Extracto
Los microARN (miARN) importante para la expresión de genes postranscripcional están implicados en la iniciación y progresión del cáncer humano. En este estudio, se informó de que
miR-26a
estaba sobreexpresado en muestras de EOC humanos y el nivel de expresión extracelular
miR-26a
en el plasma puede distinguir a los pacientes de los controles sanos en la EOC. La expresión ectópica de
miR-26a Hoteles en células de cáncer de ovario (CO) aumento de la proliferación celular y la formación de clones. Este efecto promotor del crecimiento del crecimiento celular OC fue mediada por
miR-26a
inhibición de la posttranscription de ER-α. Además, la inhibición de
miR-26a
suprime la formación de tumores generados por la inyección de células de OC en ratones desnudos. Nuestros resultados sugieren que expresa de forma aberrante
miR-26a
puede contribuir al desarrollo OC
Visto:. Shen W, Song M, Liu J, G Qiu, Li T, Hu Y, et al. (2014)
miR-26a
Promueve la proliferación del cáncer de ovario y la tumorigénesis. PLoS ONE 9 (1): e86871. doi: 10.1371 /journal.pone.0086871
Editor: P. Jin Cheng, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Junio, 2013; Aceptado: 16 de diciembre de 2013; Publicado: 22 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Shen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue patrocinado por las subvenciones del Proyecto No. 30571836 del NNSF (Fundación Nacional de Ciencias Naturales) de China. Además, el trabajo presentado forma parte de los proyectos con Proyecto No.L2010681 apoyados financieramente por la Fundación de Ciencias del Departamento de la provincia de Liaoning de China, y el Proyecto de Educación No.201202259 el apoyo financiero de la Fundación de Ciencias de Ciencia y Tecnología Oficina de la provincia de Liaoning China . Autor Min canción contribuyó a la concepción y el diseño experimental, la orientación y la discusión del proyecto, por lo que es el co-autor de correspondencia de este trabajo. Todas las otras fuentes de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
OC es el quinto cáncer más común en las mujeres y la principal causa de muerte por cáncer de malignidad ginecológica en los países occidentales [1]. En el año 2012, hay 22.280 nuevos casos y 15.500 muertes por CO en los Estados Unidos de acuerdo con las estadísticas nacionales de cáncer. EOC representa el 85% -90% de cáncer de ovario. Por desgracia, el pronóstico global es pobre y los eventos moleculares que conducen al desarrollo de esta enfermedad son aún poco conocida.
MiRNAs representan una gran familia de los ARN no codificantes endógenos y posttranscriptionally regulan la expresión de genes [2]. Estudios recientes han puesto de manifiesto las funciones críticas de miRNAs en los procesos esenciales, incluyendo la proliferación, diferenciación y muerte celular [3]. alteraciones en la expresión o mutación de miRNAs se ha informado en el cáncer, como el cáncer de pulmón, cáncer de mama, leucemia y otros carcinomas [4]. En las células de cáncer de pulmón, la sobre-expresión de
let-7
inhibe su crecimiento por la orientación de Ras [5], [6]. Por otra parte,
miR-21 de
se dirige directamente a la supresor de tumores PTEN en el cáncer hepatocelular [7]. Por otra parte, varios estudios mostraron que los miRNAs pueden funcionar como supresores de tumores (como es el caso de la
miR-15a-miR-16-1
clúster [8]) o de oncogenes (como es el caso de
miR-21
[
9
]).
de todo el genoma de perfiles de expresión de los genes miARN mostró
miR-26a
desregulación en diversos tipos de cáncer [10]. En este estudio, se encontró que los
miR-26a
se expresa en off en EOC humano. Se demuestra que la inhibición de
miR-26a
disminución de la proliferación de las células EOC humanos, y suprimió el crecimiento de las células de EOC en ratones desnudos. Además, ER se había reducido regulado por
miR-26a Hoteles en células EOC. Por otra parte, se encontró que extracelulares
niveles de miR-26a
en el plasma pueden distinguir a los pacientes de los controles sanos en la EOC. Nuestro estudio sugiere que la expresión aberrante de
miR-26a
es fundamental para el desarrollo de EOC humana y la medición de circular
miR-26a
puede ser un buen método para el diagnóstico de EOC.
