Extracto
Los datos acumulados sugieren que la expresión funcional de los receptores tipo Toll (TLR ) en las células tumorales estuvo implicado en la progresión tumoral. Nuestro estudio anterior demostró que TLR9 de señalización podría mejorar la progresión del tumor de células de cáncer de pulmón humano in vitro e in vivo. Demostramos además que el miR-574-5p fue la mayoría regulados hasta miARN en células de cáncer de pulmón humano bajo TLR9 de señalización mediante el análisis conjunto de los genes miARN. Aquí hemos caracterizado el papel potencial de los genes miARN-574-5p en la progresión tumoral mejorada inducida por TLR9 de señalización en el cáncer de pulmón humano. Se confirmó que la señalización TLR9 elevó efectivamente la expresión de miR-574-5p en células de cáncer de pulmón humano. En particular, se encontró que la baja regulación de los genes miARN-574-5p usando inhibidor de miR-574-5p in vitro o miR-574-5p esponja en vivo abrogada significativamente la progresión tumoral mejorada inducida por la señalización TLR9. Otros estudios demostraron que el miR-574-5p era un jugador importante asociado con la progresión tumoral mejorada de las células del cáncer de pulmón humano. En particular, hemos identificado supresor de punto de control 1 (Ches1) como objetivo directo dominante de los genes miARN-574-5p para conferir el TLR9 señalización progresión tumoral mejorada. Hemos puesto de manifiesto que la sobre expresión de Ches1 inhibió significativamente la entrada del ciclo celular de las células cancerosas de pulmón humano. Finalmente, se reveló que la expresión de miR-574-5p se correlacionó positivamente con TLR9 y inversamente correlacionada con Ches1 en pacientes con cáncer de pulmón. Nuestros resultados no sólo facilitaron la mayor comprensión de la diafonía entre miRNAs y los TLR en la biología del tumor, sino que también proporcionan nuevas candidatos potenciales para el tratamiento de cáncer de
Visto:. Li Q, Li X, Z Guo, Xu F, Xia J, Liu Z, et al. (2012) microARN-574-5p fue fundamental para la señalización TLR9 la progresión tumoral mejorada gracias a la regulación negativa de Checkpoint supresor 1 en cáncer de pulmón humano. PLoS ONE 7 (11): e48278. doi: 10.1371 /journal.pone.0048278
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Julio, 2012; Aceptado 21 de septiembre de 2012; Publicado: 2 de noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Departamento de Nueva Área de Pudong (PKJ2011-Y33), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81071744), Pudong Shanghai New Leader Área Académica en el Sistema de Salud (PWRd2010-01), Programa de Investigación básica de Ciencia y Tecnología con el apoyo de la Shanghai Comité de Ciencia y Tecnología (11JC1410900), y Qianjiang Proyecto Talento del Departamento de la provincia de Zhejiang Ciencia y Tecnología (2010R10080). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El descubrimiento de una serie de receptores inmunes innatas-específicos activados por los patrones moleculares asociados a patógenos condujo a una nueva comprensión de los mecanismos de inmunidad innata. Entre los receptores-inmunes específicas innatas, los son los receptores mejor caracterizados tipo Toll (TLRs) que reconocen una variedad de patrones moleculares asociados a patógenos, se expresan principalmente en las células inmunes y juegan un papel importante en innata y adaptativa inmunidad [ ,,,0],1] - [3]. Curiosamente, un creciente cuerpo de literatura demostró que los TLR funcionales también se expresaron ampliamente en una variedad de células tumorales incluyendo cáncer de mama, cerebro, estómago y células cancerosas de pulmón [4]. La acumulación de datos mostraron que TLRs agonista podría promover la invasión y mejorar el potencial metastásico de las células tumorales, lo que indica que la activación de los TLR de señalización en las células tumorales estuvo involucrado en el progreso del tumor [5] - [8]. Nuestro estudio anterior demostró que oligodesoxinucleótidos CpG (CpG ODN), que estaban bajo investigación como adyuvante en la terapia contra las infecciones y cánceres, efectivamente podrían activar la vía de señalización de TLR9 en células de cáncer de pulmón humano y por lo tanto promovido la progresión del tumor tanto in vitro como in vivo [ ,,,0],3], [4], [9] - [11]. Hemos demostrado, además, que la sobre regulación de la quinasa dependiente de ciclina 2 (CDK2) era crítico para TLR9 de señalización para estimular la entrada de la proliferación y el ciclo celular de las células cancerosas de pulmón humano [4]. Sin embargo, los mecanismos precisos de cómo la señalización TLR9 estuvo implicado en la progresión tumoral de cáncer de pulmón humano eran todavía mucho menos clara.
