Extracto
Propósito
ablación térmica por radiofrecuencia (RFA) de los tumores hepáticos y renales puede ir acompañada de la tumorigénesis no deseada en el tumor residual, sin tratar. A continuación, se estudió el uso de siRNA micela encapsulada para suprimir la IL-6 mediada por efectos secundarios locales y sistémicos de la RFA.
Métodos
Se comparó hepática o renal estandarizada RFA (laparotomía, 1 cm activa de punta a 70 ± 2 ° C durante 5 min) y la falsa procedimientos sin y con la administración de 150 nm nanopartícula micelar similar (MNP) anti-IL6 siRNA (conjugados DOPE-PEI, IP única dosis de 15 minutos después de la RFA, los ratones C57BL : 3.5 ug /100 ml, Fisher 344 ratas: 20 ug /200 ul), RFA /revueltos siRNA, y RFA /vacío micronutrientes en polvo. Las medidas de resultado incluyeron: la infiltración local periablational celular (α-SMA + células estrelladas), la proliferación de hepatocitos regional, suero /tejido niveles de VEGF IL-6 y en 6-72hr, y el crecimiento tumoral distante, la proliferación tumoral (Ki-67) y la densidad microvascular ( MVD, CD34) en los modelos de adenocarcinoma de mama subcutáneos R3230 y MATBIII a los 7 días.
resultados
en el hígado RFA, adyuvante MNP anti-IL-6 siRNA redujo los aumentos inducidos por la RFA en el tejido de IL-6 , α-SMA + infiltración de las células estrelladas, y la proliferación de hepatocitos regional a la línea base (p & lt; 0,04, todas las comparaciones). Por otra parte, adyuvante MNP anti-IL6- siRNA suprimido aumentó el crecimiento del tumor distante y Ki-67 observada en los tumores R3230 y MATBIII POST RFA hepática (p & lt; 0,01). Anti-IL6 siRNA también redujo la elevación inducida por VEGF en RFA y MVD tumor (p & lt; 0,01). Del mismo modo, renal inducida por el aumento RFA en IL-6 niveles séricos y crecimiento distante tumor R3230 fue suprimida con anti-IL6 siRNA (p & lt; 0,01).
Conclusiones
adyuvante siRNA de nanopartículas encapsuladas contra IL-6 se puede utilizar para modular los efectos locales y regionales de la RFA hepática para bloquear posibles efectos pro-oncogénicos no deseadas de la RFA hepática o renal en tumoral a distancia
Visto:. Ahmed M, G Kumar, Navarro G, Wang Y, Gourevitch S, Moussa MH, et al. (2015) Los medicamentos basados en nanopartículas sistémica ARNsi En combinación con la ablación por radiofrecuencia para el tratamiento del cáncer. PLoS ONE 10 (7): e0128910. doi: 10.1371 /journal.pone.0128910
Editor: Yi-Hsiang Huang, Universidad Nacional Yang-Ming, TAIWAN
Recibido: 19 Marzo, 2015; Aceptado: 1 de mayo de 2015; Publicado: 8 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Ahmed et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del manuscrito
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del cáncer (CCNE 1U54CA151881-01 VPT, SNG, MA, TL), la Sociedad Radiológica de América del Norte Fundación de Investigación y Educación (RSD1215, MA), Harvard Faculty Physicians Fundación Facultad de Medicina Radiología (MA), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SF8841, EG), el Centro israelí de Excelencia I-CORE (EG), y la Fundación de Ciencias de Israel (EG, SNG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ha habido mucho interés reciente en el uso de ARN de interferencia ( "silenciamiento génico post-transcripcional ') y, en particular pequeños RNAs de interferencia (siRNA) en terapias contra el cáncer. Esto ha centrado en gran medida en cualquiera de modulación de las respuestas de proteína celular para mejorar la eficacia de farmacológico primario /terapias oncológicas [1,2], aumentando la inmunidad anti-tumor a través de la precipitación selectiva de la respuesta inmune supresión de proteínas, o quimio-sensibilización a través de silenciamiento de genes de receptores de factores de crecimiento [3-6]. Para superar las limitaciones en la entrega con siRNA libre en
in vivo
sistemas, siRNAs se han administrado comúnmente usando vehículos de nanopartículas (tales como liposomas, micelas, o unido a partículas) para maximizar esencialmente
pasiva
tejido entrega (aunque en concentraciones más altas) para órganos primarios y tumores diana [7-11]. Sin embargo, incluso con la ayuda de la entrega nanotransportador, desafíos para la administración de fármacos intra-tumoral y dirigida persisten [1,3]. Además, algunos estudios han utilizado adyuvante siRNA en conjunción con los paradigmas no farmacológicos, tales como la modulación de tejido o respuestas fisiológicas después de cirugía, intervencionista, o los tratamientos de radiación.