Materiales y Métodos
Los pacientes
Las muestras clínicas (incluyendo muestras de tejido y plasma) se recogieron de pacientes registrados en el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de china (Shenyang, china). la información de los pacientes se resumen en la Tabla 1, Tabla S1 y S2 tabla.
Materiales
El anticuerpo contra ER era de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE.UU.), anticuerpo contra α -tubulina de Sigma (St Louis, MO, EE.UU.). Todos los demás reactivos fueron de Sigma. Anti-miR-26a y sin sentido de anti-MIR eran de GenePharma (Shanghai, República Popular China). Cel-miR-39 imita eran de IBS (Shanghai, República Popular China).
RT-PCR Cuantitativa gratis (QRT-PCR cuantitativa de la transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa)
el ARN total aislado a partir de muestras clínicas o células utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) fueron transcripción inversa en ADNc de acuerdo con el informe anterior [11]. Aislamiento de RNA a partir de plasma y la cuantificación de los genes miARN se llevaron a cabo como se describe en [12]. En resumen, se añadieron 25 fmol de Cel-miR-39 imita a 400 ul de plasma. PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando SYBR Green PCR master mix (Takara, Otus, Shiga, Japón). La amplificación y detección se realizaron usando el sistema ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) según las instrucciones del fabricante. Cel-miR-39 se tomó como gen de referencia para las muestras de plasma. Los cebadores usados se enumeran en la Tabla S3.
Cell Cultura y
Las líneas celulares humanas OC, Skov-3, ES2 (Cellbank, Shanghai, República Popular de China) se mantuvieron en 5a de McCoy suplementado con 10% (v /v) de suero de ternera fetal (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Estas células se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2.
Construcción del vector
humano de longitud completa
miR-26a
se amplificó a partir de ADN genómico humano y se clonó en pcDNA3.1 en los sitios KpnI y XhoI de acuerdo con el informe anterior [13] y [14]. La de tipo salvaje humano ER se generó por PCR a partir de cDNA y los productos de PCR se insertaron en pcDNA3.1 como se describe en [15].
Cell Growth Ensayo
El crecimiento celular se estimó mediante la determinación del número de células y la formación de colonias. Las células fueron transfectadas con
miR-26a
o anti-miR
26a
utilizando Fugene HD (Roche, Indianapolis, IN) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de cultivo durante 24 horas Se sembraron las células a una densidad inicial de 1 × 10
5 por 35 mm de plato. Las células fueron cosechadas en los tiempos indicados y los números se contaron usando el CoulterTM (Beckman, Fullerton, CA, EE.UU.).
Las células transfectadas con
miR-26a
fueron sembradas en 96 pocillos las placas a una concentración de 2,5 x 10
3 células, y se mide después de 48 h utilizando un ensayo de WST-1 (Boster, Wuhan, República Popular china), realizado de acuerdo con el protocolo del fabricante.
un total de 500 células transfectadas con
miR-26a
o vector vacío (Ctrl) se sembraron en placas de 35 mm separado por triplicado. Tres semanas más tarde, las colonias se fijaron con 4% de paraformaldehído, impregnado con 20% de metanol y se tiñeron con cristal violeta. Las células teñidas se eluyeron con ácido acético glacial al 10% y los valores OD595 se midieron mediante un espectrofotómetro como el indicador del número de células.
Luciferase reportero de ensayo
1,5 × 10
5 SKOV3 estable las células en placas de 35 mm fueron co-transfectadas con pGL3-ER-WT (1 mg) o pGL3-ER-Mut (1 g) y pRL-TK (1 g) usando.