Los microARN (miRNA) han surgido como una clase importante de genes reguladores de expresión, post-transcripcional de genes que regula expresión a través de apareamiento de bases a parcialmente sitios complementarios para prevenir la acumulación de proteínas mediante la represión de la traducción o mediante la inducción de la degradación de mRNA, ligada a la mayoría de las funciones biológicas, incluyendo la biología del tumor [12], [13]. Los datos acumulados sugieren que los miRNAs fueron biomarcadores eficaces y novedosos para el diagnóstico del cáncer de pulmón, la predicción y el tratamiento [14], [15]. Mientras tanto, miRNAs también estaban implicados en la regulación de los efectos biológicos de TLRs señalización [16] - [18]. Para investigar el papel potencial de miRNAs en el aumento de la progresión del tumor de células de cáncer de pulmón humanos tras la estimulación agonista TLR9, se realizó miARN microarrays de ensayo para detectar el perfil de expresión de los genes miARN en 95D células con o sin tratamiento de CpG ODN, y se encontró que los ODN CpG estimulación alternó el perfil de expresión de miRNA en células 95D y la diferencia en las expresiones de 23 miRNAs entre el grupo tratado con CpG ODN y el grupo no tratado fue al menos dos veces, entre los cuales los genes miARN-574-5p fue la mayoría regulados hasta miARN en CpG ODN estimulado 95D células en comparación con los que el grupo no tratado [19]. Sin embargo, el posible efecto de los genes miARN-574-5p en la progresión tumoral mejorada inducida por la señalización TLR9 aún queda por esclarecer.
Para hacer frente a este problema, aquí nos caracteriza el efecto de los genes miARN-574-5p que era hasta reguladas en virtud de TLR9 de señalización en células de cáncer de pulmón humano. Se encontró que los genes miARN-574-5p fue fundamental para TLR9 de señalización para mejorar la progresión tumoral de las células cancerosas de pulmón humano. Otros estudios demostraron que supresor de punto de control 1 (Ches1) era un objetivo directo dominante de los genes miARN-574-5p para conferir el TLR9 señalización progresión tumoral mejorada. Estos resultados extienden los estudios anteriores y proporciona un nuevo conocimiento de la comprensión de miRNAs en la expresión funcional de TLR9 en células tumorales.
95D células (A) se trataron con 10 mg /ml ODNs o control CpG ODN CpG durante el tiempo indicado y detectado para su proliferación. (B) Los grupos de ocho ratones desnudos fueron desafiados con 2 × 10
6 de células 95D. Cinco días más tarde, el tumor ratones portadores se inyectaron in situ con 100 g de CpG ODN en intervalos de 7 días. El grupo control recibió dosis igual del control de CpG ODN o el volumen igual del medio. Se determinó el tamaño del tumor. Cada barra representa el medio (± DE) de ocho ratones desnudos en cada grupo. 95D células (C) se trataron con la dosis indicada de CpG ODN durante 72 h y luego se ensayaron con respecto a su expresión de miR-574-5p. (D) 95D células fueron tratadas con ODN 10 g /ml de CpG durante el tiempo indicado y se ensayaron para la expresión de miR-574-5p. (E) 95D células se trataron con 10 mg /ml ODNs CpG en presencia de la dosis indicada de cloroquina durante 72 h y luego se ensayaron con respecto a su expresión de miR-574-5p. (F) 95D células se trataron con 10 mg /ODNs CpG ml en presencia de la dosis indicada de MyD88 péptido inhibidor (Pepinh-MyD88) o el péptido control (Pepinh-Control) durante 72 h y luego se ensayaron para la expresión de MIR -574-5p. Las barras de error indican la desviación estándar de las mediciones por triplicado a partir de tres experimentos independientes.
consentimiento informado por escrito Materiales y Métodos
Ética Declaración
se les dio a todos los pacientes en este estudio, y el estudio en humanos fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Tongji (número de permiso: 20090128). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Laboratorios Médicos animales y con la aprobación ética de laboratorio médico Shanghai Cuidado de Animales y el empleo Comisión, así como el Comité Ético de la Universidad de Tongji (Número de permiso: 20110016).