ablación de tejido guiada por imagen térmica utilizando radiofrecuencia, microondas, o la energía láser para crear alta temperatura local (60-100 ° C) de calentamiento alrededor de un aplicador de uso percutáneo es ahora de uso clínico generalizado para tratar tumores focales de hígado, pulmón, riñón y hueso (& gt; 100.000 casos /año en todo el mundo) [ ,,,0],12]. El éxito de la ablación completa del tumor también requiere la inclusión de un 5-10 mm del borde del parénquima normal como un "margen de ablación 'para garantizar la erradicación completa del tumor [13]. En un intento de asegurar la finalización del tratamiento, hemos demostrado que la administración de incluso una sola dosis de la quimioterapia de nanopartículas cargada de fármaco al mismo tiempo que la ablación por RF puede conducir a aumentos en la administración de fármacos periablational local (hasta 10 veces), con el consiguiente aumento la destrucción del tumor, aumento de la supervivencia de los animales de punto final, y una mayor cantidad de la destrucción del tumor en pacientes con tumores hepáticos [14-16]. Recientemente hemos aprovechado más éxito esta entrega focal mejorado para orientar respuestas tisulares inducidos por la RFA específicos (como el aumento de intercalación de ADN o suprimir la producción de HSP) [16,17].
Una serie de estudios han demostrado que la sub calentamiento del tejido inferior letal (40-47 ° C) alrededor de la zona de ablación incita múltiples reacciones secundarias de tejidos [18], incluyendo el aumento de citoquinas inflamatorias (tales como IL-6 e IL-10) [19] y el factor de crecimiento (tales como HGF, HIF-1α, y VEGF) [20-22] de producción; infiltración de depurador y las células inmunogénicas en el tejido periablational [23]; y la hipertermia inducida por los aumentos en la permeabilidad vascular y la permeabilidad endotelial [24]. En particular, los estudios recientes han demostrado que el aumento de suero de la producción de interleucina-6 después de la ablación térmica de hígado normal (simulando el criterio de valoración clínica de la ablación de todo el tumor en el hígado y su "margen de ablación 'de hígado circundante normal) es un motor clave de la infiltración periablational de células inflamatorias e inmunogénicas tales como macrófagos y actina muscular (SMA) las células a-liso positivos hepáticas estrelladas [23,25]. Estos, a su vez, pueden producir la activación adicional de las vías a favor del crecimiento aguas abajo tales como citoquinas en la vía /c-Met de HGF, y el aumento de la proliferación de hepatocitos en el hígado-procesos no tratados que se reducen notablemente en IL-6 ratones knockout [25]. Dado que el éxito de la ablación completa del tumor también requiere la inclusión de un 5-10 mm del borde del parénquima normal como un "margen de ablación 'para garantizar la erradicación completa del tumor [13], el estudio de estos efectos secundarios sistémicos de la ablación por radiofrecuencia en el tejido normal de los órganos es imprescindible . La necesidad de un mayor estudio es apoyado por la reciente estudios que demuestran experimental, 'desviado' estimulación del crecimiento tumoral a distancia después de la ablación térmica de tejido del hígado y los riñones, y los estudios clínicos que sugieren una mayor incidencia de la nueva CHC después de la ablación RF hepática (se acerca a 80 % a los 5 años) en comparación con los pacientes tratados con comparativos de las Naciones Unidas cirróticos (22-50%) [26-29]. Aquí, nos basamos en nuestra experiencia anterior con la administración de fármacos de nanopartículas mediada preferentemente dirigido a la llanta periablational para estudiar si poliméricos nanopartículas de micelas como (MNPs) cargadas con anti-IL6 siRNA pueden usarse para suprimir la producción térmica de ablación inducida por IL-6 , IL-6 mediada por infiltración periablational celular, la proliferación de hepatocitos en el hígado no se trata, y RF aguas abajo estimulación ablación inducida mediada por IL-6 del crecimiento tumoral distante.