FuGENE® reactivo de transfección HD (Roche, Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) siguiendo el protocolo del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se midió la actividad luciferasa usando un sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega) y se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla.
Western Blotting
Las proteínas se separaron en SDS-8% PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) y se sondaron con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante. Las bandas de proteínas se visualizaron por el sistema Amersham ECL y se escanean. Sus densidades se determinaron mediante el software ImageQuant 5.2 (Amersham).
En vivo Tumorigénesis
SKOV3 transfectadas con
miR-26a
o anti-miR
26a
separado. Cada ratón desnudo se le inyectaron por vía subcutánea con 2 × 10
6 células transfectadas SKOV3. Treinta o treinta y cinco días después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y se tomaron los tumores. El diámetro más largo y más corto del tumor se observó como d1 y d2. El volumen del tumor se calculó utilizando la ecuación: V = d1 d2 × × d2 /2. A continuación se midió el peso del tumor.
Estadísticas
comparaciones múltiples se evaluaron mediante el software estadístico SPSS para el análisis estadístico. Prueba de Wilcoxon y Krusikal Wallis H prueba se utilizaron en el análisis estadístico de las muestras de los pacientes. Otras comparaciones entre los grupos para la significación estadística se realizaron con la prueba t de Student y el análisis de la varianza (ANOVA). Los resultados se consideraron diferencia significativa a * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
Declaración de Ética
La investigación cumple con todos los requisitos para la ética del experimento. Las muestras clínicas se recogieron con el consentimiento de los pacientes y voluntarios sanos y la aprobación del Comité de Ética de Investigación Médica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China. Todos los participantes han dado su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Medicina China.
Resultados
El aumento de la expresión de miR-26a en muestras de plasma y en EOC humano
se ha observado que el nivel de expresión de
miR-26a
fue disminuido o aumentado en tumores malignos humanos, tales como carcinoma de mama [16], carcinoma nasofaríngeo [17], [18], y glioblastoma [19] , lo que indica un papel complicado de
miR-26a
en la progresión de los tumores malignos. Para investigar el posible papel de
miR-26a
en el desarrollo EOC, lo primero que examinó la expresión de
miR-26a
en muestras de plasma y en EOC por SYBR-Green tallo-bucle QRT-PCR [20]. Se examinó la expresión de
miR-26a
en 26 muestras de tumores de ovarios normales y 19. Como se muestra en la Figura 1A, los niveles de expresión de
miR-26a
en muestras de tumores fueron mucho más altos que los de las muestras de ovario normal. Del mismo modo, las concentraciones de
miR-26a
eran más altos en el plasma de pacientes EOC (n = 17) que en la de los controles sanos (n = 13) (Figura 1B). En conjunto, estos resultados nos proporcionan evidencia inicial de que
miR-26a
puede desempeñar un papel en el desarrollo de EOC humano.
(A) Análisis cuantitativo de los niveles de expresión de
miR 26a
en muestras de EOC normalizó a las de 18s rRNA de QRT-PCR. Los datos para cada punto eran valor medio de una muestra repetida en tres experimentos independientes (normal, n = 19; tumor, n = 26). ** P & lt; 0,01 vs Normal. (B) Análisis cuantitativo de los niveles de expresión de plasma
miR-26a fotos: por QRT-PCR. Los datos para cada punto eran valor medio de una muestra repitió en tres experimentos independientes (normal, n = 13; tumoral, n = 17).
sobre-expresión de miR-26a promovió el crecimiento celular y la inhibición de EOC miR-26a suprimido la proliferación de células EOC
A continuación examinó si
miR-26a
afecta el crecimiento celular usando células EOC SKOV3 y ES2 como modelos. Como se muestra en la Figura 2A, la capacidad de crecimiento de las células SKOV3 y ES2 se incrementó por la sobre expresión de
miR-26a
. Por el contrario, la proliferación de las células transfectadas con anti-miR-26a marcadamente se disminuyó en comparación con la de las células transfectadas con sentido (Figura 2B). WST-1 ensayo mostró resultados similares en la proliferación de células (Figura 2C). Estos resultados sugieren que
miR-26a
, ya que afecta el crecimiento celular EOC.
