Extracto
El cáncer gástrico es una de las enfermedades más frecuentes entre los tumores en los países del este asiático. La identificación de marcadores pronósticos precisos y objetivos terapéuticos eficaces es importante en el tratamiento del cáncer gástrico. microRNAs (miRNAs) juegan un papel importante en la tumorigénesis. Sin embargo, los mecanismos por los que miRNAs regulan la metástasis del cáncer gástrico siguen siendo poco conocidos. En este estudio, se encontró que los niveles de miR-410 en células cancerosas y líneas gástricas eran mucho más baja que en el control normal, respectivamente, y el nivel inferior de miR-410 se asoció significativamente con la metástasis de los ganglios linfáticos. La transfección de miR-410 imita podría inhibir significativamente la proliferación celular, la migración y la invasión en las líneas celulares de cáncer gástrico HGC-27. Por el contrario, desmontables de miR-410 tuvo el efecto opuesto sobre la proliferación celular, la migración y la invasión. Por otra parte, también se encontró que MDM2 fue regulada negativamente por el miR-410 en el nivel post-transcripcional, a través de un sitio de destino específico con la 3'UTR de ensayo indicador de luciferasa. La expresión de MDM2 se correlacionó inversamente con la expresión de miR-410 en los tejidos de cáncer gástrico, y la sobreexpresión de MDM2 en células de cáncer gástrico transfectadas-miR-410 rescatado eficazmente la inhibición de la proliferación celular y la invasión causada por miR-410. Por lo tanto, nuestros hallazgos sugieren que miR-410 actuó como un nuevo supresor de tumores por la orientación del gen MDM2 y la inhibición de células de cáncer gástrico proliferación, la migración y la invasión. Los resultados de este estudio han contribuido a la comprensión actual de estas funciones de miR-410 en el cáncer gástrico
Visto:. Shen, J., Niu W, M Zhou, Zhang H, J Ma, Wang L, et al. (2014) microARN-410 suprime la migración y la invasión por la orientación MDM2 en el cáncer gástrico. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10.1371 /journal.pone.0104510
Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Mayo 2014; Aceptado: 9 Julio 2014; Publicado: 19 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Shen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Anhui Fundación Provincial de Ciencias Naturales (. NO 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
diferentes estrategias se han utilizado para tratar el cáncer gástrico (CG), que es el cuarto cáncer más frecuente y la segunda causa principal de muertes por cáncer en el mundo [1], [2]. La mayoría de los pacientes con cáncer gástrico se diagnostica en estadio III o IV, y la tasa de metástasis en los ganglios linfáticos es alta [3], [4]. Hoy en día, los pacientes con la GC en etapa tardía son la supervivencia de appoximately 20% [5] un total de 5 años. Para ello, es de gran valor clínico para dilucidar los mecanismos moleculares implicados en la metástasis del GC y para identificar nuevos marcadores para el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento para los pacientes con GC.
microRNAs (miRNAs) son pequeños no codificante ARN de $ ~ $ 22 nucleótidos de la longitud que regulan la expresión de sus ARNm diana a través de la represión de traducción o mRNA división [6]. Están involucrados en procesos biológicos fundamentales, incluyendo el desarrollo y la diferenciación [7], [8]. La desregulación de la miRNAs se correlaciona a desempeñar un papel importante en el desarrollo y progresión del cáncer mediante la regulación de la proliferación celular, diferenciación, apoptosis y carcinogesis [9], [10]. La expresión aberrante de miRNAs o mutaciones de genes miARN han sido bien investigado en muchos tipos de tumores, incluyendo linfoma, pulmón, páncreas, leucemia, mama, colon y cáncer de hígado [11] - [15]. Sin embargo, el papel de los miRNAs en GC siguen siendo en gran parte desconocido.
