Extracto
productos finales de glicación avanzada (AGE) son producidos en una reacción no enzimática irreversible de hidratos de carbono y proteínas. Se sabe que tienen niveles elevados de edad, lo cual es visto como un factor de riesgo de complicaciones relacionadas con la diabetes Los pacientes con diabetes mellitus (DM). En un entorno clínico, se ha demostrado que los pacientes con cáncer oral conjuntamente con DM tienen una mayor probabilidad de metástasis del cáncer y menores tasas de supervivencia del cáncer. AGE-RAGE (un receptor de AGEs) también se correlaciona con metástasis y angiogénesis. Estudios recientes han sugerido que la malignidad del cáncer puede ser mejorada por AGEs gliceraldehído-derivado; Sin embargo, el mecanismo subyacente sigue siendo poco clara. Este estudio examinó la aparentemente estrecha correlación entre la AGE-RAGE y la malignidad de SAS línea celular de cáncer oral. En este estudio, los AGE aumento de la fosforilación de ERK, la migración celular mejorada y promueven la expresión de RAGE, MMP2, MMP9 y. Uso de PD98059, el anticuerpo RAGE, y RNAi RAGE para bloquear vía RAGE dio lugar a la inhibición de la fosforilación de ERK. La migración celular, MMP2 y MMP9 expresión también se redujeron por este tratamiento. Nuestros hallazgos demuestran la importancia de AGE-RAGE con respecto a la malignidad del cáncer oral, y ayudan a explicar el mal pronóstico de los individuos con DM con cáncer oral
Visto:. Ko SY, Ko HA, Shieh TM, Chang WC, Chen HI, Chang SS, et al. (2014) Migración celular está regulada por la interacción AGE-RAGE en células de cáncer oral humana
in vitro
. PLoS ONE 9 (10): e110542. doi: 10.1371 /journal.pone.0110542
Editor: Barry I. Hudson, Universidad de Miami, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 23, 2014; Aceptado: September 16, 2014; Publicado: 16 de octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Ko et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (NSC 100-2314-B-309-002-MY3). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
productos finales de glicación avanzada (AGE) son el resultado de una reacción de Maillard entre los carbohidratos y las proteínas. El envejecimiento y la función metabólica reducida se ha demostrado que aumentar la formación de AGEs [1] - [5]. El aumento de la acumulación de AGE también se ha observado en los pacientes con la enfermedad de Alzheimer (AD) o diabetes mellitus (DM) [6] - [8]. Por otra parte, los AGE han demostrado que desempeñan un papel en la patogénesis de la MS, de tal manera que la acumulación de AGE es considerado como un factor de riesgo de diversas complicaciones de la enfermedad [9] - [14].
Los estudios recientes han demostrado que los AGE y rabia (receptores de AGE) regulan la migración celular [15] - [17]. sobreexpresión RAGE se ha relacionado con el cáncer de colon, la laringe, la lengua, el estómago, y la boca [18] - [20], a través de la carcinogénesis [21], la proliferación celular, la metástasis, invasión y la angiogénesis [22] - [25]. En un estudio clínico que incluyó a pacientes que sufren de cáncer oral, así como DM, el cáncer volvió cada vez más invasivo, lo que resulta en una disminución de las tasas de supervivencia [26]. Ese estudio identificó además una correlación entre el cáncer oral y DM [27]. RAGE se ha demostrado que estar estrechamente asociada con la invasión en el cáncer oral [15], y la malignidad del cáncer puede ser mejorada por AGEs gliceraldehído-derivado [17]. Sin embargo, el mecanismo subyacente responsable de estos efectos aún no está claro.