Materiales y Métodos
declaración Ética
Todos los estudios con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Ética de la Facultad de Medicina Beth Israel Deaconess Medical Center Institucional Cuidado de animales y el empleo y la Universidad hebrea Hadassah Cuidado de animales institucional. modelos
animales
Para todos los experimentos y procedimientos, se indujo la anestesia con una inyección IP de una mezcla de ketamina (50 mg /kg, Ketaject; Phoenix Farmacéutica, St. Joseph, MO) y xilazina (5 mg /kg, Bayer, Shawnee Mission, KANSAS). Los animales fueron sacrificados con una sobredosis de dióxido de carbono utilizando SMARTBOX CO
2 Sistema de Cámara (sistemas EZ, Palmer, PA) seguidos por punción cardíaca.
Los experimentos se realizaron en ratones C57BL normales (40 ± 10 g), o dos líneas celulares de adenocarcinoma de mama (R3230) o MATBIII implantaron subcutáneamente en ratas Fisher 344 hembra (150 ± 20 g; 14-16 semanas de edad, Charles River, Wilmington, MA) [30]. La línea tumoral de adenocarcinoma de mama R3230 es una línea bien caracterizado que hemos estado utilizando durante más de 10 años [30]. La línea de tumor MATBIII se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). implantación, evaluación y técnicas de preparación de los tumores se realizaron como se describe anteriormente [30]. En pocas palabras, un tumor se implantó en cada animal mediante la inyección lentamente 0,3-0,4 ml de suspensión de tumor en la almohadilla de grasa mamaria de cada animal a través de una aguja de calibre 18. Los tumores se midieron cada 1-2D hasta que llegaron a 6-7 mm momento en el que se incluyeron en los estudios.
Aplicación de la ablación por radiofrecuencia
Convencional monopolar RFA se aplicó mediante el uso de una 500 kHz generador de RFA (modelo 3E; Radionics, Burlington, MA), como se ha descrito anteriormente [30]. En pocas palabras, el órgano diana se expone a través de laparotomía usando un subcostal (hígado) o incisión lateral (riñón) en condiciones estériles, mientras que el animal fue anestesiado. La punta de 1 cm de calibre 21 aislado eléctricamente del electrodo (SMK electrodo; Cosman Medical Inc, Burlington, MA) se colocó en el hígado o el riñón. Para los animales tratados con ablación térmica, se aplicó energía de RF durante 5 minutos con la salida del generador titulada para mantener una temperatura de la punta designada (70 ± 2 ° C). Este método estandarizado de la aplicación de RF se ha demostrado previamente para proporcionar volúmenes de coagulación reproducibles con el uso de este sistema RFA convencional [30,31]. Para completar el circuito de RF, el animal se colocó en una almohadilla de tierra metálico estandarizado (Radiónica). Para los animales tratados con tratamiento simulado o un agente solo, se colocó el electrodo, pero no se administró energía.
nanopartículas siRNA formulación
Todos los materiales se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario. polietilenimina ramificada (PEI) con un peso molecular de 1,8 kDa se adquirió de Polysciences, Inc (Warrington, PA). 1,2-disrearoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietilenglicol) -2.000] (PEG-PE 2 kDa) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- (glutaril ) (glutaril-PE) se adquirieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). agua libre de nucleasa fue adquirido de Qiagen (Germantown, MD). Todos los dúplex de siRNA son de Dharmacon (Lafayette, CO). Las secuencias sintetizadas de siRNA dirigidos IL-6 fueron: 5'-AGUCGGAGGCUUAAUUACAdTdT-3 '(sentido), 5' CAGGAAAUUUGCCUAUUGAdTdT-3 '(sentido) y 5'-UAAGGACCAAGACCAUCCAdTdT-3' (sentido) [32,33]. Un siRNA scramble se utilizó como control negativo. La secuencia de control no siRNA dirigidos fue 5'-AGUACUGCUUACGAUACGGdTdT-3 '(sentido) [34].