Los estudios anteriores han investigado el papel de miR-410 en varios tipos de cáncer. Gattolliat et al [16] .demonstrated que la expresión de miR-410 se asoció significativamente con la supervivencia libre de enfermedad del neuroblastoma no amplificado favorable. Además, Chen en el [17] encontró que la expresión de miR-410 se redujo en los gliomas humanos y la expresión de miR-410 en células de glioma forzado inhibió fuertemente la proliferación celular, invasión mediada por la orientación MET. Por otra parte, Chien et al [18] encontró que el miR-410 regulada negativamente pRb /E2F vía atacando directamente a CDK1, que era un oncogén en cáncer de mama. Sin embargo, el papel de miR-410 en GC sigue siendo poco clara. En este estudio, hemos demostrado que la disminución de la expresión de miR-410 es un cambio molecular característico de GC y investigó el efecto de los niveles de miR-410 moduladas en los fenotipos de las líneas celulares de GC. También puso de manifiesto que el miR-410 puede funcionar como un oncogén atacando directamente a MDM2.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos estos pacientes aceptaron participar en el estudio y dieron su consentimiento informado por escrito. Tanto este estudio y el consentimiento fueron aprobados por el comité de ética del Hospital Provincial de Anhui y el cumplimiento de la Declaración de Helsinki.
Las muestras humanas
Se recogieron GC humano y sus muestras gástricas no tumorales correspondientes en el momento de la resección quirúrgica del hospital Provincial de Anhui de 2008 a 2009. escrito el consentimiento informado se obtuvo antes de la recolección. Una parte se fijó con formalina al 10% para el diagnóstico histopatológico, y el otro fue inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenó a -196 ° C en nitrógeno líquido hasta que se extrajo el ARN. El uso de tejidos humanos fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Provincial de Anhui.
Cultivo de células
SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 y células HEK293T fueron comprado en el Instituto de Shanghai de Bioquímica y Biología celular de la Academia china de Ciencias. Gástrica epitelial-1 células (GES) se obtuvo a partir del Hospital Ruijin de Shanghai Jiaotong de Shanghai University School of Medicine. La SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 y GES se mantuvieron en RPMI1640 y HEK293T se mantuvo en los medios de medio de Eagle modificado de Dulbecco. El medio se suplementó con suero bovino fetal 10%. Las células fueron incubadas a 37 ° C en una cámara humidificada que contiene 5% de dióxido de carbono.
Plásmidos y transfección celular
miR-410 imitan /inhibidor y los controles fueron adquiridos de RiboBio (Guangzhou, China). Las células HGC-27 fueron sembradas en placas de seis pocillos a 30% de confluencia un día antes de la transfección. La transfección con el miR-410 imitan /inhibidor o los controles se realizó utilizando Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). complejos de transfección se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
QRT-PCR
Para los ensayos de QRT-PCR, el ARN total fue extraído de células con el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). La transcripción inversa se realizó con el kit de reactivos PrimeScript RT con gDNA goma de borrar (Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La expresión de miR-410 fue verificada por la de horquilla alterado RT-PCR con cebadores específicos RT y PCR. U6 snRNA se utilizó como control endógeno. RT reacciones se llevaron a cabo mediante el uso de fracción de ARN con el kit de Promega RT siguiendo el protocolo del fabricante. Las condiciones de PCR se llevaron a cabo mediante la desnaturalización del ADN a 94 ° C durante 4 min, seguido de 40 ciclos de amplificación: 94 ° C durante 40 s, 52 ° C durante 40 s, 72 ° C durante 40 s para la recogida de datos. PCR cuantitativa se realizó en un termociclador ABI 7500 (Applied Biosystems) utilizando SYBR Premezcla Ex Taq (Perfect Tiempo Real) Kits (Takara, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayo de proliferación celular
Un total de 10
4 células por pocillo se sembraron en placas de 96 pocillos antes de la transfección y se cultivaron durante 24 h en condiciones normales. Posteriormente fueron transfectadas con el miR-410 imitan o inhibidor anti-miR-410 junto con los controles negativos emparejados. La proliferación celular se evaluó utilizando el Kit de Recuento celular 8 (Dojindo, Tokio, Japón) según el protocolo del fabricante.