Este estudio investigó la aparentemente fuerte correlación entre la AGE y la malignidad del cáncer oral. Nuestros resultados demuestran que AGEs mejoran la migración celular y también aumentan la fosforilación de ERK y la expresión de RAGE, MMP2, MMP9 y. Se encontró pretratamiento con PD98059 (un inhibidor de ERK) para suprimir los efectos de los AGE; sin embargo, la expresión de RAGE no se inhibió. anticuerpos RAGE también se utilizaron para bloquear la conjugación de los AGE, lo que resultó en una reducción de la fosforilación de ERK, la expresión de MMP2, MMP9, y la migración celular. Por otra parte, RAGE ARNi parece regular estos efectos, lo que sugiere que el sistema AGE-RAGE altera la migración celular a través de la fosforilación de ERK y la regulación de las vías descendentes. Nuestros resultados proporcionan una prueba más de que AGE-RAGE juega un papel importante en la determinación de la malignidad del cáncer oral.
Materiales y Métodos
Reactivos
fenilmetilsulfonilo fluoruros (PMSF), bovino albúmina de suero (BSA), DL-gliceraldehído, y PD98059 se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). medios DMEM, suero fetal bovino (FBS), penicilina, estreptomicina, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), azul de tripano, y Lipofectamine RNAiMAX se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). GAPDH (Cat No .: MAB374) se adquirió de Chemicon (Temecula, CA, EE.UU.). ERK (Cat No .: SC-94), p-ERK (Cat No .: SC-7383), RAGE (Cat No .: SC-94), y la rabia siRNA (Cat No .: SC-36374) fueron adquiridos de la biotecnología Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE.UU.). MMP-2 (Cat No .: 2763-S) y MMP9 (Cat No .: 2551-S) fueron adquiridos de Epitomics (Burlingame, CA, EE.UU.). Las membranas de nitrocelulosa fueron adquiridos de corp PALL. (Ann Arbor, MI, EE.UU.). aumento de quimioluminiscencia (ECL) se adquirió de Millipore (Billerica, MA, EE.UU.). WST-1 kit se adquirió de Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA, EE.UU.). Cultura-Insertar fue adquirido de ibidi (Verona, WI, EE.UU.).
Preparación de todas las gentes
AGE se prepararon mediante la incubación de BSA (pH = 7,4) en PBS con 20 mM DL-gliceraldehído en 37 ° C durante 1 semana. El producto se dializó en PBS a 4 ° C durante 2 horas, y este ciclo se repitió 5 veces. Después, el producto se concentró a 4 ° C utilizando un tubo de concentración Ultra proteína Amicon (Millipore) y se centrifugó a 3000 rpm durante 30 minutos antes de ser almacenada a -80 ° C [28].
cultura y el tratamiento de la célula
La línea celular de cáncer oral SAS (Colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación Banco de células [JCRB], Japón) se hizo crecer a 37 ° C bajo un 5% de CO
2 atmósfera. El cultivo se mantuvo en medio DMEM (Invitrogen) rutinariamente suplementado con 10% FBS, 100 unidades /ml de penicilina, 2 mM de L-glutamina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células se incubaron sin suero durante 24 horas antes del tratamiento.
Trypan azul tinte exclusión ensayo
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una concentración de 10
5 por pocillo y se se cultivaron durante 24 horas. La viabilidad celular se determinó en función de su capacidad de excluir 0,5% de azul de tripano (Invitrogen) después del tratamiento con AGEs 100-400 g /ml durante 24 y 48 horas, respectivamente. Un volumen igual de solución de azul de tripano colorante (0,1%, w /v), HBSS, y la suspensión de células se combinaron y se mantuvo a temperatura ambiente durante cinco minutos. Las muestras se cargan en un hemocitómetro para categorizar como células vivas o muertas acuerdo con la captación de tinte. Todas las cifras que se presentan en este estudio son los valores medios de tres experimentos.
