Extracto
Se sabe que el cáncer progresa por transferencia vertical de genes, pero este paradigma ignora que el ADN circula en los organismos superiores y que es biológicamente activo a partir de su absorción por las células receptoras. Aquí se confirman las observaciones anteriores sobre la capacidad del ADN libre de células para inducir
vitro
transformación y tumorigénesis de células en el tratamiento de por NIH3T3 destinatario células murinas con suero de pacientes con cáncer de colon y el sobrenadante de células de cáncer humano SW480. la transformación celular y tumorigénesis de las células receptoras no se producen si el suero y sobrenadantes se agotaron de ADN. También se demuestra que la progresión del cáncer horizontal mediada por ADN circulante se produce a través de su absorción por las células receptoras en un
in vivo
modelo en ratas inmunocompetentes sometidos a la carcinogénesis de colon con 1,2-dimetilhidrazina había aumento de la frecuencia de los tumores de colon cuando inyectada en el dorso con células de carcinoma de colon humano SW480 como fuente de ADN circulante oncogénico, que podría ser compensada por el tratamiento de estos animales con DNasa I y proteasas. Aunque la contribución de moléculas biológicamente activas distintas de ADN para este fenómeno que ocurra no se puede descartar, nuestros resultados apoyan el hecho de que las células cancerosas emiten en la circulación biológicamente activa de ADN para promover la progresión tumoral. Una exploración más profunda del fenómeno de la progresión tumoral mediada por la horizontal ADN circulante es claramente necesaria para determinar si su manipulación podría tener un papel en la terapia del cáncer
Visto:. Trejo-Becerril C, Pérez-E Cárdenas, Taja-L Chayeb El Anker P, Herrera-R Goepfert, Medina-Velázquez LA, et al. (2012) la progresión del cáncer mediada por la transferencia horizontal de genes en un
En Vivo
Modelo. PLoS ONE 7 (12): e52754. doi: 10.1371 /journal.pone.0052754
Editor: Brian Lichty, McMaster University, Canada |
Recibido: 23 de julio de 2012; Aceptado: noviembre 20, 2012; Publicado: December 28, 2012
Derechos de Autor © 2012 Trejo-Becerril et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por CONACyT otorga 34649-H, 50699 y desde PAPIIT UNAM IN214902. Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen el siguiente interés. Co-autor Phillipe Anker está afiliada a OncoXL. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
El paradigma actual en la progresión del cáncer es que se produce a través de la transferencia de genes vertical; esto significa que la descendencia de la iniciación de células tumorales heredan las alteraciones genéticas y epigenéticas que conducen a la progresión del tumor. Este modelo, sin embargo, ignora que la transferencia horizontal o lateral de DNA se conecta y da forma a casi todos los seres vivos [1], y que dentro de un organismo, el ADN, tales como exosomas que contienen mRNA transcripcionalmente activo y microARN, potencialmente pueden actuar como una endocrino o circulante mensajero paracrina, capaz de afectar a la funcionalidad de las células de los destinatarios [2]. En consecuencia, se ha propuesto que el ADN libre de células (ADN circulante) podría participar en el desarrollo de metástasis a través de la absorción de la transfección como "pasiva" de tales ácidos nucleicos por las células susceptibles [3]. En 1994, Anker et al., Demostró por primera vez que el sobrenadante de la línea celular de cáncer de colon cultivadas SW480 fue capaz de transformar receptores murinos NIH3T3 células inmortales, que adquieren humano mutado
K-ras
[4]. La transformación de estas células receptoras por plasma de pacientes con cáncer de colon se ha informado, así como [5].