La migración celular y la invasión de ensayo
Para los ensayos de migración, 5 × 10
se añadieron 4 células en la cámara superior de la pieza de inserción (BD Bioscience, 8-micras de tamaño de poro). Para los ensayos de invasión, 1 × 10
se añadieron 5 células en la cámara superior del inserto pre-revestido con Matrigel (BD Bioscience). En ambos ensayos, las células se sembraron en medio sin suero, y medio que contiene 10% de FBS en la cámara inferior sirvieron como quimioatrayente. Después de varias horas de incubación, las células que no migran o invaden a través de los poros fueron eliminados cuidadosamente con un algodón. A continuación, los insertos se tiñeron con 20% de metanol y 0,2% de cristal violeta, se explora, y se contaron con un microscopio invertido IX71 (Olympus).
Análisis de transferencia Western
Las proteínas fueron separadas en SDS-poliacrilamida electroforesis en gel y transferidos a la membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). La membrana se bloqueó con leche desnatada al 5% y se incubó con el anticuerpo de conejo anti-MDM2 monoclonal (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.) y el anticuerpo monoclonal anti-b-GAPDH de ratón (1:10000 ; Sigma). Las proteínas se detectaron con reactivos de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).
reportero de luciferasa ensayo
HEK293T células se sembraron en placas de 96 pocillos. Después de 24 h de incubación, una mezcla de 100 ng pLUC 3'UTR, control negativo 5 pmol, miR-410 mímica se cotransfectaron con 20 ng.
Renilla en células HEK293T utilizando Lipofectamine 2000. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las actividades de luciferasa de luciérnaga Renilla y se midieron con el sistema Dual-Luciferase Reporter (Promega, Madison, WI, EE.UU.). La eficiencia de transfección se normalizó por la co-transfección con un vector reportero de Renilla.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de al menos los tres experimentos. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 15.0. Un análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y la prueba t de Student se utilizó para el análisis estadístico. Un valor de p. & Lt; 0,05 fue considerado para indicar un análisis estadístico
Resultado
La expresión de miR-410 fue significativamente las reguladas en las células y tejidos GC
Para evaluar el papel de miR-410 en GC, se evaluó la expresión de miR-410 en la línea celular GC, tejidos y sus tejidos normales emparejados utilizando RT-PCR cuantitativa. Se encontró que los niveles de miR-410 eran con frecuencia las reguladas en líneas celulares de GC en comparación con GES. Figura 1B muestra que los niveles de miR-410 se redujeron regulado en los tejidos de GC en comparación con los tejidos normales emparejados. El nivel medio de expresión en tejidos de carcinoma (combinación) fue significativamente mayor en comparación con sus tejidos no neoplásicas adyacentes (Figura 1C). También demostramos que la expresión de miR-410 en las metástasis tejidos GC fue menor que en los tejidos no-metástasis (Fig. 1D).
A. QRT-PCR análisis de la expresión de miR-410 en cuatro líneas celulares derivadas de cáncer gástrico y una línea de células gástricas no maligno (GES). (B) Análisis de QRT-PCR de la expresión de miR-410 en 60 tejidos pares GC y sus correspondientes tejidos adyacentes nontumorous. La expresión de miR-410 se normalizó a U6 snRNA. (C) con respecto miR-410 niveles de expresión en tejidos normales GC y regiones adyacentes; (D) El análisis estadístico de la asociación entre el nivel de miARN entre PM etapa (No hay metástasis y la metástasis, respectivamente); * P & lt; 0,05 y ** p & lt;. 0,01
410 miR-proliferación celular GC inhibido, la migración y la invasión
Los niveles de miR-410 se incrementaron significativamente en células de GC que se transfectaron con miR-410 imita y los niveles de miR-410 se redujeron que fueron tratados con el inhibidor de miR-410 (Fig. 2A). Sobre regulación de la proliferación celular de miR-410 GC inhibido; Por el contrario, desmontables de miR-410 tuvo el efecto opuesto sobre la proliferación celular (Fig. 2B). Por otra parte, el ensayo transwell ensayo y la invasión demostró que el migrada y la invasividad de las células transfectadas con el miR-410 imita de forma exponencial estaba disminuido en comparación con el control y las células no tratadas. También puso de manifiesto que el migrada y la invasividad de las células transfectadas con el inhibidor de miR-410 se incrementó drásticamente en comparación con el control y las células no tratadas. (Fig. 2C y D).