WST-1 ensayo
Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una concentración de 5 × 10
3 por pocillo y se cultivaron durante 24 horas. La proliferación celular se detectó por el kit WST-1 (Clontech) en medio condicionado. Las muestras se prepararon de acuerdo con el protocolo descrito por el fabricante. En pocas palabras, después del tratamiento con AGEs (0-400 g /ml), el medio acondicionado se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos. a continuación, el sobrenadante se transfirió a placas de 96 pocillos (100 l /pocillo). Se añadió mezcla de reacción (100 l) a cada pocillo, seguido de incubación durante 30 minutos. Durante el período de incubación, las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente (RT) y protegidos de la luz. La absorbancia de las muestras se midió a 490 nm. longitud de onda de referencia debe ser mayor que 600 nm. Todas las cifras que se presentan en este estudio son los valores medios de los experimentos realizados por triplicado.
Los experimentos de interferencia de ARN
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos a una concentración de 2 × 10
5 células por pocillo y se cultivaron durante 24 horas. Las células fueron luego transfectadas con siRNA RAGE (un grupo de 3 objetivo específico de 19 a 25 nt siRNA; Santa Cruz) o la secuencia de cadena sentido de la RNAi como control negativo (5'-UUCUCCGCCCGUGUCACGU-3 ') [29]. Las transfecciones se realizaron utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. En concreto, se diluye 40 pmol de ARNi duplex en 250 l de Opti-MEM reduje medio con suero sin suero. A continuación, mezclar suavemente la Lipofectamine RNAiMAX y se diluyó 4 l de la mezcla en 50 l de Opti-MEM reduje medio con suero. El dúplex RNAi diluido se combinó con Lipofectamine diluida RNAiMAX y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron el ARNi duplex complejos Lipofectamine RNAiMAX a cada pocillo. Esto dio lugar a un volumen final de 600 l y una concentración de siRNA final de 20 nM. Las células se incubaron durante 48 horas antes de ser utilizado en los experimentos.
Western blot
Las proteínas (30 g) se resolvieron usando 10% de gel de SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (PALL Corp .). Las membranas se bloquearon con leche no grasa y se incubaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-p-ERK (dilución de 1:1,000); anti-ERK (dilución de 1:1,000); anti-MMP2 (dilución de 1:1,000); anti-MMP9 (dilución de 1:1,000); anti-RAGE (dilución de 1:1,000;.. entonces se eliminaron anti-GAPDH (dilución de 1:40,000) Los anticuerpos primarios y las membranas se lavaron con tampón PBST durante 30 minutos, las membranas se incubaron posteriormente durante 45 minutos a temperatura ambiente con la siguiente anticuerpos secundarios:. peroxidasa de rábano picante conjugado anti-ratón (dilución de 1:4,000) y anti-conejo (dilución de 1:4,000) (Chemicon) por último, los anticuerpos secundarios fueron retirados y las membranas se lavaron con tampón PBST dos veces durante 30 minutos. se detectaron señales utilizando el kit de Western iluminación quimioluminiscencia Reactivo Plus (Millipore). las densidades de las señales se midieron utilizando un sistema de imagen, y las señales se cuantificaron después de haber sido normalizado frente a los de GAPDH. Todas las cifras presentadas en este documento son los valores medios a partir de experimentos realizados por triplicado.
la migración de células de ensayo
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos usando Cultura-Insert (ibidi) a una concentración de 6 x 10
5 células por pocillo y después se cultivaron durante 24 horas. Después de un período de 24 horas en condiciones libres de suero, la cultura-insertos se retiró y las células se lavaron usando HBSS, antes de ser tratado con AGE para el análisis de la migración celular.