95D células (a) se transfectaron con inhibidor de miR-574-5p durante 48 horas y después se ensayaron con respecto a su expresión de miR-574-5p. (B) 95D células fueron transfectadas con inhibidor de miR-574-5p o el control respectivamente, y después se estimularon con 10 mg /ml ODNs CpG durante el tiempo indicado. Las barras de error indican la desviación estándar de las mediciones por triplicado formar tres experimentos independientes. (C) la actividad mejorada del reportero de miR-574-5p-regulado se logró mediante la infección de células 95D con la esponja de miR-574-5p. Grupos de ocho ratones desnudos (D y E) fueron desafiados con 2 × 10
6 de 95D células que fueron transfectadas establemente con el vector de esponja miR-574-5p o el vector control. Cinco días más tarde, el tumor ratones portadores se inyectaron in situ con 100 g de CpG ODN en intervalos de 7 días. Se determinó el tamaño del tumor y el tiempo de supervivencia de los ratones portadores de tumores. Cada barra representa el medio (± DE) de ocho ratones desnudos en cada grupo. * P & lt;. 0,05
Los pacientes
Entre junio de 2009 y marzo de 2012, se recogieron muestras de tumores de pacientes con cáncer de pulmón en el Hospital Oriental, Shanghai, China. El grupo de estudio (n = 23) de quimioterapia y radioterapia comprendido pacientes no tratados previamente con cáncer de pulmón. Revisión de los informes de patología confirmó el diagnóstico. Los sujetos con enfermedades autoinmunes (por ejemplo, la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico), infecciones crónicas (por ejemplo, la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, la tuberculosis), afectación de la médula ósea, anticoagulante y antitrombótico usando, o los que habían recibido tratamiento inmunosupresor fueron excluidos. La información relativa a las características patológicas clínicas de los pacientes se resumen en la Tabla 1.
95D células (A) se transfectaron con imita el miR-574-5p o el control, respectivamente, y luego se ensayaron con respecto a su proliferación en el momento indicado. (B) 95D células fueron transfectadas con inhibidor de miR-574-5p o el control respectivamente, y luego se ensayaron para su proliferación en el momento indicado. Las barras de error indican la desviación estándar de las mediciones por triplicado formar tres experimentos independientes. (C-F) grupos de ocho ratones desnudos fueron desafiados con 2 × 10
6 de 95D células que fueron transfectadas establemente con el miR-574-5p vector de expresión o vector de esponja de miR-574-5p respectivamente, y luego se ensayaron en cuanto a su la progresión del tumor en ratones desnudos en el momento indicado. También se determinó el tiempo de supervivencia de ratones portadores de tumores. Cada barra representa el medio (± DE) de ocho ratones desnudos en cada grupo.
Ratones
hembra Balb /c ratones desnudos entre 6 y 8 semanas de edad se obtuvieron de la centro de Animales experimentales de la Universidad de Tongji. Todos los animales fueron alojados en una colonia de ratones libres de patógenos en nuestra institución.
95D células (A) se transfectaron con inhibidor de miR-574-5p durante 48 horas y luego se analizaron para la expresión de los genes indicados utilizando reales PCR en tiempo. (B) 95D células fueron transfectadas con inhibidor de miR-574-5p durante 48 h y luego se ensayaron con respecto a su expresión de Ches1 mediante Western blot. Se muestra la intensidad relativa del nivel de proteína Ches1 de tres experimentos independientes. 95D células (C) fueron co-transfectadas con imita el miR-574-5p y un reportero de la luciferasa que contiene 'UTR o mutado Ches1 3' del amplio tipo Ches1 3 UTR. (D) 95D células se trasnfected con vector de expresión Ches1 durante 48 h y luego se ensayaron con respecto a su expresión de nivel de proteína Ches1. (E) 95D células fueron co-transfectadas con imita miR-574-5p y vector de expresión Ches1, y luego se ensayó para su proliferación. (F) Los grupos de ocho ratones desnudos fueron desafiados con 2 × 10
6 de 95D células que fueron transfectadas establemente con el vector de expresión de miR-574-5p además vector de expresión Ches1 o su control, y luego se ensayaron en cuanto a su progresión tumoral en el tiempo indicado. (G) 95D células fueron transfectadas con el vector de expresión Ches1, y después se estimularon con ODN 10 g /ml de CpG para el tiempo indicado. (H) Los grupos de ocho ratones desnudos fueron desafiados con 2 × 10
6 de 95D células que fueron transfectadas establemente con el vector de expresión Ches1 o el vector de control. Cinco días más tarde, el tumor ratones portadores se inyectaron in situ con 100 g de CpG ODN en intervalos de 7 días. El tamaño del tumor se determinó en el momento indicado. Cada barra representa el medio (± DE) de ocho ratones desnudos en cada grupo.