Curvas de crecimiento de SKOV3 (A) o células ES2 (B) transfectadas con
miR-26a gratis ( panel izquierdo) o anti-miR-26a (panel derecho). El número de células se normalizaron a los de 0 hr. Los datos fueron la media ± s.e. de tres experimentos independientes por triplicado. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 vs vector vacío (Ctrl) o de control negativo (NC). la proliferación (C) de células transfectadas con
miR-26a
se midió mediante un ensayo de WST-1. Los datos fueron la media ± s.e. de tres experimentos independientes por triplicado. ** P & lt; 0,01 vs vector vacío (Ctrl) (D) La cuantificación de las colonias formadas por Ctrl o
miR-26a
células transfectadas. Los datos fueron la media ± s.e. de tres experimentos independientes. ** P & lt;. 0,01 vs Ctrl
La idea se probó en el ensayo de formación clonal. El número y tamaño de las colonias formadas se incrementaron notablemente en
miR-26a
células transfectadas (Figura 2D). En conjunto, estos resultados sugieren que
miR-26a
fue de hecho implicada en la regulación del crecimiento celular EOC.
ER era un gen diana de miR-26a en células EOC
Estamos entonces a analizar los mecanismos por los que
miR-26a
promover la proliferación de células EOC. En los pacientes con carcinoma hepatocelular, la expresión de
miR-26a
fue mayor en las mujeres que en los hombres [21]. Por otra parte,
miR-26a
regula el crecimiento de las células tumorales del hígado por la orientación ER [22]. Como se muestra en la Figura 3A, la actividad de la luciferasa de pGL3-ER-WT en las células SKOV3-stable1 (S1) fue mucho menor que en las células control. La actividad luciferasa de pGL3-ER-Mut fue rescatado en las células Stable1. A continuación examinó si
miR-26a
podría regular la expresión endógena ER en las células EOC. En comparación con el control, los niveles endógenos de mRNA ER (Figura 3B) y los niveles de proteína (Figura 3C) se redujeron reguladas cuando las células fueron transfectadas con
miR-26a
.
(A) 1 Estable células (S1) fueron transfectadas con pGL3-ER-WT (WT) vectores reportero o pGL3-ER-Mut (MUT). Los datos fueron la media ± s.e. de tres experimentos independientes. ** P & lt; 0,01 vs células de control (Ctrl). (B) El análisis cuantitativo de los niveles de expresión de ER en Stable1 (S1), Stable2 (S2) y células de control (CTRL) se determinaron y se normalizaron a los niveles de GAPDH ARNm. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 vs Ctrl. (C) análisis de transferencia Western de lisados de células totales extraídos a partir de células estables que se indican utilizando los anticuerpos indicados. Los datos fueron representativos de tres experimentos independientes y cuantificación normalizada con las teclas Ctrl. Tubulina sirve como control de carga. (D) Las curvas de crecimiento de las células S1, S2 y Ctrl. Los datos fueron la media ± s.e. de tres experimentos independientes por triplicado. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 vs Ctrl. (E) La sobreexpresión de la ER disminuyó el crecimiento de células S1 después de la transfección. El número de células se normalizaron a las células Ctrl. Los datos fueron la media ± s.e. de tres experimentos independientes por triplicado.