La capacidad de material genético a circular en eucariotas se conoce desde 1948 [6], y que este ADN puede ser publicado por bacterias y organismos superiores y entrar en las células receptoras se demostró por Anker y Stroun [7] - [9]. Estos hallazgos llevaron a la idea de que el ADN podría actuar como un mensajero [10] - [16]. Este punto de vista ha sido apoyado por la facilidad con la que administran bacteriano y ADN eucariota puede circular libremente en cuerpos de animales y plantas y en su capacidad para entrar en las células individuales, naturalmente, donde se puede localizar en el núcleo de la célula huésped [12], [17] - [18]. La absorción de ADN circulante por eucariotas muestra que la biología de los receptores de células /organismos podría modificarse independientemente de si se integra o no [19] - [27]
Es de destacar que la administración tal ADN hace. no requiere ninguna vehículos especiales, por ejemplo, liposomas, electroporación, y pistolas de genes, para ayudar a la entrada en células con el fin de que sea biológicamente activo. ¿Cómo circula genética del material y las transferencias en las células somáticas de organismos superiores sigue siendo controvertido. Aunque esto no es mutuamente excluyentes, algunos autores han demostrado que esto ocurre a través de la captación de cuerpos apoptóticos [28], mientras que otros han caracterizado ADN circulante como un complejo de ADN /ARN-lipoproteína denominado "virtosome", que se libera espontáneamente por la vida las células [29]. Aquí demostramos que el ADN circulante es capaz de conducir la progresión tumoral horizontal en un modelo de rata de colon-carcinogénesis inmunocompetentes.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares
SW480 (cáncer de colon humano línea celular que tiene el punto de mutación Gly a Val en el codón 12 del exón 1 de los
K-ras oncogen
), HeLa (línea celular de cáncer de cuello uterino humano positivo para el VPH-18), y NIH3T3 (ratón inmortalizado fibroblastos ) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection. El cultivo primario de fibroblastos de prepucio (BB1) se deriva de la circuncisión del prepucio de un niño recién nacido con el consentimiento por escrito de su padre y se utiliza en el segundo pasaje.
sobrenadante Preparación
Cuando los cultivos de células tenían una confluencia de 80%, los sobrenadantes se recogieron mediante pipeteo y elimine cualquier resto de las células y los restos celulares por una etapa de centrifugación a 400 ×
g
durante 20 minutos (Biofuge primo R, Heraeus) y se pasó a través de un filtro de 0,45 mm ( Sartorius, 16555) para eliminar células potencialmente contaminantes. Partes alícuotas de cada uno muestras de sobrenadante se sembraron en un matraz de cultivo y se incubaron a 37 ° C durante 120 h para verificar la ausencia de las células vivas. Para el análisis de ADN, se concentraron 50 ml de sobrenadante, primero con un sistema de ultrafiltración con un poro 40 kDa de membrana (Amicon, se agitó célula de ultrafiltración, modelo 8010) y después con un dispositivo de vacío de velocidad (Vacufuge Plus, Eppendorf) hasta 10 ml. El sobrenadante concentrado fue inmediatamente criopreservados a -80 ° C.
La digestión enzimática de los sobrenadantes procesados
Cincuenta ml de los sobrenadantes procesados de SW480 (SW) y NIH3T3 (NH) fueron divididos en 12,5 ml alícuotas y se incubaron con proteinasa K y /o ADNasa I como sigue: 1) SW + DNasa I; 2) SW + proteinasa K; 3) SW + DNasa I + proteinasa K, y 4) sin enzima. Las digestiones control fueron + ADN de esperma de salmón + FBS DMEM 2%, y b) se realizó DMEM + 2% de FBS + ADN de esperma de salmón + DNasa I. La digestión con 1,5 unidades (50 g) de proteinasa K por mg de proteína total contenida en sobrenadante durante 60 min a 37 ° C seguido de la inactivación a 80 ° C durante 20 min. Para DNAsa I, la concentración de enzima era de 12 unidades (3,6 Kunitz) por 12 g de contenido de ADN en el sobrenadante durante 60 min a 37 ° C y luego inactivación a 65 ° C durante 15 min. La digestión con ambas enzimas se llevó a cabo con la misma concentración y veces, pero la digestión con proteinasa K primero y luego DNasa I. Después de la digestión enzimática, el sobrenadante se utilizó para la transfección "pasivo" como se indicó anteriormente. La degradación de proteínas y /o ADN se verificó mediante electroforesis en gel.
Serum Recogida y preparación de
Los sueros se extrajo a partir de sangre de tres pacientes con cáncer de colon avanzado y sujetos sanos. Se obtuvo sangre de vena periférica en dos tubos vacutainer (Becton Dickinson, 368162) que contiene aditivo de activación del coágulo y un gel de barrera para aislar el suero. La sangre se mantuvo a 4 ° C, y se procesa dentro de 2 h, y se centrifugó a 1000
× g
de 20 min (Biofuge primo R, Heraeus) a temperatura ambiente; se recogió el suero y se pasa a través de un filtro de 0,45 mm (Sartorius, 16555) para eliminar las células. Las muestras de sangre se obtuvieron con el consentimiento por escrito de los pacientes de origen.