Zymorgraphy ensayo
Tras el tratamiento con AGEs 200-400 g /ml durante 4 o 24 horas, las células se sembraron en 7 platos cm a una concentración de 1 x 10
6 células. Zymography se utilizó para detectar la función de MMP2 y MMP9 en medio condicional. Para lograr esto, se utilizó 7,5% en gel de SDS-PAGE que contenía 0,1% de gelatina (J.T.Baker, Center Valley, PA, EE.UU.). El gel se lavó con 2,5% Triton X 100 durante 30 minutos a TA. Triton X 100 se retiró y el gel se lavó con RO H
2O. A continuación, añade tampón de renaturalización (50 mM Tris-HCl pH 7.2,20% de glicerol) durante 30 minutos a TA. tampón de renaturalización se eliminó y el gel se lavó con RO H
2O. A continuación, añade tampón de desarrollo (50 mM Tris-HCl pH 8,8, 5 mM de CaCl2, 1 mM de ZnCl2) durante 24 horas a 37 ° C. El desarrollo de tampón se eliminó y el gel se lavó con RO H
2O. tinción del gel se llevó a cabo durante 1 hora a RT usando PageBlue Protein tinción (Fermentas, Lafayette, CO, EE.UU.). destaining gel se llevó a cabo utilizando RO H
2O a TA. . (Figura S1)
Estadística
analiza
Hemos realizado pruebas t de estudiantes, ANOVA de una vía, y los valores de p de & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativas
Resultados.
influencia de los AGE en las células cancerosas orales
Se evaluó por primera vez la influencia de los AGE sobre la viabilidad celular. células SAS fueron tratados con AGEs (0-400 mg /ml) o BSA (0-400 mg /ml) durante 24 o 48 horas, después de lo cual el número de células y tasa de proliferación se determinó de acuerdo con la trypan exclusión del colorante azul (Fig. 1A ) y WST-1 ensayos (Fig. 1B). En comparación con las células de control, las células tratadas AGE mostraron una reducción significativa en el número de células (24 horas AGEs 100: 2,88 ± 0,16,
P
= 0,006; AGEs 200: 2,6 ± 0,25,
P
= 0,008; AGE 400: 1,85 ± 0,05,
P Hotel & lt; 0,0001; 48 horas AGEs 100: 3,1 ± 0,18,
P
= 0,05; AGE 200: 2,57 ± 0,17,
P = 0,01
; AGE 400: 2,03 ± 0,08,
P
= 0,003). Por el contrario, BSA ha demostrado aumentar el número de células (como un control negativo, de 24 horas: 4,77 ± 0,32, ns; 48 horas: 9,25 ± 0,35,
P
= 0,0004) (Fig. 1A). Además, se demostró que la proliferación de células a ser inhibida por los AGE (Fig. 1B). Por último, el tratamiento de las células con los AGE (400 g /ml; 0-4 horas) aumento de la migración; Sin embargo, la BSA no tuvo ningún efecto sobre la migración (Fig. 1C).
SAS células fueron tratadas con AGE (0-400 mg /ml) o BSA (0-400 mg /ml) durante 24 a 48 horas. Se detectaron el número de células y la proliferación usando exclusión de azul de tripano colorante (A) y un ensayo de WST-1 (B). AGEs redujo significativamente el número de células; BSA (como control negativo) el aumento de la viabilidad (A). AGEs también inhibió la proliferación celular (B). El tratamiento con AGE (400 mg /ml; 0-4 horas). Migración celular mejorada, mientras que el tratamiento con BSA no lo hicieron (C) guía empresas
AGE regulación de RAGE, MMP2, MMP9 y
Las células se trataron con los AGE (200 y 400 g /ml) o BSA (400 mg /ml) durante 24 horas. A continuación, utiliza el análisis de Western blot para detectar RAGE, MMP2, MMP9 y. En comparación con las células de control, el resultado mostró que las células AGE tratados presentaron un aumento significativo de RAGE (AGE 400: 1,3 ± 0,03,
P = 0,0007
), la MMP-2 (AGE 200: 1,28 ± 0,04,
P
= 0,002; AGE 400: 1,47 ± 0,04,
P
= 0,004), y MMP9 (AGE 400: 1,24 ± 0,03,
P = 0,0008
) (figura 2).. Además, la funcionalidad de MMP2 y MMP9 se aumentó después del tratamiento con AGEs de 4 o 24 horas (Fig S2).
