Extracto
La hipoxia juega un papel importante en la resistencia de las células tumorales a la quimioterapia. Sin embargo, los mecanismos exactos que subyacen a este proceso no se conocen bien. Por otra parte, de acuerdo con las líneas de células, la hipoxia influye de manera diferente la muerte celular. El estudio de los efectos de la hipoxia en la apoptosis inducida por fármacos quimioterapéuticos 5 en 7 tipos celulares de cáncer mostró que la hipoxia en general inhibió la apoptosis inducida por fármacos. En la mayoría de los casos, el efecto de la hipoxia fue el mismo para todos los medicamentos en un tipo de célula. a continuación, se investigó el perfil de expresión de 93 genes implicados en la apoptosis, así como el nivel de proteína de Bcl-2 proteínas de la familia. En las células HepG2 que están fuertemente protegidos contra la muerte celular por hipoxia, hipoxia disminuye la abundancia de casi todos los pro-apoptóticos proteínas de la familia Bcl-2, mientras que ninguno de ellos se redujo en las células A549 que no están protegidos contra la muerte celular por hipoxia. En las células HepG2, hipoxia disminuyó NOXA y abundancia BAD y modificó la movilidad electroforética de BIM
EL. BIM y NOXA son importantes mediadores de la muerte celular inducida por etopósido en células HepG2 y la modificación inducida por hipoxia de estas proteínas de abundancia o después de la traducción modificaciones explicar en parte la quimio-resistencia. Por último, la modulación de la abundancia y /o de las modificaciones post-traduccionales de la mayoría de las proteínas de la familia Bcl-2 por la hipoxia implica p53-dependiente y vías -independiente y es dependiente del tipo de célula. Una mejor comprensión de estas variaciones de célula a célula es crucial para superar la resistencia inducida por hipoxia y para mejorar la terapia del cáncer
Visto:. Sermeus A, M Genin, Maincent A, Fransolet M, Notte A, Leclere L, et al. La modulación de la apoptosis y la familia Bcl-2 proteínas (2012) inducida por hipoxia en diferentes tipos de células cancerosas. PLoS ONE 7 (11): e47519. doi: 10.1371 /journal.pone.0047519
Editor: Elad Katz, de la Universidad de Edimburgo, Reino Unido
Recibido: 4 de Junio, 2012; Aceptado: 12 de septiembre de 2012; Publicado: 5 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Sermeus et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. AS y AN son Investigador del FNRS (Fonds de Investigación Científica, Bélgica). MG y LL son apoyados por FRIA (Fonds pour la Recherche et dans l'Industrie de l'Agricultura, Bélgica). HR es beneficiario de una subvención FNRS-Télévie. Este artículo presenta los resultados del Programa Interuniversitario belga sobre polos de atracción iniciado por el Estado belga, la Oficina del Primer Ministro, Programación Ciencia Política. La responsabilidad es asumida por sus autores. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una de las principales causas de muerte en los países desarrollados. Tratamientos a menudo incluyen el uso de quimioterapias, pero la resistencia a las drogas es una causa frecuente de fracaso del tratamiento y la recaída. La mayoría de los fármacos quimioterapéuticos inducen la muerte celular mediante la activación de la apoptosis. La apoptosis está regulada por proteínas de la (2-linfoma de células B) de la familia BCL-2 que actúan principalmente a nivel mitocondrial. Esta familia de proteínas se puede subdividir en tres categorías de acuerdo con la función y la estructura de las proteínas [1]. En primer lugar, las proteínas BAX-como, como BAX (BCL-2 asociada × proteína) y BAK (BCL-2 homóloga antagonista /asesino), son factores de muerte. Una vez activado, que oligomerise en las mitocondrias e inducir la permeabilización de la membrana mitocondrial externa, lo que provoca la muerte celular. Las proteínas BCL-2-al igual que, como Bcl-2, Bcl-XL (linfoma de células B-extra grande), Bcl-w y MCL-1 (leucemia de células mieloides 1), son factores de supervivencia. Ellos forman heterodímeros con BAX /BAK e inhiben su acción. Por último, el BH3 (Bcl-2 dominio de homología 3) -sólo proteínas, tales como BID (BH3-interacción agonista de la muerte de dominio), BAD (BCL-2-antagonista de la muerte celular), BIM (BCL-2-mediador de la interacción celular muerte), BIK (BCL-2 killer interactuar), PUMA (p53 modulador upregulated de apoptosis) y NOXA, inducir la apoptosis mediante la neutralización de las moléculas antiapoptóticas BCL-2-como y, para algunos de ellos, mediante la activación directamente BAX /BAK. En las células sanas, BH3-only proteínas no están presentes o mantenerse inactivos o secuestrado. Siguiendo las señales pro-apoptóticos, se vuelven transcripcionalmente regulada al alza y /o después de la traducción modificada (y /o relocalised) para ganar su función proapoptótico completo [1], [2].