nanopartículas de micelas como se seleccionaron como el vehículo de reparto basada en el trabajo previo que demuestra dinámica de suministro temporales beneficiosos (6 -12hr) y una mayor penetración intersticial en tejidos que rodean la zona de ablación [35]. Hemos construido nanopartículas de tipo micela (MNPS) basados en fosfolípidos conjugados de polietilenimina modificada (DOPE-PEI). El conjugado DOPE-PEI y los complejos DOPE-PEI /siRNA se prepararon como se describe anteriormente [34]. Hemos demostrado anteriormente que los conjugados de DOPE-PEI sobre la base de bajo peso molecular PEI auto-ensamblado dentro de las estructuras micelares que se condensaron siRNA, mostró una alta eficacia de transfección y tenía un perfil de toxicidad mejor que PEI de 25 kDa y Lipofectamine (ADN utilizado comúnmente /siRNA reactivos de transfección) [11]. Incorporamos PEG-PE en las portadoras para lograr un mejor rendimiento
in vivo
. Las interacciones hidrofóbicas entre los restos lipídicos en DOPE-PEI y los de PEG-PE dieron lugar a su autoensamblaje en partículas de tipo micela con un tamaño medio de 150 nm y proporcionan una cierta estabilización estérica de los complejos mediante la formación de una barrera de protección y promoción de una mayor la estabilidad
in vivo
. Los complejos /siRNA DOPE-PEI se prepararon mezclando volúmenes iguales de DOPE-PEI con siRNA-IL-6 (piscina equimolar de 3 secuencias) o scramble siRNA a una relación a /p definitiva N de 16. La solución de siRNA se transfirió a la solución de polímero, se mezcla mediante pipeteo vigoroso y se incubaron durante 15 min. La relación de polímero /siRNA se expresó como el nitrógeno /fosfato (N /P), y se calcula suponiendo que 43 g /mol corresponde a cada unidad de repetición de PEI que contiene una amina y 316 g /mol corresponde a cada unidad de repetición de siRNA que contiene un fosfato. Entonces, una película de lípido previamente secado por congelación de PEG-PE se hidrató con los complejos y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 h con agitación intermitente El PEG-PE2kDa: relación de peso DOPE-PEI era de 2: 1 [36]. formulaciones vacíos se prepararon mediante la hidratación de la película con la solución de polímero solamente. Cada ratón recibió una dosis de 3,5 g de ARNsi en un volumen de formulación final de 100 mL. Cada rata recibió una dosis de 20 g de ARNsi en un volumen de formulación final de 200 mL. Cada dosis se administró por inyección intraperitoneal (IP) en puntos de tiempo seleccionados tal como se especifica anteriormente.
cosecha Tumor
Los animales se sacrificaron en momentos específicos descritos anteriormente usando la eutanasia dióxido de carbono. Se recogió el tejido diana (sitio primario de la ablación, lóbulo hepático no se trata, o tumor distante), y se seccionó perpendicularmente a la dirección de inserción del electrodo [17,30]. tumores distantes también se cosecharon y se seccionaron. Todas las muestras se fijaron en formalina al 10% durante la noche a 4 ° C, se incluyeron en parafina, y se seccionaron a un espesor de 5 micras. Los tejidos fueron teñidas con H & amp;. E para la patología macroscópica
La cuantificación de los niveles de IL-6 y VEGF
El suero y los niveles tisulares de IL-6 (ratón /rata y el kit de M6000B /R6000B Quantikine, R & amp; D Systems Inc., Minneapolis, MN) y el kit de VEGF (Rat /RRV00 Quantikine, R & amp; D Systems) se determinaron usando una enzima ensayo de inmunoabsorción ligado kit (ELISA) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, el tejido hepático de flash-congelado se homogeneizó en un tampón de lisis frío (Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA) que consiste en un inhibidor de proteinasa 0,1% (Sigma-Aldrich). Los homogeneizados se centrifugaron a 14.000 rpm durante 20 min a 4 ° C, y se determinó la concentración de proteína total usando un método de bichinchoninic ácido (BCA) (Sigma-Aldrich). Se utilizó suero sin diluir. valores de IL6 y de VEGF se normalizaron luego a concentración de proteína. Todas las muestras y los patrones se midieron por duplicado, y el valor medio se registró como pg por ml [37,38].
tinción inmunohistoquímica
inmunohistoquímica
Las secciones de tejido extirpado tumores distantes y se prepararon y tinción se realizó para los siguientes marcadores: α-SMA (células estrelladas hepáticas en el borde periablational), CDC-47 (proliferación de hepatocitos, hígado no tratado) (se ha descrito previamente (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) [17,23] ), Ki-67 (AB-16667 Abcam, Cambridge, MA) (proliferación de células tumorales en el tumor distante), y CD34 (densidad microvascular en tumores distantes) (AF4117 R & amp; D Systems, Minneapolis, MN). portaobjetos fueron imágenes y analizados utilizando un microscopio de Micromaster I (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) y Micron Imaging Software (Westover Scientific, Inc., Molino griego, WA). Cinco campos de alta potencia al azar fueron analizados durante un mínimo de 3 muestras para cada parámetro y se puntuaron de forma ciega para eliminar el sesgo de observador [16,17]. Como un control adicional para asegurar la uniformidad de la tinción, cuando se hicieron comparaciones directas, IHC se repitió con todas las diapositivas de comparación pertinentes teñidas al mismo tiempo.