Reactivos y la línea celular
CpG ODN2216, controlar ODN CpG, la cloroquina y el péptido inhibidor contra MyD88 fueron adquiridos de InvivoGen. imita miR-574-5p y inhibidor de miR-574-5p fueron adquiridos de Ribobio (Guangzhou, China). kit de detección de apoptosis con anexina V-FITC se adquirió de eBioscience. ciclo celular kit de determinación de fase se adquirió de Cayman. El kit nucleofector se adquirió de Amaxa. La línea celular de cáncer de pulmón humano 95D células se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron a 37 ° C bajo 5% de CO
2 en RPMI completo 1640 (GIBCO) que contiene 10% de suero bovino fetal inactivado por calor complementado con glutamina 2 mM, 100 IU /ml de penicilina y 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina.
(a) 95D células fueron transfectadas con el vector de expresión Ches1 y se ensayaron para su proliferación en el momento indicado. (B) Los grupos de ocho ratones desnudos fueron desafiados con 2 × 10
6 de 95D células que fueron transfectadas establemente con el vector de expresión Ches1 o el vector de control. El tamaño del tumor se determinó en el momento indicado. Cada barra representa el medio (± DE) de ocho ratones desnudos en cada grupo. (C y D) 95D células que fueron transfectadas establemente con el vector de expresión Ches1 se sincronizaron primero en la fase de G0 mediante la sustitución del medio de cultivo con medio libre de suero durante 24 horas, y se detectaron por su apoptosis usando Anexina V tinción y el ciclo celular usando el ciclo celular kit de determinación de fase mediante citometría de flujo. (E) 95D células fueron transfectadas con el vector de expresión Ches1 y se ensayaron para su nivel de proteína CDK2 48 h más tarde. Las barras de error indican la desviación estándar de las mediciones por triplicado a partir de tres experimentos independientes * p & lt;.. 0,05
Ensayo MTT
95D células se sembraron a 3 x 10
3 células de cada pocillo y se incubaron en presencia o ausencia de CpG ODN (10 mg /ml) en placas de 96 pocillos durante 72 h. Evaluación de la proliferación celular se midió usando el kit de proliferación celular MTT comercialmente (Cayman) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
(A) TLR9 relativa, miR-574-5p y expresión Ches1 se determinaron mediante PCR en tiempo real en 23 NSCLC muestras de cáncer de pulmón. Cada barra representa la proporción relativa de estos genes en el tejido canceroso en comparación con el tejido pulmonar adyacente. Las barras de error indican la desviación estándar de las mediciones por triplicado formar tres experimentos independientes. (B-D) analiza la correlación entre la expresión de TLR9 y miR-574-5p, miR-574 y Ches1, así como TLR9 y Ches1, se llevaron a cabo. Cada punto representa los resultados de un paciente.
-PCR en tiempo real
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó como se describió anteriormente [20]. Todos los cebadores y sondas se obtuvieron de Applied Biosystems. ARN total fue extraído utilizando el reactivo TRIzol. cDNA fue sintetizado con el kit de reactivos PrimeScript RT (Takara). RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) Se realizaron análisis para detectar la expresión de ARNm utilizando SYBR Premezcla Ex Taq (Takara), y β-actina se utilizó como control interno. Los ensayos TaqMan micro-ARN (Applied Biosystems) se utilizaron para cuantitativa los niveles de expresión de miR-madura 574-5p, y U6 pequeños ARN nucleares se utilizó como control interno.