Después de tratar las células con AGEs (200 y 400 g /ml) o BSA (400 g /ml ) durante 24 horas, rabia, MMP2, MMP9 y fueron detectados por Western blot (a). AGE aumentaron significativamente la expresión de RAGE, MMP2, MMP9 y (B).
Regulación de la fosforilación de ERK por AGEs
Con el fin de identificar la vía de los AGE, se trataron las células SAS con edades o BSA durante 24 horas. a continuación, la fosforilación de ERK se detectó usando análisis de transferencia Western. Nuestros resultados muestran que el tratamiento con AGE aumentó significativamente la fosforilación de ERK (AGE 400: 1,26 ± 0,06,
P
= 0,01) (Figura 3A.). la fosforilación de ERK se mejoró después de 4 horas AGEs tratamiento (Fig S2); sin embargo, el pretratamiento de las células con PD98059 durante 1 hora resultó en una reducción en la expresión de MMP2 y MMP9 (Fig. 3B y C). Parece que PD98059 pretratamiento bloqueó los efectos de AGEs en la migración de células (Fig 3D.); Sin embargo, la expresión de RAGE no se vio afectada (AGE 400: 1,27 ± 0,04,
P
= 0,003) (Figura 3E).
El análisis de transferencia Western que muestra que el tratamiento de las células con SAS AGE durante 24 horas. resultado en un aumento de la fosforilación de ERK (a). El pretratamiento con PD98059 durante 1 hora fosforilación reducida ERK, MMP2 y MMP9 (B y C), así como la migración de células (D); Sin embargo los niveles de RAGE siguieron aumentando (E).
Reglamento de ERK por AGE a través de RAGE
anticuerpos RAGE (10 ng /ml de pretratamiento durante 1 hora) se utilizaron para bloquear la conjugación EDAD. El tratamiento con AGEs resultó en un aumento significativo en la fosforilación de ERK y la expresión de MMP2, MMP9 y (ERK: 1,31 ± 0,03,
P
= 0,0008; MMP2: 1,38 ± 0,04,
P =
0,0005; MMP9: 1,32 ± 0,09,
P
= 0,02). En comparación con las células tratadas con AGEs solamente, las células tratadas con ambas edades y anticuerpo RAGE demostró la fosforilación de ERK inhibió significativamente (
P
= 0,009), así como la reducción de expresión de MMP2 (
P
= 0,05) y MMP9 (
P = 0,0003
) (Fig. 4 A y B). anticuerpos RAGE también se muestran para suprimir la migración de células (Fig. 4C).
El uso de anticuerpo RAGE (10 pretratamiento ng /ml durante 1 hora) para bloquear la conjugación AGE resultó en un aumento significativo en la fosforilación de ERK, MMP2, MMP9 y debido a la AGE. En comparación con el tratamiento de los AGE (#), anticuerpo RAGE bloqueó la fosforilación de ERK, MMP2, MMP9 y (A y B), así como la migración celular (C).
RAGE RNAi (20 nM durante 48 horas) a continuación, se utilizó para silenciar la expresión de proteínas. En comparación con el control negativo RNAi (N), RAGE RNAi ha demostrado tener una expresión suprimir significativamente RAGE (0,64 ± 0,07,
P
= 0,006) (Fig. 5A). Se encontró que la supresión de la migración celular por RAGE RNAi a ocurrir independientemente de los efectos de los AGE (Fig. 5B). Por otra parte, RAGE RNAi inhibe la fosforilación de ERK (RNAi: 0,64 ± 0,08,
P
= 0,01; N + AGE: 1,26 ± 0,03,
P
= 0,001) MMP2 (N + AGE: 1,28 ± 0,04,
P
= 0,003), y la secreción de MMP9 (RNAi: 0,58 ± 0,06,
P = 0,002;
N + AGE: 1,36 ± 0,05,
P
= 0,003). En comparación con N + AGEs, el tratamiento con ARNi + AGEshad un efecto significativo en los tres de estos procesos (ERK:
P
= 0,02; MMP2:
P
& lt; 0,003; MMP9:
P
= 0,04) (Fig. 5C y D). El control negativo no mostró efectos significativos.