Análisis estadístico
El SPSS 13,0 paquete de software ( SPSS Inc., Chicago, IL) fue utilizado para el análisis estadístico. Todos los datos se proporcionan como media más o menos SD. Seleccionada (día 0 y en el momento del sacrificio) tamaños tumorales significar, y la cuantificación de inmunohistoquímica se compararon mediante análisis de varianza (ANOVA). El análisis post-hoc adicional se realizó con la prueba t pareada, dos colas de Student, si y sólo si, el análisis de varianza alcanza significación estadística. Un
valor de P Red de menos de 0,05 fue considerado significativo. curvas de crecimiento del tumor después del tratamiento se analizaron mediante la caracterización de bondad de ajuste. La media de post-tratamiento pendientes de las curvas de crecimiento más o menos SD también se calcularon y compararon mediante ANOVA y emparejados, T-pruebas de dos colas.
Resultados
nanopartículas anti-IL-6 siRNA bloques periablational local y intrahepática efectos distantes regionales de ablación térmica
se realizaron estudios de ablación RF hepática iniciales en ratones normales C57BL usando protocolos estandarizados para permitir la comparación con estudios anteriores en ratones knockout normales e IL-6 [25]. Los siguientes 6 grupos de tratamiento se compararon (n = 5-6 animales /brazo): hepática de ablación térmica RF solo (laparotomía y RF solicitud de 5 min, temperatura de la punta titularon a 70 ± 2 ° C), procedimiento simulado (laparotomía y colocación de la aguja sin calentamiento), RFA /MNP anti-IL-6 siRNA (dosis única de 3,5 mg siRNA dado IP, 15 minutos después de la ablación), RFA /MNP revueltos siRNA, MNP anti-IL-6 siRNA solo, RFA /vehículo vacío. La ablación RF hepática aumento del tejido periablational IL-6 niveles locales en comparación con el procedimiento simulado a 12 horas después del tratamiento (1.463 ± 108pg /ml frente a 1.061 ± 45pg /ml, p = 0,004, figura 1A). MNP adyuvante anti-IL-6 siRNA dado con la RFA hepática reducida del tejido local de IL-6 niveles (1.139 ± 159pg /ml; p = 0,04 vs RFA solo, p = 0,46 vs. tratamiento simulado). Hepática RFA /MNP revueltos siRNA aumento del tejido local de IL-6 niveles (1.924 ± 141pg /ml; p & lt; 0,001 vs. tratamiento simulado, p = 0,01 vs. RFA solo, p = & lt; 0,001 vs. RFA /anti-IL6 siRNA). Tejido de IL-6 después de MNP anti-IL-6 siRNA con el tratamiento simulado fue 1.110 ± 42pg /ml, y después de la ARF /vehículo vacío fue 1.783 ± 125pg /ml.
(A) Hígado ELISA cuantificación de IL-6 niveles de 12 horas después del tratamiento (media ± desviación estándar). ratones C57BL fueron aleatorizados para recibir tratamiento simulado, la ablación por radiofrecuencia de hígado, hígado RFA /IP MNP anti-IL-6 siRNA, MNP anti-IL-6 siRNA solo, RFA /MNP revueltos siRNA, o RFA /vehículo vacío (n = 5-6 por grupo) . Liver RFA aumentó locales de hígado de 12 horas de IL-6 (1463 ± 108 pg /ml) que fue suprimida con adyuvante IP MNP anti-IL6 siRNA (1139 ± 159 pg /ml, p = 0,04). Además, adyuvante MNP anti-IL6 siRNA dado 15 minutos después de la ablación térmica hepática (D, E) en ratones C57BL suprime la infiltración periablational de miofibroblastos α-SMA positivos en comparación con la ablación térmica hepática sola (B) o RFA combinado con revueltos siRNA (C) (F, con una media ± desviación, p & lt estándar; 0,01) guía empresas
Como se informó anteriormente [23], estandarizada TARF de hígado normal dio lugar a la infiltración de la llanta periablational por α-SMA-positivas activado. miofibroblastos (también conocidas como células estrelladas hepáticas, un marcador sustituto para el complejo de la infiltración celular periablational que se produce después de la ablación térmica) a los 4 días después del tratamiento (60,1 ± 26,3% de células positivas /hPF dentro de la llanta, la figura 1B-1E). Adyuvante MNP anti-IL-6 siRNA redujo significativamente la infiltración celular periablational positivo α-SMA en comparación con otros grupos de tratamiento (31,7 ± 14,3% positivas células /HPF vs RF solo:; 60,1 ± 26,3% RF siRNA /revueltos: 72,9 ± 33,0%; p & lt ; 0,001; Fig 1F). Tanto el procedimiento simulado solo o combinado con MNP anti-IL-6 siRNA solos no dieron lugar a ningún aumento en u otros cambios a periablational infiltración celular.