Pasivo La transfección de células de ratón NIH3T3
células NIH3T3 -como destinatario para el assays- transformación se sembraron en placas de 24 pocillos y se expone a humanos suero o sobrenadantes SW480 (digerido o no) en una proporción 1:01 (DMEM con 2% de FBS /suero o sobrenadante) durante 14 días, refrescante los medios cada 24 horas [4]. Después de 14 días de exposición (sólo siete días en placas expuestas a suero), se dispersaron las células y se propagan en condiciones estándar. A continuación, se analizaron las células expuestas a la presencia de mutado humano
K-ras
secuencias por PCR, RT-PCR y secuenciación. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Transfección activa (Lipofectamine)
Un día antes de la transfección, las células NIH3T3 se sembraron a una densidad de 1 × 10
5 células por pocillo (de seis pocillos placas) en 500 l de medio de crecimiento sin antibióticos (DMEM). Las transfecciones se realizaron utilizando 5μg de ADN (ya sea ADN genómico o ADN sobrenadante de las células SW480, más 0,5 g de plásmido (pEGFP-CMV) transfecciones Lipofectamine se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen ™, LTX y amp;.. Plus reactivo) Las células se incubaron a 37 ° C durante 24 h; medio fue refrescado y la selección G418 se inició para obtener transfectantes estables
ensayos de transformación
NIH3T3 que fueron transfectadas de forma pasiva fueron empleados para llevar a cabo los ensayos de transformación Como control,.. utilizamos células NIH3T3 expuestas al suero de un donante sano y a su propia sobrenadante. las características utilizadas como indicadores de la transformación maligna eran cambios morfológicos (formación de foco), independiente del anclaje de crecimiento (crecimiento en agar blando) y la tumorigenicidad [30] .
Análisis morfológico
se examinaron las células NIH3T3 transfectadas para la formación de focos y se contaron con un microscopio de contraste de fase.
crecimiento de células en agar blando
focos se aislaron a partir de placas de cultivo de plástico y ampliado para el análisis de agar blando. Después se suspendieron trypsinitation células en medio DMEM que contiene 0,3% de agar noble y 15% de FBS. Una capa de esta suspensión se sembró en la parte superior de una capa de medio que contiene 0,7% de agar sin suero. Las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
5 células por placa de 10 cm. Las colonias se puntuó después de 14 días de cultivo (una colonia se definió como si contenía al menos 50 células).
En
in vivo Los experimentos
Los ensayos de tumorogénesis se realizaron en 6 -Semana de edad atímicos BALB /c (nu /nu) hembra (Harlan Laboratories). En todos los experimentos, se inyectaron grupos de seis ratones por vía subcutánea con 2 millones de células en suspensión en 100 l de DMEM-FBS-libre. El crecimiento tumoral se monitorizó y registró semanalmente. El tamaño del tumor se midió con un calibrador electrónico y tamaño-volumen estimado utilizando las fórmulas a × b
2 × (/6 π) = V (mm
3) (a = diámetro mayor; b = diámetro menor y V = volumen). En los experimentos para evaluar la capacidad de la tumorigénesis de sobrenadante de células HeLa en animales no manipulados, también se utilizaron 6 semanas de edad, atímicos BALB /c (nu /nu) ratones hembra. Los animales fueron inyectados diariamente por vía intraperitoneal con 500 l de sobrenadante de células HeLa durante 30 días. Al día 31, se sacrificaron los animales. Atímicos HSD: RH-
Foxn1
NUR
ratas hembras y inmunocompetentes: HSD ratas hembras Wistar así (Harlan Laboratories) fueron inyectados con cuerpos apoptóticos a partir de células HeLa, que se obtuvieron después de la exposición a dosis altas para el 24 horas a cisplatino en 75 m. Independiente células fueron cosechadas y centrifugados paso a 400 ×
g