RAGE RNAi (20 nM durante 48 horas) se utilizó para silenciar la expresión de la proteína. En comparación con el control negativo RNAi (N), RAGE RNAi reducido significativamente la expresión de RAGE (A). La supresión de la migración celular por RNAi RAGE ocurrió independientemente del tratamiento con AGEs (B). RAGE RNAi también inhibió la fosforilación de ERK, MMP2, MMP9 y. En comparación con N + AGE (#), RNAi + AGE presentado una reducción significativa (C y D) y el control negativo no tuvo ningún efecto.
Discusión
Una relación entre el cáncer oral y DM se ha demostrado por los investigadores anteriores [30] - [32]. Los pacientes que sufren de cáncer oral en combinación con DM son cara con las células cancerosas altamente invasivos, y las bajas tasas de supervivencia [26]. Sin embargo, el mecanismo subyacente a la relación entre el cáncer oral y DM no ha sido dilucidado. Este es el primer estudio para investigar una posible relación entre AGE y el cáncer oral. Hemos llevado a cabo esta investigación para identificar el papel del sistema AGE-RAGE en el cáncer oral, y para dilucidar la relación entre el cáncer oral y DM
Los investigadores han informado anteriormente de que los AGE y RAGE regulan la migración celular [15]. - [17], [33]. Nuestros resultados confirman que AGEs mejoran la migración celular y también muestran que los AGE reducir la viabilidad celular. Takino et al. obtenidos resultados similares usando gliceraldehído AGE derivados de [17]. Por otra parte, Bhawal et al. RAGE informado de que está estrechamente asociado con la invasividad del cáncer oral [15], y nuestros resultados muestran que los AGE regulan la migración celular a través de la expresión de RAGE. En un entorno clínico, la expresión de MMP2 y MMP9 se ha aparecido a estar estrechamente relacionada con la metástasis en el cáncer oral [34], [35]. AGEs más se ha demostrado que aumentar la secreción de MMP2 [17] y regular la expresión de MMP9 [36], [37] a través de la vía de ERK [23], [38]. Nuestros resultados apoyan estos hallazgos anteriormente; en concreto, que la fosforilación de ERK y la expresión de MMP-2 y MMP9 están regulados por las edades. Además, CD44 es un factor de migración relacionada con el RAGE [39]. Sin embargo, no hemos podido diferencia significativa observada en la expresión de CD44 tras el tratamiento AGE (datos no mostrados). Un informe similar confirmó que la expresión de CD44 no se ve afectado por AGEs [40]. Esto sugiere que los AGE-RAGE regular la migración celular a través de una vía que no es CD44 dependiente
Estudios recientes han sugerido que RAGE es un receptor múltiple que regula la proliferación celular a través de su ligando (S100 o HMGB1) [41]. - [43]. Xu et al. y Meghnani et al. también sugieren que RAGE aumenta la proliferación celular y las vías relacionadas con el [44], [45]. Por otra parte, la HMGB1 se ha encontrado para regular la proliferación celular y la metástasis a través de la actividad inhibidora de melanoma RAGE y la vía (MIA) en el cáncer oral [46]. En nuestro estudio, los AGE y BSA parecen diferir en sus efectos sobre las células SAS. AGEs, se mostró a disminuir el número de células; sin embargo, BSA lo aumentó. Más específicamente, en este estudio las células se incubaron durante 24 horas antes del tratamiento libre de suero; por lo tanto BSA puede haber actuado como un factor de crecimiento. Nuestra conclusión de que los AGE disminuyeron el número de células, mientras que el aumento de la fosforilación de ERK indica claramente que los AGE difieren en sus efectos sobre las células. Valencia et al. también demostraron que las vías divergentes de la expresión de genes son activados por el ligando del RAGE S100 y AGEs [47]. Por lo tanto, los efectos de sistema AGE-RAGE difieren de las de otros ligandos