adyuvante MNP anti-IL-6 siRNA también tuvo efectos a nivel de órganos después hepática térmica ablación. Como se muestra por Rozenblum et al [25], la ablación térmica de un lóbulo del hígado aumentó la proliferación de hepatocitos en el lóbulo hepático distante, no se trata, como se mide por tinción con CDC47 (un marcador de las células que entran en la fase G1 de la replicación celular) (42,016. 2% de células positivas /HPF, Fig 2). MNP anti-IL6 siRNA redujo la cantidad de proliferación de los hepatocitos del hígado en comparación con la ablación térmica por sí sola (23,0 ± 10,7% /hpf vs. 42.016.2% /hpf, p & lt; 0,001). No se observaron diferencias en la proliferación de hepatocitos en un lóbulo hepático distante, sin tratamiento durante RFA /MNP revueltos siRNA (28,1 ± 16,7% /HPF) en comparación con la ablación por RF solo (p = 0,12) o RFA /MNP anti-IL6 siRNA (p = 0,15 ) [figura 2A-2D].
adyuvante MNP anti-IL-6 siRNA dado 15 minutos después de la ablación térmica hepática (C) en ratones C57Bl (n = 5-6 animales /brazo) suprimió la proliferación de hepatocitos en el lejano, lóbulo hepático no tratado (con la tinción de CDC47, media ± desviación estándar) en comparación con la ablación térmica hepática sola (a, D, p & lt; 0,01). La ablación térmica hepática combinada con MNP revueltos siRNA no fue significativamente diferente de la ablación térmica por sí sola o en combinación con la ablación MNP anti-IL-6 siRNA (B, D).
Nanopartículas anti-IL-6 siRNA suprime térmica ablation- inducida por la estimulación del crecimiento de tumores distantes R3230 y el suero de IL-6 niveles después de la ablación RF del parénquima hepático normal
para determinar el impacto en el crecimiento tumoral a distancia para simular la condición común de metástasis a distancia, se utilizó un modelo de tumor de mama subcutánea (R3230) en la que hepática ablación RF se ha asociado con el crecimiento del tumor distante [26]. A continuación, se compararon los siguientes grupos de tratamiento (n = 6-7 animales /brazo): hepática TARF solo, procedimiento simulado, RFA /MNP anti-IL-6 siRNA (20 mcg de siRNA, entrega IP), RFA /MNP revueltos siRNA , MNP anti-IL-6 siRNA solo, RFA /vehículo vacío. Se evaluó el efecto de estos seis grupos de tratamiento sobre el crecimiento del tumor subcutáneo distante. Todos los tumores crecieron a la misma velocidad sobre 5d antes de la aleatorización a diversos grupos de tratamiento. La ablación térmica de hígado normal aumentó el crecimiento distante tumor R3230 para 7d después del tratamiento en comparación con el tratamiento simulado /control (p & lt; 0,001; Fig 3A, Tabla 1). Adyuvante MNP anti-IL6 siRNA suprime los efectos de ablación inducida térmica sobre el crecimiento distante tumor R3230 tal que el tamaño medio del tumor en 7d con la terapia de combinación fue más baja que o bien el tratamiento simulado (no ablación) y hepáticas grupos solos RFA (p = 0,02 vs . sham, p & lt; 0,001 vs. RFA hepática solo; Fig 3A, Tabla 1). La ablación RF hepática combinada con MNP revueltos siRNA dado lugar a que el diámetro tumoral a distancia más grande a 7d en comparación con todos los demás grupos de tratamiento (19,3 ± 1,7 mm, p & lt; 0,03 para todas las comparaciones).
tumores (A) R3230 implantados subcutánea en ratas Fisher 344 con tasas de crecimiento similares fueron asignados al azar en el Día 0 a uno de los seis diferentes grupos de tratamiento (n = 6-7 animales /brazo). Hepática ablación térmica solo o combinado con cualquiera de portador vacío o MNP revueltos siRNA resultó en significativamente mayor de crecimiento del tumor y el cambio de diámetro (5d antes a 7d después del tratamiento) en comparación con el tratamiento simulado (p & lt; 0,01 para todas las comparaciones, media ± desviación estándar para todos números presentados). Adyuvante MNP anti-IL6 siRNA en combinación con la ablación térmica como resultado de la tasa de crecimiento del tumor distante y el diámetro final que fue el más bajo de todos los grupos de tratamiento (P & lt; 0,01 para todas las comparaciones). (B) adyuvante MNP anti-IL6 siRNA combina con la proliferación tumoral distante ablación térmica hepática también reducida (Ki-67) con el tratamiento simulado niveles en comparación con la ablación térmica hepática solo o combinado con el portador vacío o MNP revueltos siRNA (p & lt; 0,01 para comparaciones relevantes) . (C) hepática ablación térmica solo o con MNP revueltos siRNA aumento en suero de IL-6 en los niveles de 6 horas en comparación con el procedimiento simulado (n = 3-4 animales /brazo, p & lt; 0,02). Este efecto se suprimió con adyuvante MNP anti-IL6 siRNA (p = 0,03 vs. hígado RF solo). (D) Comparación del efecto de ARNsi de temporización administración mostró que adyuvante MNP anti-IL6 siRNA administró en el día 0 como resultado el diámetro más baja tasa de crecimiento del tumor después del tratamiento y el punto final (n = 3-4 animales /brazo, p & lt; 0,05 para todas las comparaciones). Adyuvante MNP anti-IL6 siRNA administrado 3d post-ablación reduce el diámetro de punto final en comparación con la ablación hepática solo, pero aún era significativamente mayor que, o bien tratamiento simulado o 0-día tratamiento combinado (p & lt; 0,05 para todas las comparaciones)
.