durante 10 minutos (Biofuge primo R, Heraeus) en PBS tres veces para eliminar cualquier resto de cisplatino. Las inyecciones de cuerpos apoptóticos se realizaron cada dos días mediante inyección intravenosa en la cola en un volumen total de 100 l de solución salina normal. El tratamiento duró 60 días. Al día 61 se sacrificaron las ratas y la necropsia realizados para evaluar la formación de tumores macroscópicamente. órganos principales (hígado, bazo, riñón, pulmón y útero) se procesaron para H & amp; E examen patológico
Para evaluar la progresión del tumor horizontal, HSD: Se trataron ratas Wistar de 6 semanas de edad, las ratas hembras (Harlan Laboratories). ya sea con: i) sin tratamiento; ii) la inyección subcutánea de 1 x 10
6 SW480 células (diluido en 100 l de solución salina normal) en el flanco de subida en los días 28 y 49 de tratamiento DMH; iii) la sustancia cancerígena de colon DMH por vía intraperitoneal durante 20 semanas según ha informado [31]; iv) el régimen de las células SW480 DMH plus; y v) como iv grupo más el tratamiento /proteasa ADNasa I que consistía en DNAsa I a una dosis de 2,3 mg /Kg por inyección intramuscular y una mezcla de proteasas (tripsina, quimotripsina, y papaína) mediante inyección intraperitoneal a dosis de 10 mg /Kg, 10 mg /kg y 25 mg /Kg, respectivamente, como se informa en [32]. Tanto ADNasa I y la mezcla de proteasas se diluyeron en 100 l de solución salina normal. Las inyecciones se administran todos los días excepto los fines de semana a partir de la semana 4 a 12. Grupo VI recibió DMH + DNasa I /proteasas. Después de la evaluación con micro PET-CT (como se describe más adelante) los animales fueron sacrificados y se realizaron las autopsias 6 meses después de terminar las 20 semanas de carcinógeno (DMH)
Para evaluar el destino de las células SW480 humanos inyectados en animales inmunocompetentes Hsd.: Wistar de 6 semanas de edad, las ratas hembras (Harlan Laboratories) se inyectaron por vía subcutánea con 10 millones de SW480 células en el flanco y se sacrificaron en los días 1, 2, 3, 7 y 14 después de la inyección para eliminar el sitio de la inyección y se procesan para la rutina de H & amp análisis histológico E;. aprobaciones éticas se obtuvieron de la Junta Ética de Investigación Institucional y Cuidado de Animales.
Micro PET-TAC
La formación de tumores en los animales se controló utilizando técnicas de imagen molecular con un micro PET-TAC (Albira ARS, ONCOVISION) y
18 F-FDG. monitorización de tumores se llevó a cabo en las semanas 15 y 24 después del inicio del tratamiento (DMH). Para cuantificar la actividad tumoral, el valor de captación estándar (SUV) se calculó utilizando Albira herramientas de software del sistema (Carestream Molecular Imaging, CT, EE.UU.). SUV es una herramienta cuantitativa para los estudios PET-TC que permite la determinación de la
concentración de 18F-FDG en un (es decir, la actividad tumoral) específica para la región de intereses. la presencia del tumor se definió cuando el cociente de la camioneta (tumor /hígado) fue ≥1.5.
Preparación del tejido y microdisección
Los tumores, fijado en formol e incluidos en parafina de colon (uno de cada grupo) de cada grupo de ratas tratadas con DMH se cortaron en secciones de 5 micras de espesor en un microtomo con una cuchilla desechable. Para la microdisección, las secciones se desparafinaron en dos cambios de xileno durante 10 min, rehidratada en 100% de etanol, 90% de etanol y 70% de etanol durante 5 min cada uno, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) durante 45 segundos, se enjuagaron en -RNasa libre de H
2O durante 30 segundos, y finalmente se sumerge en 100% de etanol durante 1 min. El sistema láser PALM-MicroBeam (P.A.L.M., Wolfratshausen, Alemania) se utilizó para la microdisección. Después de seleccionar las células de intereses, las células adyacentes se fotolizados por el microbeam. Para recuperar las celdas seleccionadas a partir de la diapositiva, un micromanipulador controlado por ordenador y agujas estériles convencionales fueron utilizados para recoger y transferir las células en un tubo de reacción.