Una de las principales causas de la resistencia a la quimioterapia apoptosis inducida es la mutación p53. p53 es de hecho un jugador central para la inducción de la apoptosis en células estresadas [3], [4] Otra causa bien conocida de la resistencia es la hipoxia tumoral [5]. Los efectos de la hipoxia en las células de cáncer son el tipo celular dependiente y difieren de acuerdo con la intensidad y la duración de la falta de O
2. hipoxia severa y prolongada puede iniciar la apoptosis o necrosis, mientras que la hipoxia leve es protectora [6], [7]. De hecho, la hipoxia leve interfiere con varios componentes de la vía apoptótica en la transcripción, así como en el nivel post-traduccional.
Los resultados previos de nuestro grupo mostró que la hipoxia protege a las células tumorales de la apoptosis inducida por agentes quimioterapéuticos. La hipoxia protege a las células HepG2 contra la apoptosis inducida por etopósido-así como las células MDA-MB231 contra la apoptosis paclitaxel inducida por [8], [9], [10]. Sin embargo, en otros tipos de células, la hipoxia puede no tener efecto o incluso agravar la apoptosis inducida por agentes quimioterapéuticos. Es por ejemplo el caso para la apoptosis inducida por etopósido-de A549 y las células MCF-7, así como para la apoptosis inducida por epirubicina de las células MDA-MB231 [8], [10]. Estos resultados también han subrayado que las respuestas de células a la hipoxia es muy complejo, que incluye las diferentes vías de transducción de señales, así como varios factores de transcripción. En particular, el factor de transcripción p53 parece jugar un papel importante en el comportamiento de las células en condiciones de hipoxia [8]. El objetivo de este trabajo es entender cómo la hipoxia puede influir de manera diferente la apoptosis inducida por el fármaco quimioterapéutico en las células cancerosas. Por lo tanto, lo primero que ampliamos nuestras observaciones anteriores utilizando líneas celulares de cáncer de 7, procedentes de diversos órganos y que tienen diferente estado de p53, expuestos a 5 fármacos inductores de apoptosis utilizados en la quimioterapia que se dirigen a diferentes vías celulares. En la mayoría de los casos, la hipoxia en parte impedido la muerte celular y el efecto de la hipoxia fue el mismo para todos los medicamentos en un tipo de célula. En segundo lugar, se observó que la hipoxia modula la abundancia de la mayoría de las proteínas de la familia Bcl-2 de una manera dependiente del tipo de célula. En tercer lugar, en las células HepG2 que están protegidos por la hipoxia contra la muerte celular inducida por etopósido, se observó una disminución en el BAD y NOXA nivel de proteínas, así como un cambio en la movilidad electroforética de BIM
EL (BIM extra largo) en hipoxia células incubadas. Los resultados de estudios de invalidación sugieren que la pérdida combinada de BIM y NOXA durante la hipoxia, al menos en parte, representaba la quimiorresistencia.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y la hipoxia incubación
Human células HepG2 de hepatoma, células humanas de carcinoma de pulmón A549, adenocarcinoma de mama humano células MDA-MB231, células de hepatoma Hep 3B humanas, células de sarcoma U2OS osteogénicos humanos, células HT-29 adenocarcinoma de colon humano y células PC-3 adenocarcinoma de próstata humano (ATCC) se mantuvieron en cultura en 75 cm
2 frascos de poliestireno (Costar), respectivamente, con D-MEM (bajo nivel de glucosa) (Gibco), MEM (Gibco), RPMI 1640 (Gibco), RPMI 1640 (Gibco) que contiene la penicilina 50 U /ml y 50 mg /ml de estreptomicina (Gibco), medio 5A de Mc Coy (Gibco), RPMI 1640 (Gibco) y medio de F12 Kaighn (Gibco) que contiene 10% de FCS y se incubaron en una atmósfera que contiene 5% de CO
2.