El uso de PD98059 para bloquear la vía de ERK resultó en la supresión de la migración celular y también redujo la expresión de MMP2 y MMP9.; sin embargo, no se observaron diferencias con respecto a la influencia de los AGE en el aumento de la expresión de RAGE. El uso de anticuerpos RAGE y RNAi para bloquear la vía AGE-RAGE dio lugar a la fosforilación de ERK inhibe y la migración celular y también redujo la expresión de MMP-2 y MMP9. Estos hallazgos demuestran que los efectos de los AGE sobre la migración de células se producen a través de la fosforilación de ERK. Curiosamente, sugirió un estudio clínico anterior de que el aumento en los niveles de RAGE en el cáncer correlacionado con metástasis [15], [33]. En otros modelos celulares, RAGE apareció para regular la migración celular [15], [48], [49]. Nuestros resultados muestran que los efectos de la migración celular RAGE RNAi influencia, la fosforilación de ERK, y la expresión de MMP9 independiente. Este hallazgo proporciona apoyo adicional a la afirmación de que RAGE media en la metástasis a través de la expresión de MMP9 a través de la vía ERK.
En este informe, los AGE disminuyeron la viabilidad celular y la migración celular mejorada, así como fomentar la fosforilación de ERK y la mejora de la expresión de MMP2 y MMP9. PD98059, anticuerpo RAGE, y ARNi, se mostró a mediar en la regulación EDAD. Este es el primer estudio en demostrar que RAGE regula la expresión de MMP9 través de la vía de ERK. Más importante aún, hemos demostrado el papel que AGE-RAGE juega en la malignidad del cáncer oral a través de la regulación y de ERK vías descendentes, en última instancia afecta a la migración celular en el cáncer oral. El mecanismo por el cual las funciones del sistema AGE-RAGE en nuestro
modelo in vitro Red de cáncer oral se presenta en la Fig. 6. AGEs aumentan la expresión de RAGE, que estimula la vía de aguas abajo de la fosforilación de ERK y los resultados en la regulación hacia arriba de MMP2 y MMP9. Esto a su vez mejora la migración de células, que se manifiesta en la malignidad del cáncer. Estos resultados explican por qué los casos de cáncer oral concurrente con DM presentan un incremento de la invasión del cáncer y las tasas de supervivencia reducidas. Los resultados también indican que la acumulación de AGE debido al envejecimiento o DM aumenta la probabilidad de desarrollar cáncer maligno.
AGE aumentan la expresión de RAGE y estimulan la vía aguas abajo de la fosforilación de ERK. Esto tiene el efecto de hasta la regulación de la expresión de MMP-2 y MMP9 y la mejora de la migración celular, que se manifiesta como enfermedad maligna.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Cierre del área de la migración celular. área de migración se midió usando ImageJ y se cuantificó mediante el registro de los cambios en el área de la herida. AGE disminuyeron significativamente el tamaño del área de la herida, mientras que PD98059, anticuerpo RAGE, RAGE y ARNi suprimen la migración a las 4 horas. El análisis fue la conducta de un modelo lineal, y el resultado fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,0001)
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figura S2..
Funcionalmente de MMP 2 y MMP 9. Después del tratamiento de las células con SAS AGEs (400 g /ml) durante 0,5-4 horas, se detectó la expresión de la fosforilación de ERK. La funcionalmente de MMP 2 y MMP 9 fueron detectados por zymorgraphy después del tratamiento AGE durante 4 o 24 horas. Los resultados muestran que los AGE aumento de la fosforilación de ERK (A). MMP 2 y MMP 9 se incrementaron en AGEs a las 4 horas, pero sólo MMP 2 se aumentó a las 24 horas (B)
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