Extracción de ADN
circulante Extracción de ADN se realizado por digestión K SDS /proteinasa seguido de extracción con fenol /cloroformo como se describe por Anker, P [4]. Brevemente, 500 l de suero o sobrenadante se mezclaron con 500 l de una solución de SDS /proteinasa K (Invitrogen) y se incubaron durante la noche a 55 ° C. (V 01:01 v /) Se añadió un volumen igual de fenol /cloroformo, vortex brevemente, y se centrifugó a 800 xg durante 10 min (Biofuge primo R, Heraeus). La fase acuosa se recuperó y se mezcló con un volumen igual de cloroformo y se centrifugó a 800 x g (Biofuge primo R, Heraeus) durante 5 min. La fase acuosa se precipitó durante la noche a -20 ° C con 1/10 de volumen de acetato de amonio 7,5 M, 1 l de glucógeno, y 2,5 volúmenes de etanol al 100% y después se centrifugó a 1200 × g (Biofuge primo R, Heraeus) para 45 min. El sedimento de ADN se lavó con 70% de etanol, se secó al aire y se resuspendió en agua. La cuantificación de DNA total se realizó utilizando el ensayo PicoGreen (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. ADN de tumores microdissected de tejido incluido en parafina se extrajo con el kit de aislamiento de ADN PicoPure ™ (ARCTURUS Mountain View CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Extracción de ARN
ARN total se aisló a partir del sobrenadante procesados y suero humano usando QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante.
PCR
Todas las reacciones se realizaron en 20 l que contenía 100 ng de ADN molde, 10 mmol /l Tris-HCl (pH 8,3), 40 mmol /l KCl, 2 mmol /l MgCl
2, (1 mmol /l MgCl
2
RAB30
, y 5 mmol /l MgCl
2
Alu Yd6
), 200 mmol /l de cada dNTP, 0,25 U Taq polimerasa (Applied Biosystems), y 1 mol /l de cada cebador específico: humanos
K-ras gratis (5'-gactgaatataaacttgtggtagt-3 'y 3'-ggacgaatatgatccaacaatag-5'), 107 pb de amplificación;
E6 gratis (5 'gggggatccatggcgcgctttgaagatccaaca-3' y 3'-ggggaattcttatacttgtgtttctctgcgtcg-5 '), 450 pb de amplificación;
E7 gratis (5'-cccgacgagccgaaccacaac-3 'y 3'-gggatgcacaccacggacacac-5'), 300 pb de amplificación; humana
DHFR gratis (5'-agaaccaccacgaggagc-3 'y 3'-acagaactgcctccgactatc-5'), 120 pb de amplificación; humana
actina gratis (5'-ggagtcctgtggcatccacg-3 'y 3'-ctagaagcatttgcggtgga-5'), 320 pb de amplificación. Humana
RAB30 gratis (5'-gtccattacccagagttactaccg-3 'y 3'-gaccttgttgctggcatattgttc-5'), 130 pb de amplificación;
Alu Yd6 gratis (5'-gagatcgagaccacggtgaaa-3 'y 3'-ttgctctgaggcagagttt-5'), amplicón de 200 pb [33].
Una desnaturalización inicial a 94 ° C durante 5 min fue seguido por 40 ciclos de amplificación y una extensión final paso 5 min a 72 ° C, (
E6
,
E7
y
Alu Yd6
tuvo tiempo de extensión de 30 seg ). Los ciclos incluyen desnaturalización a 94 ° C durante 30 segundos, 30 segundos de hibridación (60 ° C para
K-ras
y
RAB30
, 59 ° C durante
actina
y
DHFR
, 57 ° C durante
E6
y
E7 Opiniones y 61 ° C para
Alu Yd6
), las reacciones de PCR se llevaron a cabo en una 2400 (Applied Biosystems) termociclador. Los productos de amplificación se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Por específica rata
LINEA 1 | secuencias de la amplificación se realizó en reacciones de 20 l que contenía 100 ng de ADN molde, 10 mmol /l de Tris-HCl (pH 8,3), 40 mmol /L de KCl, 1 mmol /l de MgCl
2, 200 mmol /l de cada dNTP, 0,25 U Taq polimerasa (Applied Biosystems) y 1 mol /l de cada cebador específico para la rata
LINE 1 gratis (5'-aaatcagggactagacaaggctgc-3 ', y 3'-cccagccactttgctgaagttgt-5 ') [34]. La desnaturalización inicial a 94 ° C durante 5 minutos fue seguido por 40 ciclos de amplificación y una etapa de extensión final (5 minutos a 72 ° C). ciclos de amplificación consistieron en desnaturalización a 94 ° C durante 30 segundos, hibridación a 59 ° C durante 30 segundos, y extensión a 72 ° C durante 30 segundos. reacción de PCR se llevó a cabo en un termociclador 2400 (Applied Biosystems). Los productos de amplificación se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa.