Para los experimentos de hipoxia, las células fueron incubadas en suero libre de CO
medio 2-independiente (Invitrogen) suplementado con 0,5 mM de L-glutamina (Sigma) con o sin etopósido (Sigma), metotrexato (Sigma), paclitaxel (Molecular Probes), cisplatino (Sigma) o camptotecina (Sigma) durante 16 horas. La incubación en condiciones de hipoxia se llevó a cabo en incubadoras caseras que contienen un 99% de N
2 y 1% de O
2. El nivel de la hipoxia en el medio en nuestras condiciones experimentales es 10 mm Hg de oxígeno disuelto en el medio. Este nivel de hipoxia se consigue después de aproximadamente 10 minutos de incubación. PO
2 nivel se midió utilizando un medidor de oxígeno disuelto (inoLab Oxi 730) equipado con una sonda Cellox 325. las células de control de normoxia se incubaron en las mismas condiciones pero en atmósfera normal (21% de O
2)
siRNA transfección
siGENOME SmartPool humana (Dharmacon, que se utiliza en el 50 nM). BCL2L11 ( BIM, M-004383-02), PMAIP1 (NOXA, M-005275-03), BAD (M-003870-02) o TP53 (M-003329-03) se transfectaron con el reactivo de transfección DharmaFECT1 (Dharmacon, que se utiliza en una 1:500 dilución). Cuando la combinación de BIM y NOXA siRNA, cada siRNA se utilizó a 25 nM. El siGENOME RISC-Free Control de siRNA (D-001220-01, Dharmacon, que se utiliza en el 50 nM) o siGENOME no director siRNA piscina#1 (D-001206-13, Dharmacon, que se utiliza en el 50 nM) se utilizaron como controles negativos. Las células se incubaron durante 24 horas con medio de transfección y luego el medio se reemplazó por medio fresco con 10% de FCS. 6 horas más tarde (o 30 horas más tarde para BIM siRNA), las células se incubaron en condiciones de hipoxia o normoxia con agentes quimioterapéuticos o no.
Fraccionamiento subcelular
Las células, se siembran en 75-cm
2 frascos, se recogieron en sacarosa M /4 y se homogeneizaron por 3 golpes de un émbolo B en un Dounce. El homogeneizado se centrifuga 10 minutos a 1418
g gratis (Labofuge 400R Heraeus Instruments). El sobrenadante se recuperó y se centrifugó a 81.085
g
(Beckman L7-35, rotor 50 Ti) para una duración dependiente del volumen. El sedimento se resuspendió en sacarosa M /4 y nombrado la fracción MLP. El sobrenadante se concentró por centrifugación en Amicon Ultra-4 tubos (Millipore) y el nombre de la fracción S. Todas las muestras se homogeneizaron finalmente por sonicación.