La expresión de miR-410 se normalizó a U6 snRNA. (B) Las células tratadas con miR-410 imita, inhibidores o sramble o sin transfección se midieron mediante ensayo CCK8 en diferentes períodos de tiempo. (C) Análisis Transwell de HGC 27 células después del tratamiento con imita miARN, inhibidores o despegue en tiempo mínimo o ningún transfección; la proporción relativa de células que migraron por campo se muestra a continuación. (D) Análisis Transwell de HGC 27 células después del tratamiento con imita miARN, inhibidores o despegue en tiempo mínimo o ningún transfección; la proporción relativa de células invasivas por campo se muestra a continuación, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt;. 0.001
miR-410 dirigido directamente MDM2 en GC
Como se predijo por PicTar, hubo complementariedad entre tiene-miR-410 y MDM2 3'-UTR (Fig. 3A). Para demostrar que el miR-410 regula directamente MDM2, se empleó un sistema de doble reportero luciferasa. Hemos encontrado que la co-expresión de miR-410 suprimió de forma significativa la actividad de luciferasa firely reportero de la de tipo salvaje MDM2 3'UTR pero no el mutante 3'UTR (Fig. 3B). La sobreexpresión de miR-410 redujo la expresión de MDM2 ARNm y proteína (Fig. 3C y D).
(A) Las secuencias de sitios de unión de miR-410 en el humano MDM2 3'UTRs y constructos indicadores esquemáticos, en este panel, c-MDM2-WT representan las construcciones indicadoras que contienen todas las secuencias 3'UTR de MDM2. C-MDM2-MUT representan las construcciones indicadoras que contienen nucleótidos mutados. (B) El análisis de las actividades relativas de luciferasa de MDM2-WT, MDM2-MUT en células 293T. Las barras de error se derivan de expriments triplicado. análisis (C) QRT-PCR de la expresión de ARNm de MDM2 en HGC-27 células después del tratamiento con imita miARN o despegue en tiempo mínimo o ningún transfección. La expresión de MDM2 se normalizó a GAPDH. (D) Análisis de transferencia Western de la expresión de MDM2 en las células HGC-27 transfectadas con el miR-410 imita o despegue en tiempo mínimo o ningún transfección. También se detectó GAPDH como control de carga.
La sobreexpresión de MDM2 inpaired inhibición de la invasión de miR-410-inducida en células GC
Se realizó experimentos de rescate mediante transfección de 3'UTR- MDM2 negativo junto con el miR-410. Como era de esperar, la transfección con el pcDNA3.1-MDM2 alivió la reducción de MDM2 resultado de miR-410 de tratamiento imitador (Fig. 4A). De acuerdo con la expresión de proteínas diana, la transfección con el pcDNA3.1-MDM2 mitiga la inhibición de la amplificación de células (Fig. 4B) y el aumento de las células invasoras (Fig. 4C) resultó de miR-410 de tratamiento sinóptico.