RT-PCR
Para la síntesis de la primera cadena de ADNc 1-5 g de ARN total se sometió a transcripción inversa en un volumen de reacción de 20 l que contiene 2 l de 10 x tampón de PCR, 50 ng de hexámeros aleatorios, mM MgCl 50
2, 200 ng nM dNTP, DTT 0,1 M, y 200 U de transcriptasa inversa, (GeneAmp, Applied Biosystems) durante 50 minutos a 42 ° C. amplificación por PCR de cDNA se realizó en un volumen de reacción de 20 l que contiene 100 ng cDNA, 10 mmol /L de Tris-HCl (pH 8,3), 40 mmol /L de KCl, 1 mmol /L MgCl
2 (por
K -ras
v12 y
RAB30
), y 200 mmol /L de cada dNTP, 0,25 U Taq polimerasa (Applied Biosystems), y 1 mol /l de cada cebador específico para el humano
K-ras
v12 (5'-actgaatataaacttgtggtagttggacct-3 'y 3'-caaatcacatttatttcctaccaggacct-5'), y por
RAB30 gratis (5'-gtccattacccagagttactaccg-3 'y 3 '-gaccttgttgctggcatattgttc-5'). desnaturalización inicial a 94 ° C durante 5 min fue seguida de 40 ciclos de amplificación y una etapa de extensión final (5 min a 72 ° C). Los ciclos incluyen desnaturalización a 94 ° C durante 30 segundos, hibridación a 58 ° C (
K-ras
v12), y a 56 ° C (
RAB30
) durante 30 segundos y extensión a 72 ° C durante 30 seg. El tamaño de los amplicones y la secuencia de los cebadores utilizados para la PCR de
K-ras
v12 es 357 pb, y por
RAB30
, 130 pb. La reacción de PCR se llevó a cabo en un termociclador 2400 (Applied Biosystems). Los productos de amplificación se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 3%.
secuenciación de ADN
para verificar el origen de la secuencia amplificada (humano o murino), los productos de PCR se secuenciaron. amplicones de PCR fueron purificados usando precipitación con isopropanol y luego secuenciados en ambas direcciones de avance y retroceso de al menos dos productos de amplificación independientes. El ADN purificado se diluyó y se secuenció ciclo-v3.1 usando el kit ABI BigDye Terminator (ABI, Foster City, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuenciación se sometieron a electroforesis en un analizador genético ABI3100. Electroferogramas fueron analizados en ambas direcciones sentido y antisentido. Las secuencias obtenidas se compararon con la referencia
KRas
secuencia (GenBank DQ893829) y el
RAB30
secuencia (GenBank NM_014488).
Southern Blot
Etiquetada se hibridó el ADN genómico SW480 a las siguientes líneas celulares: SW480 (control positivo); NIH3T3 (control negativo), y un grupo de
K-ras
clones de células positivas derivadas de NIH3T3 expuestas a suero humano de un paciente con cáncer de colon. Diez g de alto peso molecular de ADN genómico de cada muestra de ADN fue digerido con
Hind III
(New England Biolabs). Los fragmentos de ADN se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8%, desnaturalizado, y se transfirieron a una membrana de nylon (Amersham). La hibridación se realizó en una solución del kit BM Quimioluminiscencia Blotting (Roche Applied Science) que contiene la sonda de ADN (100 ng /ml) durante 20 h a 42 ° C. Las transferencias se lavaron en condiciones de alta rigurosidad en 0,1 x SSC, 0,1% SDS durante 90 min a 65 ° C, se incubaron en estreptavidina durante 30 min a temperatura ambiente, colocado en Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Sciences), y se expusieron durante 60 seg.
SNP gama de hibridación de ADN y Análisis Copia Número
ADN de las células SW480 de los padres, el ADN aislado a partir de sobrenadante de células SW480, y el ADN genómico a partir de células SB1 (NIH3T3 transformadas por pasiva SW480 sobrenadante) se hibridó a la matriz de genotipificación 500K Affymetrix establecido para análisis del número de copias de ADN, siguiendo el protocolo de los fabricantes. El análisis se realizó a través de la tubería número de copias de ADN en el software Partek Genómica Suite. Todas las muestras se compararon con una línea de base del número de copias de ADN humano normal de referencia común.