Se realizó
Western Blot Analysis
La extracción de proteínas como se describe en [9]. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 15%, en 4 a 12% en geles de NuPAGE Bis-Tris con tampón de MES (Invitrogen) o en 3-8% en geles NuPAGE Tris-acetato (Invitrogen) y después se transfirieron a una membrana de PVDF (Hybond-P, Amersham para la detección de quimioluminiscencia o Immobilon-FL, Millipore para la detección de fluorescencia). Quimioluminiscencia detección se realizó como se describe en [11] el uso de incubación durante la noche con anticuerpos primarios específicos. Para la detección de fluorescencia, las membranas se bloquearon 1 hora a temperatura ambiente en tampón de bloqueo Odyssey (LI-COR) y luego durante la noche a 4 ° C en tampón de bloqueo Odyssey con 0,1% de Tween que contiene un anticuerpo específico. Después de 4 × 5 minutos lavados en PBS-Tween 0,1%, la incubación con el anticuerpo secundario (de cabra anti-conejo o anti-ratón de anticuerpo marcado con IRDye, LI-COR, 1:10,000 dilución) se realizó durante 1 hora en Odyssey bloqueo tampón con 0,1% de Tween seguido de 4 lavados de 5 minutos en PBS-Tween y 2 lavados en PBS. La membrana se secó 1 hora a 37 ° C y escanea utilizando el sistema de imágenes por infrarrojos Odyssey (LI-COR).
La tinción de inmunofluorescencia
células HepG2 fueron sembradas a 40.000 células /pocillo en la cubierta de cristal diapositivas en placas de 24 pocillos. Después de la incubación con o sin etopósido o paclitaxel, se realizó la tinción de inmunofluorescencia como se describe en [11]. El anticuerpo primario para la tinción de alfa-tubulina era de ratón anti-alfa-tubulina (# T5186 Sigma) (dilución 1/100). Alexa Fluor-647-anti-ratón conjugado anticuerpo IgG (Molecular Probes) se utilizó a una dilución de 1 /1.000.
caspasa-3/7 Ensayo de actividad
El sustrato fluorogénico Ac-DEVD-AFC (BD Pharmingen) se utilizó para medir la actividad de caspasa-3/7 de acuerdo con [12]. Los extractos celulares se prepararon como se describe en [13]. Las células fueron sembradas en 25-cm
2 frascos. El ensayo para la actividad de caspasa-3/7 se realizó de acuerdo con [8] utilizando 20 g de extractos.
lactato deshidrogenasa Ensayo de liberación de
lactato deshidrogenasa (LDH) de liberación se midió con el "Citotoxicidad Kit de detección "de Roche Applied Science como se describe en [9]. Los medios de cultivo de células incubadas se eliminaron y se centrifugó para sedimentar los fragmentos de células y cuerpos apoptóticos. Con el fin de lisar las células, se añadió Triton X100 (Merck) al 10% en PBS en este sedimento, así como en las células permanezcan unidas en la parte inferior de los pocillos. El porcentaje de liberación de LDH se calculó como sigue: [actividad de la LDH en el medio (1) + LDH actividad de fragmentos de células y cuerpos apoptóticos (2)] /[(1) + (2) + LDH actividad de las células restantes en los pozos].
transfección transitoria y Luciferase Assay
transfección celular se realizó en placas de 24 pocillos (50.000 células por pocillo para las células HepG2 y MDA-MB231; 30.000 para las células A549, y 40000 para células Hep 3B) con el reactivo SuperFect (Qiagen). 923 ng (1385 ng para las células MDA-MB231) del plásmido reportero pGL3- (PGK-HRE6) -tk-luc, que contiene 6 HRE elementos cis del gen de PGK unido al promotor basal de timidina quinasa y a la luciferasa de luciérnaga gen [14], se co-transfectaron con 577 ng (115 ng para las células MDA-MB231) de vector normalización (pCMVβ vector que codifica para la β-galactosidasa, Clontech) en medio sin suero durante 6 horas (o 3 horas para células Hep 3B antes de sustituir el medio con medio fresco). Después, las células se incubaron en condiciones de hipoxia o normoxia durante 16 horas. Después de la incubación, las células se lisaron en tampón de lisis pasiva (Promega) y β-galactosidasa se ensayó en paralelo a la actividad de luciferasa de luciérnaga, se ensayaron usando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega).