(B) curvas de crecimiento celular en células HGC-27 transfectadas con diferentes combinaciones. (D) Transwell análisis de células HGC-27 tratadas con diferentes combinaciones. La proporción relativa de las células invasoras por campo se muestra a la derecha. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001
MDM2 se expresó inversamente con el miR-410 en GC
Para aclarar aún más la relación entre el miR -410 y la expresión de MDM2 en muestras primarias, se detectó en primer lugar MDM2 en líneas celulares de GC. Como se muestra en la Fig. 5A y 5B, el ARNm y la expresión de proteínas de MDM2 fue mucho higer en las líneas celulares 4 GC que la de la GES. También se encontró que la expresión de MDM2 en los tejidos de GC era significativamente mayor que en los tejidos normales adyacentes correspondientes (Fig. 5C). El gráfico de dispersión y el análisis de correlación de Pearson mostraron además que la expresión de miR-410 se correlacionó negativamente con los niveles de proteína diana en las muestras de GC (Fig. 5D). Estos datos sugirieron que la disminución de la expresión de miR-410 se relaciona con el aumento de los niveles de MDM2 en la mayoría de los pacientes con cáncer gástrico
.
(A) Los niveles relativos de expresión de ARNm de MDM2 se determinaron mediante qRT-PCR en cuatro líneas celulares derivada de cáncer gástrico y una línea celular gástrica no maligno (GES). La expresión de MDM2 se normalizó a GAPDH. (B) Análisis de transferencia Western de la expresión de MDM2 en cuatro líneas celulares derivadas de cáncer gástrico y una línea de células gástricas no maligno (GES). GAPDH se detectó también como control de carga. (C) el análisis de QRT-PCR de la expresión de MDM2 en 40 pares de tejidos de cáncer gástrico y sus correspondientes tejidos normales adyacentes. La expresión de MDM2 se normalizó a GAPDH. La expresión de MDM2 en los tejidos de cáncer gástrico fue significativamente mayor que en los tejidos normales adyacentes correspondientes. (D) Análisis de correlación de miR-410 y MDM2 expresión en tejidos de cáncer gástrico. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001
Discusión
miRNAs han actuado como importantes reguladores de la expresión génica a nivel post-transcripcional y regular una amplia gama de procesos fisiológicos y de desarrollo [6], [19], [20]. evidencias de montaje sugieren que las alteraciones en la expresión de miRNAs contribuyen a la patogénesis de los cánceres más humanos, que pueden actuar tanto como oncogenes o supresores de tumores [21], [22]. Recientemente, datos acumulados indican que los miRNAs están involucrados en varios eventos biológicos importantes, tales como la tumorigénesis y metástasis del cáncer [23], [24]. En el presente estudio, se investigó el papel biológico de miR-410 en la tumorigénesis GC humana. Nuestros resultados demuestran que el miR-410 era con frecuencia las reguladas en GC humana y que su regulación a la baja se asoció significativamente con el estadio clínico y metástasis en los ganglios linfáticos. la expresión forzada de miR-410 podría aumentar la proliferación, la migración y la invasión de la línea de células GC in vitro. Se identificaron más de MDM2, un gen supresor tumoral putativo, como un objetivo funcional directa de miR-410. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para explorar el papel de miR-410 en GC, y nuestros resultados indicaron que el miR-410 actuó como un nuevo oncogén en GC.
La desregulación de miR-410 es un frecuente evento en varios tipos de cáncer, lo que sugiere que miR-410 puede desempeñar un papel importante en la tumorigénesis y progresión tumoral. Gattolliat y sus colegas muestran que la expresión de miR-410 se asoció significativamente con la supervivencia libre de enfermedad del neuroblastoma favorables no amplificado [16]. Además, Chen [17] encontró que el miR-410 expresión se redujo en los gliomas humanos y forzó el miR-410 expresión en células de glioma inhibió fuertemente la proliferación celular, invasión mediada por la orientación MET. Sin embargo, no se ha informado de la expresión y función de miR-410 en el desarrollo de GC. En este estudio, hemos identificado la expresión de miR-410 en varias líneas celulares de cáncer gástrico y la GES mediante qRT-PCR. La expresión de miR-410, fue significativamente superior en todas las líneas celulares de cuatro GC en comparación con en el GES. Además, los resultados obtenidos a partir de tejido GC clínica también confirmaron que miR-410 se había reducido regulado en los tejidos de GC en comparación con los tejidos adyacentes no cancerosos emparejados, con indicación de su posible participación en tanto la transformación y el tumor oncogénico metástasis. Posteriormente, se confirmó que la inhibición de miR-410 promovió significativamente celular GC proliferación, la migración y la invasión in vitro.