Fish &
núcleos en interfase y metafase los cromosomas de las células NIH3T3 transfectadas (SB1) se analizaron en preparaciones citogenéticas convencionales, previamente se describe [35], con una secuencia consenso de repeticiones intercaladas humana. La sonda de ADN humano Cuna (que es el ADN de placenta que es predominantemente 50-300 pb de tamaño y enriquecido para las secuencias repetitivas de ADN, tales como
Alu
y
Kpn Buscar miembros de la familia) se marcó por desplazamiento de la mella con digoxigenina-11-dUTP (Roche) utilizando el DIG-Nick Translation Mix (Roche) y se detectó utilizando un anticuerpo antidigoxigenina conjugado a un fluorocromo. Un centenar de núcleos se observan al microscopio
FISH análisis de secciones histológicas de los tumores de colon de ratas se llevó a cabo de la siguiente manera:. Las secciones se deparaffinized en xileno y rehidratada en serie de etanol. Los portaobjetos se pre-trataron con 0,2 M HCl, tiocianato de sodio 8%, y 0,5% de pepsina. Después, rojo marcado con fluoresceína
ALU
humana (FISHBright, Kreatech Biotecnología) y verde-fluoresceína-
LINEA 1 | rata (FISHBright, Kreatech Biotecnología) se añadieron sondas al mismo tiempo; los portaobjetos cubiertos con cubreobjetos y se sellaron con cemento de goma. Las secciones se desnaturalizaron y se hibridaron en un Hybridizer (Life Technologies) a 37 ° C durante la noche. El cemento de caucho y los cubreobjetos se retiraron y las secciones se lavaron rigurosamente usando SSC: 2 x SSC durante 30 minutos a temperatura ambiente, 0,4 x SSC /0,3% de NP40 durante 5 min a 75 ° C, y 2 x SSC /0,1% de NP40 durante 4 min a temperatura ambiente. Los núcleos se contratiñeron con 4 ', 6'-diamino-2-fenilindol (DAPI) a una concentración de 0,1-g /ml en Antifade (Vector Laboratories). Los análisis se realizaron utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan (Zeiss) interconectado con el sistema CytoVision (Applied Imaging).
Resultados
Las células transformadas de ADN extracelular inmortalizada murinos asociados con la transferencia de ADN
sobrenadantes de cultivo celular de líneas celulares malignas humanas SW480 y HeLa (cultivadas en DMEM con 2% de FBS), así como suero de los tres pacientes de cáncer de colon sin tratar avanzada y dos controles sanos se despejaron de células viables y los residuos celulares por centrifugación y se de filtrado (filtro de 0,45-m). El ADN extraído de estas fuentes, (SW480 y HeLa sobrenadantes) fueron PCR positivos para el mutante humana
K-ras
en el codón 12 y
E6
y
E7 oncogenes
respectivamente. Las tres muestras de suero de pacientes de colon cáncer albergaban el
K-ras
mutación en el codón 12, que también fue probado en ADN extraído de sus tumores primarios incluidos en parafina. Estos materiales (sobrenadantes y suero de pacientes con cáncer de colon y controles sanos fueron PCR positiva para constitutiva humano
DHFR
y
ACTINA
genes (no mostrado). Concentraciones de ADN en suero en suero fueron 2,04, 0,66 y 0,93 g /ml para los pacientes y 0,28 y 0,178 g /ml para los individuos sanos. Los sobrenadantes de los cinco cultivos de células independientes de SW480 que fueron tomadas en la confluencia de células 80%, tenían una concentración media de 0,1875 ± 0,007 mg /ml. transfecciones "pasiva" con sobrenadantes o sueros se realizaron como sigue: 0,5 ml (suero o sobrenadante que contiene 1,815 g o 0,09 g, respectivamente) se añadieron a 0,5 ml de medio (relación 01:01) de receptores cultivaron células murinas inmortales NIH3T3 (que fueron probados murino por citogenética análisis y por la ausencia de repetitivo humano
Alu Yd6
por PCR, no se muestra) en placas de microtitulación de 24 pocillos. Medium más suero o sobrenadante se cambiaron al día durante 7 o 14 días (tiempo más corto para el suero debido a la cantidad limitada), de este modo, las células fueron expuestas a diario a 1.815 g de ADN contenida en el suero o a 0,09 g de ADN contenida en el ADN sobrenadante. Al día 8 o 15, el número de focos de transformación de receptores células NIH3T3 en plástico y la formación de colonias en agar fueron abrumadoramente superior tanto para el suero y el sobrenadante (en comparación con el control (células NIH3T3 expuestos a su propio sobrenadante y a suero normal). entre los clones transformados establecidos, 11 de 27 expuestos a SW480 y 5/9 (expuesta al suero del paciente con cáncer) tenía los