tumor índice de proliferación (Ki-67) en el tumor subcutáneo distante R3230 se midió para todos los grupos de tratamiento [figura 3B, Tabla 1]. ablación térmica hepática aumento de la proliferación del tumor distante en 7d en comparación con el procedimiento simulado (p = 0,001). Combinación adyuvante MNP anti-IL6 siRNA y la ablación térmica hepática reducen significativamente la proliferación de tumor distante (p = 0,045 vs. tratamiento simulado, p & lt; 0,001 vs. RFA hepática solo). ablación térmica combinada con portador vacío o MNP revueltos siRNA resultó en un aumento prolilferation tumor distante (p & lt; 0,04 en comparación con el tratamiento simulado). No hubo diferencias entre el tratamiento simulado y MNP anti-IL-6 siRNA solos brazos (p = 0,59).
A continuación, suero de IL-6 fueron cuantificados por ELISA a 6 horas después del tratamiento para cada uno de los seis brazos (n = 3-4 animales /brazo) para determinar el efecto del adyuvante MNP anti-IL-6 siRNA en los niveles de IL-6 inducida por ablación sistémicos. Se seleccionó este punto en el tiempo como en suero de IL-6 niveles alcanzaron un máximo de 6 horas en este RFA modelo post-hepática. Séricos de IL-6 se incrementaron después de la ablación hepática térmica (266 ± 9PG /ml) en comparación con el tratamiento simulado (199 ± 18pg /ml, p = 0,005) [Figura 3C]. La adición de MNP anti-IL6 siRNA redujo los niveles de IL6 suero a 6 horas (229 ± 16pg /ml) en comparación con RFA solo (p = 0,03) o RFA /MNP revueltos siRNA (298 ± 18pg /ml, p = 0,02). RFA /vehículo vacío también aumentó los niveles de IL6 sérica a 6 horas similar a la RFA solo (298 ± 18pg /ml, p = 0,57).
Finalmente, se comparó el tiempo de administración de siRNA y MNP anti-IL-6 siRNA administrarse inmediatamente después de RFA hepática (Día 0) dio como resultado la supresión completa del crecimiento tumoral inducida por RFA comparación con la administración en un punto de tiempo más tarde (3d) después de RFA hepática (Día 0 frente a día 3, p & lt; 0,02) [Fig 3D, Tabla 1] . Del mismo modo, para la RFA hepática /nano anti-IL-6 siRNA en el Día 0, el índice de proliferación tumoral en 7d fue significativamente menor en comparación con la administración Día 3 (p = 0,001).
Nanopartículas anti-IL-6 siRNA suprime la ablación hepática inducida por el crecimiento tumoral a distancia mediante la reducción de VEGF mediada por la angiogénesis tumoral
Periablational hígado niveles tisulares de VEGF se incrementaron después de la ablación térmica, alcanzando un máximo de 72hr. En este caso, los niveles de VEGF tejido en el borde periablational se compararon mediante ELISA a 72hr después del tratamiento de las siguientes armas: hepática TARF solo, procedimiento simulado, RFA /MNP anti-IL-6 siRNA (20 g de siRNA, entrega IP), RFA /MNP revueltos siRNA, MNP anti-IL-6 siRNA solo, RFA /vehículo vacío (n = 3-4 animales /brazo). ablación hepática aumento de los niveles de VEGF tejido periablational en comparación con el tratamiento simulado en 72hr (2359 ± 233pg /ml vs. 1,429 ± 83pg /ml, p = 0,002) [Fig 4A]. Adyuvante MNP anti-IL6 siRNA redujo los niveles de VEGF de hígado después de la ablación térmica (1,799 ± 71pg /ml, p = 0,02 frente a la ablación). ablación hepática combinado con adyuvante revueltos siRNA llevó a niveles de VEGF hígado similares en comparación con RFA solo (2,229 ± 42pg /ml; vs. RFA solo: p = 0,51; vs. tratamiento simulado: p = 0,001). No se observaron diferencias para la ablación térmica combinada con el vehículo vacío en comparación con otros grupos de tratamiento (1,804 ± 370pg /ml; vs. RFA solo: p = 0,09; vs. tratamiento simulado: p = 0,16). MNP anti-IL-6 siRNA solo no tuvo mayores niveles de VEGF tejido hepático en comparación con el tratamiento simulado (2234 ± 195pg /ml, p = 0,002).