Además, exploramos el mecanismo molecular que subyace en el papel de miR-410 y se identificaron MDM2 como objetivo abajo funcional directa de miR-410 en las células de GC. enfoques de la bioinformática, que fueron utilizados para predecir los objetivos de miRNAs, destacaron un partido de semilla de alta energía libre en el sitio de unión al miARN bien conservado y sus ARNm diana, pero la especificidad siguen siendo un problema en la definición de los objetivos de muchos miRNAs. Por lo tanto, la sobre expresión de un miARN podría regular a la baja la expresión de la proteína diana. secuencia complementaria de miR-410 se identifica en el 3'UTR de MDM2 mRNA. Además, hemos demostrado que miR-410 se dirige directamente a la 3'UTR de MDM2, como su sobreexpresión se asocia con la supresión de la actividad de luciferasa. Además, se observó una significativa baja regulación en el nivel de la proteína MDM2 después de la sobreexpresión de miR-410, lo que indica la regulación postranscripcional de MDM2 a través de la orientación de su 3'UTR. Estos resultados indicaron que miR-410 puede funcionar como un supresor de tumores en parte mediada por la represión de la expresión de miR-410 en el desarrollo de GC.
MDM2 es un oncogén que se descubrió en primer lugar en un locus amplificado en cromosomas dobles minuto en una tumorigénico ratón línea celular (3T3-DM) [25]. La función principal de MDM2 es inhibir la bioactividad de p53 mediante el bloqueo de la actividad transcripcional de p53 y promover la degradación de la proteína p53 [26] - [28]. Los altos niveles de MDM2 disminuyeron los niveles de proteína p53 y pueden atenuar la función de p53, lo que aumentó el riesgo de cáncer y /o la formación de tumores y la progresión acelerada [29]. El oncogén MDM2 jugó un papel importante en la progresión del cáncer [30]. La sobreexpresión de MDM2 en las células tumorales inducidas proliferación celular, inhibe la apoptosis de las células [31]. Varios estudios han demostrado que la sobreexpresión de MDM2 se asoció con la supervivencia pobre y fue un factor predictivo útil de mal pronóstico en los seres humanos con carcinoma hepatocelular y de mama carcinomas [32], [33]. Por otra parte, el estudio reciente ha encontrado que MDM2 se expresó en niveles más altos en los tejidos de GC que en la mucosa gástrica no cancerosos, y la expresión de MDM2 se asoció con características clínico en pacientes tratados sólo con cirugía [34], [35]. Por otra parte, desmontables de MDM2 o sobreexpresión de JWA tiene el efecto sinérgico sobre la supresión de la proliferación de células de cáncer gástrico y la migración [35]. Sin embargo, el mecanismo de cómo MDM2 fue sobreexpresión es aún desconocido. Estos resultados indican que la capacidad de miR-410 para apuntar MDM2 puede proporcionar uno de tales mecanismos de control de post-transcripcional de MDM2.
En resumen, nuestros resultados han demostrado que el miR-410 fue significativamente las reguladas en GC células y tejidos. La expresión forzada de un aumento de miR-410 GC proliferación celular, la migración y la invasión a través de la orientación directa MDM2. Estos hallazgos sugieren que esta novela de miR-410, eje /MDM2 proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la metástasis tumoral subyacente, y la represión de la expresión de miR-410 puede ser una estrategia terapéutica para el tratamiento de la GC en el futuro.
Apoyo a la Información sobre Table S1. CARACTERISTICAS
clínico-patológicas de los pacientes con GC
doi: 10.1371. /journal.pone.0104510.s001 gratis (DOCX)
Tabla S2.
cebador de secuencia
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104510.s002 gratis (DOCX)