Taqman Low Density Arrays
Después de la incubación, el ARN total fue extraído utilizando el reactivo TRI Solución (Applied Biosystems). ARNm contenido en 2 g de ARN total fue transcrito invertir utilizando la "alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit" de Applied Biosystems de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 100 ng de RNA total retrotranscribed en 50 l se mezclaron luego con 50 l de la "Taqman PCR Universal Master Mix" (Applied Biosystems) y se carga en uno de los 8 puertos de llenado de la matriz de microfluidos. "Panel de apoptosis humano TLDA" son tarjetas de microfluidos 384 pocillos que contienen ensayos para 96 genes humanos. Permiten realizar 96 reacciones de PCR en tiempo real de forma simultánea para 4 muestras. nivel de expresión de ARNm se cuantificó utilizando el método de ciclo umbral con el gen 18S como referencia.
RT en tiempo real-PCR para ARNm Cuantificación
Después de la incubación, el ARN total fue extraído utilizando el reactivo TRI Solución (Applied Biosystems). ARNm contenido en 2 g de ARN total fue de transcripción inversa utilizando transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). primers secuencias directa e inversa están disponibles en el cuadro S1 y fueron diseñados utilizando el software Primer Express 1.5 (Applied Biosystems). ensayos de reacción de amplificación contenía 1 × SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystem) y cebadores (Applied Biosystems, 300 nM). RPL13A se utilizó como gen de referencia para la normalización y el nivel de expresión del ARNm se cuantificó utilizando el método de ciclo umbral.
Zona de juego y análisis estadísticos
Heatmaps se han generado con los datos transformados en logaritmo en base 2 de la resultados para TDLA (n = 1) y de los medios de tres valores de QRT-PCR resultados. Los análisis estadísticos se realizaron con ANOVA y Tukey 1 de pruebas de comparación múltiple utilizando GraphPad Prism.
Resultados
La hipoxia tiene diferentes efectos sobre la muerte celular inducida por fármacos en diferentes tipos celulares
con el fin de obtener una mayor comprensión de los mecanismos iniciados por hipoxia que conducen a la resistencia de las células del cáncer, hemos ampliado nuestras observaciones anteriores que utilizan otras líneas celulares de cáncer procedentes de diversos órganos y que tienen diferente estado de p53 y otros fármacos quimioterapéuticos inductores de apoptosis que se dirigen a diferentes vías celulares . Las líneas celulares utilizadas son HepG2 (células p53 de tipo salvaje de hepatoma), A549 (p53-tipo salvaje células de carcinoma de pulmón), U2-OS (células de osteosarcoma p53 de tipo salvaje), MDA-MB231 (células p53 adenocarcinoma mutante de mama), HT-29 (p53 células de adenocarcinoma de colon mutantes), Hep 3B (células de hepatoma p53 nula), y PC-3 (p53 nula células de adenocarcinoma de próstata) células. Los agentes quimioterapéuticos seleccionados son etopósido (un inhibidor de la topoisomerasa II), metotrexato (un inhibidor de la síntesis de ADN y ARN), paclitaxel (un inhibidor de la dinámica de los microtúbulos), cisplatino (un agente alquilante) y camptotecina (un inhibidor de topoisomerasa I).
en primer lugar, la concentración de fármaco a utilizar en cada tipo de célula fue elegido por el ensayo de la caspasa-3/7 actividad después de 16 horas de incubación con los fármacos. En cada caso, se eligió una concentración de la inducción de apoptosis moderado. Para los agentes que inducen ninguna actividad caspasa, su toxicidad global se evaluó mediante la medición de la lactato deshidrogenasa (LDH) liberar 40 horas después de la incubación con los agentes. Una vez que se eligieron las concentraciones, el efecto de la hipoxia (1% O
2) sobre la muerte celular inducida por cada agente en cada tipo de célula se controló por las dos mismas técnicas (Figura 1).