K-ras mutación
según lo probado por PCR utilizando cebadores específicos para amplificar humana
K-ras
. Del mismo modo, 8/24 clones expuestos a HeLa fueron PCR positivos para
E6
y
E7 oncogenes
VPH. Los ensayos de tumorogénesis en
nu /nu
ratones hembras mostró más grandes y los tumores de crecimiento más rápido de un grupo de clones "pasiva" transfectadas con sobrenadante de SW480 (piscina SB1) y suero de cáncer de colon (PCC) en comparación con las células SW480 parentales (+ CTR), con murinos NIH3T3 expuesto a suero normal (NS), así como con NIH3T3 parental (-Ctr) (Fig. 1 a, B). Estos resultados confirman las observaciones anteriores sobre la capacidad transformadora del sobrenadante de las células SW480, así como los de plasma de pacientes con cáncer [4], [5]. hibridación de Southern de estas piscinas transformadas NIH3T3 de clones (piscina SB1) en contra de ADN genómico a partir de células SW480 mostró señales de hibridación claras, lo que confirma la transferencia horizontal de ADN humano a las células receptoras murinos (Fig. 1 C). Además, el análisis FISH de células murinas transformadas pasivamente (SB1) emite señales positivas para secuencias humanas repetitivas (Fig. 1 D), lo que confirma que la transformación celular se asoció con la transferencia de ADN.
El crecimiento del tumor en ratones desnudos de " pasivamente "células transformadas. Más rápido y se observó un mayor crecimiento del tumor en la piscina SB1 y piscina CCPS (NIH3T3 expuesto a sobrenadante de las células SW480 y para el suero de un paciente con cáncer de colon, respectivamente). células SW480 se utilizaron como control positivo, mientras que NIH3T3 y NIH3T3 expuestos a suero normal mostraron esencialmente ningún crecimiento. imágenes B. representativos de los tumores en ratones de cada grupo. C. Sur de hibridación de transferencia de SB1 y los PCC piscinas de las células contra el ADN genómico de las células SW480. células SW480 carril son el control positivo y NIH3T3, el negativo. Una clara señal de hibridación sólo se observa en SB1 y los PCC carriles. D. FISH análisis de secuencias humanas repetitivas. control positivo es linfocitos humanos y células murinas control negativo. células SB1 muestra señal fuerte. El crecimiento del tumor E. es similar en NIH3T3 transfectadas de forma activa con el ADN genómico a partir de células SW480 (Neo-Geno) y activamente ADN transfectado extraída del sobrenadante de las células SW480 en comparación con ningún crecimiento en NIH3T3 (-Crt) y se transfectaron con el vector vacío-solamente . control positivo, células SW480.
Para demostrar que la capacidad de transformación del sobrenadante reside en el ADN, 5μg de ADN purificado a partir del sobrenadante SW480 fue co-transfectadas con un vector pNeo eucariota utilizando lipofectamina (activo transfección). Se establecieron clones genetecin resistente a múltiples. Un grupo de estos clones fue capaz de formar tumores en
nu /nu
ratones hembra (Fig. 1 E). Por el contrario, la transfección "pasiva" utilizando 5 g de ADN purificado (extraído a partir del sobrenadante de cultivo celular) y se añadió al día durante 14 días a las células NIH3T3) fue incapaz de transformar células NIH3T3 y también falló para transferir secuencias de ADN en las células receptoras (como se evaluó por PCR del mutante humana
K-ras
y
Alu Yd6
, que no se muestra).
ADN agota el sobrenadante no transforma células inmortalizadas murinos
se ha demostrado que el ADN libre de células circula como un complejo de ADN /ARN-lipoproteína (virtosome) que se libera espontáneamente por las células vivas [29] y este complejo podría proteger el ADN de ser degradado por nucleasas circulante. Para investigar esto, sobrenadante fresco de células SW480 se expuso a ADNasa I, de proteinasa K, y para ambos, y después se extrajo y se sometió a electroforesis el ADN. Los resultados mostraron que no ADNasa I para digerir el ADN completamente. Del mismo modo, la exposición de sobrenadante de proteinasa K ADN digerido solamente ligeramente. Higo. Higo. (Tabla 1). Higo.