miR-26a controló la proliferación de las células a través de EOC ER
Teniendo en cuenta el hecho de que
miR-26a
estuvo implicado en la proliferación de las células EOC y ER era un objetivo de
miR-26a
, próximo a prueba si la sobre-expresión de ER podría rescatar a la promoción de la proliferación por
miR-26a Hoteles en células EOC. Por otra parte, la expresión estable de
miR-26a
en dos clones de células SKOV3 (S1 o S2) aumentó el crecimiento de las células de aproximadamente 1,58 o 1,37 veces, respectivamente (Figura 3D). QRT-PCR análisis mostró que
miR-26a
nivel de expresión se incrementó en gran medida en S1 y S2 células (Figura S1). Como se muestra en la Figura 3E, mientras que el crecimiento de las células transfectadas con ER S1, no fueron diferentes de la de las células de control. Estos resultados indican que
proliferación controlada de miR-26a Red de células EOC través de la regulación de la expresión de ER.
miR-26a promovido el desarrollo de tumor en ratones desnudos
Para proporcionar directa evidencia de que
miR-26a
fue responsable del desarrollo EOC, las células transfectadas con cualquiera de SKOV3
miR-26a
o anti-miR-26a se inyectaron en el flanco de ratones desnudos tal como se describe. Una semana después de la implantación, los tumores xenoinjertados podían ser vistos. Después de treinta o treinta y cinco días, todos los ratones desnudos fueron asesinados y los tumores se extrajeron y se pesaron. En la observación macroscópica, se indicaron las diferencias en el tamaño del tumor y el volumen entre los dos grupos. El volumen de los tumores generados a partir de un vector vacío fue de 0,435 ± 0,042 (cm
3, P & lt; 0,01), el de
miR-26a
grupo fue de 0,829 ± 0,172 (cm
3, P & lt; 0,01) (Figura 4A), que en el grupo control negativo fue 0,941 ± 0,163 (cm
3, P & lt; 0,01), y que en anti-miR-26a era 0,248 ± 0,05 (cm
3, P & lt; 0,01) ( Figura 4B). El peso medio del tumor generado a partir de un vector vacío fue 0,433 ± 0,07, mientras que el peso medio del tumor generado a partir de
miR-26a
era 0,821 ± 0,02 (gramo, P & lt; 0,01). El peso medio del tumor generado a partir de sentido era 1,062 ± 0,169, mientras que el peso medio del tumor generado a partir de anti-miR-26a era 0,473 ± 0,05 (gramo, P & lt; 0,01), respectivamente. Los resultados mencionados anteriormente sugieren que
miR-26a
fue fundamental para el desarrollo de EOC
in vivo
.
La formación de tumores generados por las células SKOV3. (A) transfectadas con
miR-26a
o anti-miR-26a (B) Los ratones desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con 2 × 10
6 células transfectadas. Imágenes representativas, la medición del volumen final y el peso de los tumores formados. Los tamaños de los tumores fueron medidos y calculados en Materiales y métodos. Los datos fueron la media ± S.D.. de 4-6 ratones. ** P & lt;. 0,01 vs vector vacío o sin sentido
Discusión
En este estudio, hemos demostrado que el nivel de expresión de
miR-26a
fue aumentado considerablemente en muestras de EOC humanos, y la sangre a base de
miR-26a
nivel puede distinguir a los pacientes de los controles sanos en la EOC. Nuestros resultados también muestran que el nivel de expresión de
miR-26a
afectado el crecimiento de células en cultivo EOC. Por otra parte, ER era un objetivo para los
miR-26a Hoteles en células EOC. Por otra parte, el nivel de expresión de
miR-26a
afectado a la formación de tumores en ratones desnudos. Por lo tanto, nuestros resultados son consistentes con la idea de que
miR-26a
es fundamental para el desarrollo de EOC humana
.
