función de su especificidad de sustrato, ya sea para xenobióticos o compuestos endógenos. CYP1, CYP2 y CYP3 son las familias predominantes implicadas en el metabolismo de xenobióticos, mientras que otras familias de hacia arriba CYP4 están involucrados en el metabolismo de los grupos específicos de compuestos endógenos biológicamente activos que incluyen eicosanoides, hormonas esteroides, ácidos biliares y vitaminas como la vitamina A y D [ ,,,0],35] - [42]. Tienen transcripcional múltiple y post-transcripcional mecanismos de regulación [43]. Las formas metabolizadoras xenobióticos de P450 se han estudiado ampliamente en los tumores y muchos miembros individuales se ha demostrado que se sobreexpresa en tipos específicos de tumores más notablemente CYP1B1 que se ha demostrado haber aumentado la expresión en una amplia gama de tumores [25], [44 ] - [52]. La expresión selectiva de tumor P450 se ha propuesto como una diana terapéutica especialmente para P450 mediada activación pro-drogas [51] - [57]. Los P450s implicados en el metabolismo compuesto endógeno han recibido generalmente mucho menos estudio en los tumores con la excepción de los P450s que participan en hormona sexual (estrógeno y testosterona) metabolismo en relación a los objetivos en el cáncer de mama y de próstata, respectivamente [58] - [60].
Estructuralmente los P450s muestran mayor diversidad de aminoácidos en sus extremos C-terminales, que es el componente hidrófilo de la proteína en contraste con el N-terminal que es el componente más lipófilo de la proteína. Teniendo en cuenta la variación de aminoácidos C-terminal marcado y su hidrofilicidad el uso de péptidos a la C-terminal de P450 individuo como inmunógenos para producir anticuerpos monoclonales frente a las formas individuales de P450 ha demostrado para muchos grupos de investigación, incluyendo nuestro propio ser una estrategia altamente eficiente para desarrollar en forma monoclonal específico P450 individuales y policlonales [30], [61], [62].
En este estudio se han producido anticuerpos que son específicos para las formas individuales de la familia CYP26 saber cyp26a1, CYP26B1 y CYP26C1. Todos los tres enzimas CYP26 ácido retinoico hidroxilado y el cyp26a1 más plenamente caracterizada es la que es la forma predominante implicada en la hidroxilación de ácido retinoico. CYP26B1 y CYP26C1 se identifican más recientemente miembros de la familia CYP26 y son menos bien caracterizadas en comparación con cyp26a1. CYP26C1 parece tener expresión predominante pero no necesariamente exclusiva en regiones específicas del cerebro [22], [23].
Los cánceres colorrectales se pueden clasificar en función de su estado de inestabilidad de microsatélites /MMR y esto representa una importante vía de el desarrollo del cáncer colorrectal [63], [64]. En este estudio encontramos significado pronóstico para CYP26B1 tanto en toda la cohorte de pacientes y en aquellos tumores que fueron definidos como intactos microsatélites o estable. Por el contrario aquellos tumores que eran MMR defectuoso no mostraron ninguna importancia pronóstica lo que sugiere que los mecanismos de regulación distintos pueden estar operando en el dominio del MMR y MMR tumores defectuosos.
Las enzimas CYP26 se han propuesto como objetivos de medicamentos contra el cáncer [65 ] y el aumento de la expresión de cyp26a1 y CYP26B1 en el cáncer colorrectal podría sugerir que estas enzimas pueden ser dianas terapéuticas relevantes en este tipo de tumores. Varias series de compuestos basados en diferentes propiedades estructurales se han sintetizado que inhiben CYP26 [66] - [69]. Estos compuestos son altamente selectivos para CYP26 y muestran actividad inhibitoria alta (potencia nanomolar) hacia cyp26a1. Sin embargo, la actividad inhibidora de estos compuestos hacia CYP26B1 y CYP26C1 todavía no ha sido evaluado. La evidencia epidemiológica ha propuesto también la orientación de los retinoides y las vías de ácido retinoico para la quimioprevención del cáncer colorrectal y el aumento de la expresión de cyp26a1 y CYP26B1 en el cáncer colorrectal que indicaría que la orientación de estas enzimas puede ser un enfoque útil [70] - [72].
Este estudio también descubrió un aumento en la expresión de LRAT en el cáncer colorrectal primario en comparación con el epitelio del colon normal. Este hallazgo parece contrastar con estudios previos de otros tipos de tumores, incluyendo cáncer de vejiga [73], cáncer de mama [74] y el cáncer de próstata [75], que han sugerido la expresión LRAT reducida en células de cáncer aunque en esos estudios relativamente pequeño número de muestras de tumor eran ensayos analizados y principalmente bioquímicos de extractos tumorales enteras se utilizaron como resultado la evaluación de un "nivel medio" como estroma tumoral y el tejido necrótico se han incluido. No hubo asociaciones significativas entre la expresión LRAT tanto en toda la cohorte de pacientes y los tumores con dominio MMR cuando los puntajes LRAT se dichotomised en negativo /débil /moderada y fuerte. Esta asociación no fue tan marcada para otros puntos de corte y era menos robusto que el observado para CYP26B1 en términos de significados pronósticos.
El principal problema con la mayoría de tipos de cáncer, incluyendo el cáncer colorrectal, es la enfermedad metastásica y el tratamiento por lo general se dirige a la metástasis aunque la evaluación fenotípica en el que las decisiones de tratamiento se hace a menudo mediante el análisis de muestras de tumores primarios. En contraste con los eventos moleculares bien definidos que conducen al desarrollo de cáncer colorrectal las vías de metástasis han recibido mucha menos atención [76]. Este estudio fue diseñado para incluir la evaluación de la expresión fenotípica en ambos tumores primarios y sus correspondientes metástasis en los ganglios linfáticos. Se encontró que no había diferencia en la expresión en cyp26a1 o CYP26B1 entre tumores primarios y metástasis de los ganglios linfáticos correspondiente. Sin embargo, LRAT mostró disminución significativa en la expresión en la metástasis de los ganglios linfáticos en comparación con los tumores primarios correspondientes. Esto sugiere dos factores relacionados con el tumor primario y factores microambientales están involucrados en la regulación de la expresión de estas enzimas en la metástasis de cáncer colorrectal. Las posibles consecuencias de la expresión alterada de cyp26a1, CYP26B1 y LRAT en células de cáncer colorrectal metastásico y su contribución a un fenotipo pro-metastásico se resumen en la figura 6.
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