Transferencia Western
Las células se lisaron con M-PER Protein reactivo de extracción (Pierce) suplementado con un cóctel inhibidor de la proteasa. Citoplasmática y nuclear extractos se prepararon utilizando NE-PER nucleares y citoplasmáticas de extracción Reactivos (Pierce). Después de centrifugación a 13.000 g bajo 4 ° C durante 15 min, se recogieron los sobrenadantes, y la concentración de proteína de los extractos se midió por ensayo de proteína BCA (Pierce) según las instrucciones del fabricante. Veinte microgramos de la proteína se cargaron en 10% de geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron durante 90 min a 100 V a membranas de fluoruro de polivinilideno utilizando un sistema de transferencia húmedo. Las membranas se lavaron en la leche desnatada 5% en tampón fosfato salino más 0,05% de Tween 20 (PBST) durante 2 h con el fin de bloquear los sitios de unión a proteínas no específicos en la membrana. La inmunotransferencia se realizó usando anticuerpos monoclonales para Ches1 y CDK2 (Sigma y Cell Signaling Technology) a una dilución de 1:1000 en tampón Tris leche sin grasa. A continuación, la membrana se lavó en PBST, se sondearon con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Amersham Life Sciences) a una dilución de 1:5000, desarrollada usando un kit ECL Western Blotting (Pierce), y se expone a los rayos X película (Kodak)
Construcción de plásmidos
sobreexpresión o la inhibición de miR-miR-574-5p mediada por retrovirus se generó sobre la base de pMX vector (Invitrogen) como se describe anteriormente [21] -. [ ,,,0],23]. Brevemente, el vector de expresión de miR-574-5p se construyó ligando los fragmentos de reacción en cadena de la polimerasa con EcoRI /XhoI (PCR) con el vector retroviral pMX-puro. MiR-retroviral 574-5p vector "esponja" se construyó utilizando la ligadura de dos copias de los oligonucleótidos complementarios miR-574-5p y vectores PMX-puro. Secuencia que codifica mutante miR-574-5p fue clonado en el mismo vector y se utiliza como el vector de control. El virus se produjo y las células diana fueron infectados de acuerdo con el manual del usuario. Se llevó a cabo la generación de Ches1 plásmido de longitud completa tal como se describe anteriormente [24].
informador de luciferasa y Mutagénesis Ensayo
El indicador de luciferasa y ensayo de mutagénesis se realizaron como se describe anteriormente [20]. imita miR-574-5p o su control fue co-transfectaron en células 95D con un único plásmido informe (PMIR-Informe de plásmidos; Ambion) que contienen ya sea la de tipo salvaje o mutantes, 3 'UTR de Ches1 que se generó usando Quickchange dirigida al sitio Mutagénesis Kit (Stratagene). Después de 48 horas de la transfección, luciérnaga y Renilla luciferase actividades se midieron utilizando el sistema de ensayo dual reportero de luciferasa (Promega).
Evaluación del crecimiento del tumor in vivo
Evaluación del crecimiento del tumor se realizó como se se ha descrito previamente con modificaciones menores [3]. Brevemente, se inyectaron por vía subcutánea ratones BALB /c nu /nu (6-8 semanas de edad) con 0,2 ml de una suspensión de una sola célula que contiene 2 × 10
6 células tumorales y se mantienen en cabinas de flujo laminar en condiciones libres de patógenos específicos . Los tumores se midieron cada 5 días después de la exposición del tumor mediante pie de rey. Los volúmenes tumorales se obtienen multiplicando la longitud medida por el ancho medido por el promedio calculado de estos valores medidos y se presentan como la media ± SEM.
Análisis estadísticos
analiza
estadístico de los datos se realizado con la ayuda de programas de análisis de software SPSS12.0. La evaluación estadística se realizó mediante análisis de dos vías de la varianza (ANOVA, p & lt; 0,05). utilizando el programa PRISM 4.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE.UU.)