Los microARNs se sabe que regulan la expresión de genes implicados en diversos procesos biológicos tales como el desarrollo, la proliferación, la apoptosis y la respuesta al estrés [23]. Recientes estudios han demostrado una relación directa entre miRNAs y los cánceres humanos [4], [24], [25], [26]. MiRNAs pueden ser oncogénicos (miARN) o oncomiRs supresor tumoral relevante para el cáncer. Como se indica anteriormente, la pérdida de oncogénico
miR-21
, actuando para reprimir la expresión RHOB, está asociado con una elevación de RHOB en el carcinoma de mama y células de cáncer hepatocelular [13]. La importancia de otros miRNAs, como
let-7
,
miR-16
,
miR-126
y
miR-125 ter
también ha sido demostrado [27]. Recientes datos muestran el perfil de microarrays
miR-26a
desregulación en diversas neoplasias [4]. En el cáncer de hígado,
miR-26a
protege el tejido normal del hígado de carcinoma hepatocelular que promueven la inflamación [21], y parece antagonizar el cáncer humano de mama [16] y rabdomiosarcoma [28]. Por el contrario,
miR-26a
facilita la formación de glioblastoma como un oncogén [19]. Nuestros resultados obtenidos a partir de ganancia de función y enfoques indica la pérdida de la función que
miR-26a
promovido la proliferación y la inhibición de
miR-26a
suprime la proliferación de células EOC.
En el cáncer de ovario, la expresión de ER ha sido estudiado para correlacionar a chlinico-patológicas parámetros y el pronóstico [29], [30]. estudio previo mostró que no reveló ninguna correlación con el tipo histológico de los tumores y la clasificación de cáncer de ovario [30]. análisis de supervivencia univariante reveló que los pacientes con estado ER-positivo tuvieron una mejor supervivencia libre de progresión significativa en comparación con los pacientes sin expresión [31]. En nuestros resultados, la expresión de
miR-26a
en muestras de plasma y en EOC eran mucho más altos que los de las muestras de ovario normal, y
miR-26a
promover la proliferación de células EOC por la orientación ER. Esto significa que
miR-26a
podría ser un factor importante en la supervivencia del cáncer de ovario.
biomarcadores circulantes se usan para la enfermedad de diagnóstico, seguimiento de efecto terapéutico y predecir la recurrencia en aplicaciones clínicas. El descubrimiento de circulación miRNAs en pacientes con cáncer indica su potencial aplicación como biomarcadores de gran alcance en el diagnóstico del cáncer [32]. Estudios recientes revelaron que miRNAs relacionados con el cáncer de forma estable detectable en el plasma y el suero podrían que se originan a partir de tejidos de cáncer [4], [33]. Nuestros resultados investigan la posibilidad de
miR-26a
aplicado como biomarcador en el ámbito clínico mediante el examen de la expresión de
Hoteles en plasma de pacientes con EOC miR-26a.
En conclusión , la inhibición de
miR-26a
disminución del crecimiento de células EOC en cultivo como en ratones desnudos.
afectados miR-26a
proliferación de células EOC por la orientación ER. Una implicación importante de estudio actual es que
miR-26a
podría ser un objetivo potencial para la intervención terapéutica para EOC humano.
Apoyo a la Información
Figura S1.
miR-26a
nivel de expresión se incrementó en gran medida en las células S1 y S2. QRT-PCR determina los niveles de expresión de
miR-26a Hoteles en células S1 y S2. Los datos fueron la media ± s.e. de tres experimentos independientes por triplicado. . ** P & lt; 0,01 vs Ctrl
doi: 10.1371 /journal.pone.0086871.s001 gratis (DOC)
Tabla S1.
de datos clínico-patológicas y
miR-26a
nivel de expresión de control de
doi:. 10.1371 /journal.pone.0086871.s002 gratis (DOC) sobre Table S2.
de datos clínico-patológicas y
miR-26a
nivel de expresión de los pacientes con cáncer de ovario
doi:. 10.1371 /journal.pone.0086871.s003 gratis (DOC) sobre Table S3.
Los cebadores utilizados en la PCR Cuantitativa RT-
doi: 10.1371. /journal.pone.0086871.s004 gratis (DOC)