(A) los niveles tisulares de VEGF (eje Y
2, oscuro columnas grises) en el tejido que rodea periablational la zona de ablación se cuantificaron en 72hr después de diferentes tratamientos (media ± desviación estándar, n = 3-4 animales /brazo). Hepática ablación térmica aumento de los niveles de VEGF periablational, que después se suprimió con adyuvante MNP anti-IL6 siRNA (p & lt; 0,05 para todas las comparaciones). (BE) Del mismo modo, la ablación térmica hepática provocó un aumento de la densidad microvascular /angiogénesis (inmunohistoquímica para CD34, A: eje
1, columnas de color gris claro) en el tumor R3230 subcutánea distante que también fue suprimida con adyuvante anti-IL-6 siRNA ( n = 6-7 animales /brazo).
densidad microvascular (mediante la tinción de CD34) se comparó en los tumores subcutáneos distantes para cada uno de los seis grupos de tratamiento después del tratamiento 7d [figura 4B-4E , Tabla 1]. ablación térmica hepática aumentó distante densidad microvascular tumoral en 7d en comparación con el procedimiento simulado (p = 0,003). Combinación adyuvante MNP anti-IL6 siRNA y la ablación térmica hepática reducen significativamente la densidad microvascular distante del tumor (p = 0,01 vs. RFA hepática solo). ablación térmica combina con portador vacío o revueltos siRNA resultó en aumento de la densidad microvascular tumoral distante (p & lt; 0,003 en comparación con el tratamiento simulado). No hubo diferencias entre el tratamiento simulado y MNP anti-IL6 siRNA solos brazos (p = 0,46). Estos hallazgos sugieren que el bloqueo del crecimiento del tumor distante ablación inducida por adyuvante hepática anti-IL6 siRNA está mediada por la supresión de la producción de VEGF aguas abajo y la angiogénesis tumoral distante.
nanopartículas anti-IL6 siRNA suprime el crecimiento tumoral distante después de la ablación RF en un segundo sitio primario de órganos (riñón normal)
Para los estudios de crecimiento tumoral, riñón RF de ablación térmica por sí sola, procedimiento simulado, RFA /MNP anti-IL-6 siRNA (20 g de siRNA, entrega IP) y anti-MNP IL6 siRNA solo se compararon (n = 6-7 animales /brazo). Del mismo modo, la ablación por radiofrecuencia de riñón normal aumentó el crecimiento tumoral distante R3230 en comparación con el tratamiento simulado, que también fue reprimida con una sola dosis de adyuvante MNP anti-IL-6 siRNA (determinado en el Día 0) [figura 5A, Tabla 1]. Tumor índice de proliferación y la densidad microvascular para la combinación de nanopartículas anti-IL6 y los brazos simulados fueron equivalentes entre sí y menor en comparación con el grupo tratado con la ablación RF de riñón normal solo [Fig 5B, Tabla 1].
(A tumores subcutáneos) R3230 implantados en ratas Fisher 344 con tasas de crecimiento similares fueron asignados al azar en el Día 0 a uno de cuatro grupos de tratamiento diferentes (n = 6-7 animales /brazo). La ablación térmica de riñón normal solo resultó en significativamente mayor de crecimiento del tumor y el cambio de diámetro (5d antes a 7d después del tratamiento) en comparación con el tratamiento simulado o MNP anti-IL6 siRNA sola (p & lt; 0,01 para todas las comparaciones, media ± desviación estándar para todos los datos ). MNP anti-IL6 siRNA combina con la tasa de crecimiento del tumor distante ablación térmica reducida y el diámetro de punto final a los niveles de línea de base simulada. (B) adyuvante MNP anti-IL6 siRNA combina con riñón ablación térmica también redujo la proliferación tumoral distante (Ki-67) y microvascular densidad (CD34) a los niveles de línea de base en comparación con el riñón de ablación térmica por sí sola (p & lt; 0,01 para comparaciones relevantes).