Resultados
TLR9 de señalización regulada hasta la expresión de miR-574-5p en células de cáncer de pulmón humano
en primer lugar confirmó la progresión tumoral mayor de cáncer de pulmón humano inducida por la señalización de TLR9, y encontramos que el tratamiento de CpG ODN de células 95D significativamente mejorado su proliferación in vitro y la progresión tumoral in vivo (Figura 1A y B, p & lt; 0,05). Para dilucidar el papel potencial de miR-574-5p en los efectos de TLR9 de señalización en la progresión de las células de cáncer de pulmón humano, hemos validado nuestra plataforma de microarrays anterior y se evaluó la expresión de miR-95D 574-5p en células con o sin CpG ODN tratamiento por análisis de PCR en tiempo real. Hemos puesto de manifiesto que la expresión de miR-574-5p fue de hecho significativamente elevado en las células después del tratamiento 95D CpG ODN en una forma dependiente de la dosis y del tiempo (Figura 1C y D, p & lt; 0,05). A fin de confirmar que se trataba de TLR9 /señalización MyD88 que confiere la expresión regulada en marcha de miR-574-5p, la cloroquina inhibidor de la señalización TLR9 y el péptido inhibidor MyD88 se aplicaron a bloquear su vía de señalización. Se encontró que tanto la cloroquina y péptido inhibidor MyD88 podrían abrogar significativamente la elevada expresión de miR-574-5p inducida por CpG ODN en células 95D en una forma dependiente de la dosis (Figura 1E y F, p & lt; 0,05). Nuestros resultados demuestran claramente que TLR9 señalización efectiva elevó la expresión de miR-574-5p en células de cáncer de pulmón humano.
El descenso de regulación de miR-574-5p abrogó el la progresión tumoral mejorada inducida por TLR9 de señalización en el pulmón humano cáncer
Para dilucidar el papel potencial de miR-574-5p en la progresión tumoral mayor de cáncer de pulmón humano inducida por la señalización de TLR9, 95D células fueron transfectadas con miR-574-5p inhibidor y después se estimularon con CpG ODN. Como se muestra en la Figura 2A, se encontró que la transfección con inhibidor de miR-574-5p reduce eficazmente su expresión en células 95D (p & lt; 0,05). En particular, hemos demostrado que la transfección con el inhibidor de miR-574-5p inhibió significativamente la proliferación de células 95D inducida por ODN CpG (Figura 2B, p & lt; 0,5). Para confirmar aún más este fenómeno in vivo, esponja de miR-574-5p se construyó para regular a la baja la expresión de miR-574-5p. El nivel de caída funcional de miR-574-5p se ensayó mediante un ensayo de indicador, en el que el sitio de miR-574-5p de unión predicho se introdujo en el 3 'UTR de un indicador de luciferasa. Se encontró que la transfección de células 95D con la esponja miR-574-5p causado aumento significativo en la actividad de luciferasa en comparación con la esponja de control (Figura 2C, p & lt; 0,05), lo que sugiere que se logró una inhibición eficaz de la actividad de miR-574-5p. Así, los grupos de ratones desnudos fueron desafiados con 95D células que expresan de forma estable esponja miR-574-5p, y luego se estimularon con CpG ODN. Es de destacar, puso de manifiesto que la baja regulación de miR-574-5p en células 95D inhibió significativamente la progresión de su mejorada inducida por TLR9 señalización en vivo (Figura 2D, p & lt; 0,05). Consistentemente, se encontró que la baja regulación de miR-574-5p también prolongó significativamente el tiempo de supervivencia de ratones desnudos portadores de tumores (Figura 2E,
p Hotel & lt; 0,05). La combinación de estos datos sugiere que el miR-574-5p confirió el efecto de TLR9 de señalización en la progresión tumoral de las células cancerosas de pulmón humano.
miR-574-5p promovió la progresión del tumor de células de cáncer de pulmón humano
Para caracterizar el mecanismo subyacente a la función central de miR-574-5p en la progresión tumoral mejorada inducida por la señalización de TLR9, evaluamos aún más el efecto directo de miR-574-5p sobre el crecimiento de las células 95D in vitro e in vivo. Como se muestra en la Figura 3A, se encontró que la sobre expresión de miR-574-5p en 95D células dio como resultado su proliferación elevada in vitro (p & lt; 0,05). Por ello, la reducción de la expresión de miR-95D 574-5p en células deficientes su proliferación in vitro (Figura 3B, p & lt; 0,05). A fin de confirmar estos resultados in vivo, ratones desnudos fueron desafiados con células 95D que fueron transfectadas establemente con el miR-574-5p vector de expresión o vector de esponja de miR-574-5p respectivamente. Se encontró que sobre-expresado miR-574-5p aumentó significativamente la progresión del tumor de 95D células in vivo, acompañado de un tiempo de reducción de la supervivencia de ratones portadores de tumor (Figura 3C y D, p & lt; 0,05). Por ello, la baja regulación de miR-574-5p en células 95D abrogó su crecimiento in vivo y prolongó el tiempo de supervivencia de ratones portadores de tumores (Figura 3E y F, p & lt; 0,05). Estos resultados sugieren que el miR-574-5p fue un factor importante asociado con la progresión tumoral mejorada de cáncer de pulmón humano.
Ches1 era un objetivo directo de miR-574-5p para promover la progresión tumoral del cáncer de pulmón humano
Para comprender mejor el efecto de miR-574-5p en la regulación de la progresión del tumor de células de cáncer de pulmón humano, que predijo los objetivos de miR-574-5p por programas de predicción incluyendo TargetScan y Miranda, y se seleccionaron 10 que incluye posible objetivo CALCOCO1, RFX4, CD96, CHEX1, FOXI2, DGKG, ZNF589, ZDHHC14, CCDC88C, CLVS1 para el análisis de PCR en tiempo real. Hemos encontrado que la expresión de Ches1 exhibió una elevación dramáticamente en 95D células transfectadas con inhibidor de miR-574-5p (Figura 4A, p & lt; 0,05). Para confirmar este resultado, se realizó un western blot para detectar la expresión de Ches1 en 95D células transfectadas con inhibidor de miR-574-5p. Se encontró que el nivel de proteína de Ches1 se incrementó significativamente por la transfección con inhibidor de miR-95D 574-5p en las células (Figura 4B, p & lt; 0,05). A continuación realizó un ensayo indicador de luciferasa para validar la relación regulatoria potencial. Se observó un efecto significativamente negativo sobre la actividad de la luciferasa en el 3 'UTR de Ches1 en presencia de miR-574-5p, tal represión desapareció cuando el sitio de destino previsto en el 3' UTR de Ches1 fue mutado (Figura 4C, p & lt; 0,05 ). Para detectar adicionalmente el papel potencial de Ches1 en TLR9 señalización mejorado crecimiento de las células 95D, 95D células fueron transfectadas con el vector de expresión Ches1 y después se estimularon con CpG ODN. Como se muestra en la Figura 4D, se encontró que la transfección con el vector de expresión Ches1 aumentó significativamente su expresión en células 95D (p & lt; 0,05). En particular, se encontró que la transfección de imita miR-574-5p no para mejorar la proliferación de 95D células que fueron co-transfectadas con el vector de expresión Ches1 (Figura 4E, p & lt; 0,05). Demostramos además que la transfección con el vector de expresión Ches1 abrogada eficazmente el tumor efecto promotor de miR-574-5p in vivo (Figura 4F, p & lt; 0,05). Por otra parte, que reveló que la regulación de Ches1 efectivamente inhibe la señalización TLR9 mejorado proliferación de células 95D (Figura 4G, p & lt; 0,05). Consistentemente, se encontró que la sobre expresión de Ches1 en 95D células deterioradas efectivamente su progresión tumoral mejorada inducida por TLR9 señalización en ratones desnudos (Figura 4H, p & lt; 0,05). Estos resultados indicaron que Ches1 era un objetivo de buena fe de miR-574-5p en la regulación de la señalización TLR9 progresión tumoral mayor de cáncer de pulmón humano.
La sobreexpresión de la Ches1 inhibido entrada del ciclo celular de las células cancerosas de pulmón humano
para elucidar el papel potencial de Ches1 en la progresión del tumor de células de cáncer de pulmón humano, se detectaron 95D células transfectadas de manera estable con el vector de expresión Ches1 para su proliferación in vitro y la progresión en ratones desnudos in vivo. Hemos demostrado que la sobre expresión de Ches1 inhibió significativamente la proliferación de células 95D (Figura 5A, P & lt; 0,05). Consistentemente, se encontró que la progresión del tumor de 95D células transfectadas con vector de expresión Ches1 fue dramáticamente mejorado que el grupo control (Figura 5B, p & lt; 0,05). Estos resultados sugirieron que Ches1 era un jugador inhibitorio en el crecimiento de células cancerosas de pulmón humano. Para caracterizar adicionalmente el mecanismo subyacente, analizamos el posible efecto de Ches1 en el ciclo de la apoptosis y de células de células de cáncer de pulmón humano. 95D células transfectadas de manera estable con el vector de expresión Ches1 o el vector de control se sincronizan primero en la fase de G0 mediante la sustitución del medio de cultivo con medio libre de suero, y luego continuamente cultivaron y se recogieron después de 24 horas. Se encontró que la tasa de apoptosis de 95D células transfectadas con vector de expresión Ches1 era baja y, en general comparable con el grupo de control (Figura 5C). En contraste, el porcentaje de células transfectadas con 95D Ches1 vector expresson en la etapa /G1 Go fue significativamente mayor que los del grupo de control (Figura 5D, p & lt; 0,05). Además, también reveló la reducción de la expresión de CDK2 en 95D células después de la transfección con el vector de expresión Ches1 (Figura 5E, p & lt; 0,05), lo que podría explicar en parte nuestros resultados y fue consistente con nuestro estudio anterior que demuestra que la sobre regulación de CDK2 fue crítico TLR9 de señalización para estimular la proliferación y la entrada del ciclo celular de las células cancerosas de pulmón humano [4].
la expresión de miR-574-5p se correlacionó positivamente con TLR9 y la inversa correlacionadas con Ches1 clínicos de cáncer en pacientes pulmonares
Para investigar más a fondo el papel potencial de miR-574-5p en el efecto de TLR9 señalización en pacientes con cáncer de pulmón humano, hemos detectado la relación entre la expresión de miR-574-5p y TLR9 en pacientes con CPNM clínicos. Como se muestra en la Figura 6A, los niveles de expresión de TLR9 y miR-574-5p fueron más altos en el tejido del cáncer de pulmón en comparación con el tejido adyacente del tumor a partir de muestras de cáncer de pulmón clínicos (p & lt; 0,05). En contraste, la expresión de Ches1 fue significativamente menor en los tejidos tumorales en comparación con tejidos adyacentes (Figura 6A, p & lt; 0,05). Es importante destacar que se encontró que el nivel de expresión de miR-574-5p se correlacionó positivamente con la expresión de TLR9 en los tejidos tumorales clínicos (Figura 6B, p & lt; 0,05). Además, se reveló que la expresión de miR-574-5p se correlacionó inversamente con el nivel de expresión de Ches1 en los tejidos tumorales (Figura 6C, p & lt; 0,05). Por otra parte, la expresión de TLR9 fue también inversamente correlacionado con el nivel de expresión de Ches1 en los tejidos tumorales (Figura 6D, p & lt; 0,05). Estos resultados estuvieron en línea con nuestros datos anteriores que demostraban que Ches1 era un objetivo predominante de miR-574-5p para conferir la progresión tumoral mejorada inducida por TLR9 de señalización en el cáncer de pulmón humano.
Discusión
en los últimos años, los datos sugirieron que la acumulación de TLRs se expresaron funcional en las células tumorales y participan en la progresión tumoral [4] - [8]. Hemos demostrado anteriormente que TLR9 de señalización podría mejorar la progresión del tumor de células de cáncer de pulmón humano in vitro e in vivo [3], [4], [9] - [11]. Aquí hemos ampliado nuestro estudio anterior, demostrando que la regulación de miR-574-5p confirió la progresión tumoral mejorada inducida por TLR9 de señalización en células de cáncer de pulmón humano. Nuestros hallazgos sugieren que el miR-574-5p era un jugador importante en la señalización de TLR9 y la biología tumoral
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En este estudio, se encontró que TLR9 señalización significativamente elevado la expresión de miR-95D 574-5p en las células, lo cual era coherente con nuestro estudio anterior [19]. Para abordar el papel potencial de miR-574-5p en TLR9 señalización mejorada progresión de las células de cáncer de pulmón humano, se evaluó el efecto de la baja regulación de miR-574-5p en TLR9 señalización mejorada progresión de las células 95D y encontramos que la baja regulación de miR-574-5p podría, obviamente, reducir la progresión de la 95D células in vitro e in vivo. Nuestros datos sugieren que intrínseca miR-574-5p podría contribuir a la progresión de las células de cáncer de pulmón humano. De hecho, nuestro estudio sucesiva mostró que miR-574-5p podría promover la progresión de las células de cáncer de pulmón humano, lo que indica que la expresión sostenida de miR-574-5p fue fundamental para la progresión de las células de cáncer de pulmón humano.