HepG2 , A549, U2OS, MDA-MB231, HT-29, Hep3B y células PC-3 se incubaron bajo normoxia (21% o
2) o hipoxia (1% o
2) en ausencia (CTL) o presencia de etopósido (ETO), paclitaxel (TAX), cisplatino (CEI) o camptotecina (CPT) de 16 (a, C, E, G, J) o 40 horas (B, D, F, H, I, K) . La concentración utilizada para cada molécula se indica en los gráficos (en M). (A, C, E, G, J) la actividad de la caspasa-3/7 se ensayó midiendo la fluorescencia de libre AFC liberado de la escisión del sustrato de la caspasa-3/7 específico Ac-DEVD-AFC. Los resultados se expresan en unidades fluorescentes relativas (RFU) como media ± 1 SD (n = 3). (B, D, F, H, I, K) la liberación de LDH se evaluó. Los resultados se presentan en porcentajes como media ± 1 SD (n = 3). El análisis estadístico (A-K) se llevó a cabo con ANOVA 1. ns: no significativo; *: P & lt; 0,05; **: P & lt; 0,01; ***: P & lt; 0,001. Símbolos encima de una columna de normoxia son una comparación con el control de normoxia y los símbolos por encima de una columna de hipoxia son una comparación con la condición de normoxia correspondiente (con el mismo fármaco).
Hemos observado que, en general, la p53 mutado o células nulas son más difíciles de matar que las células de tipo salvaje de p53. En la mayoría de los casos, el efecto de la hipoxia sobre la muerte celular fue el mismo para todas las moléculas en un tipo de célula. Sin embargo, este efecto varía de acuerdo con el tipo de célula. Hemos observado también que la hipoxia tenía más a menudo un efecto protector contra la muerte celular que un efecto agravante. Por ejemplo, la hipoxia protegido células HepG2 y MDA-MB231 contra la muerte celular inducida por todas las moléculas ensayadas, mientras que se observó ningún efecto o un agravamiento de la muerte celular inducida por el fármaco por la hipoxia en A549 y células Hep 3B. Por lo tanto, la hipoxia puede proteger p53 de tipo salvaje, así como las células p53 mutado. En conjunto, estos resultados son generados de una matriz de datos sobre el efecto de la hipoxia sobre la apoptosis inducida por 5 moléculas en 7 tipos de células (Tabla 1). Los resultados mostraron que el efecto de la hipoxia es diferente según el tipo de célula pero constante por todos los medicamentos en un único tipo de célula. A lo mejor de nuestro conocimiento, esta observación nunca se ha hecho antes.
perfil de expresión de ARNm y proteínas implicadas en la apoptosis en diferentes tipos celulares
Con el fin de entender por qué la hipoxia protegida algunas líneas de células contra la muerte inducida por fármacos, pero no otros, se seleccionaron cuatro líneas de células que albergan diferentes estados de p53 y para los que el efecto de la hipoxia es diferente: las células HepG2, A549, MDA-MB231 y Hep 3B. Se utilizó etopósido como inductor de muerte celular, ya que es de gran alcance en las cuatro líneas celulares y su modo de acción es bien conocida. También se estudió el efecto de la hipoxia sobre la muerte inducida por paclitaxel de las células HepG2.
El etopósido y paclitaxel son activos y HIF-1 se activa en condiciones de hipoxia en todos los tipos celulares
se describe con frecuencia
La hipoxia para inhibir el efecto perjudicial de los agentes quimioterapéuticos [15]. Con el fin de comprobar si la hipoxia inhibe el daño del ADN etopósido inducida y /o estabilización de los microtúbulos paclitaxel inducida o si actúa en un nivel aguas abajo de los daños causados por el medicamento, ATM (ataxia telangiectasia mutada) fosforilación se estudió 1 hora después de la incubación etopósido y la morfología de las fibras de microtúbulos se estudió después de la exposición 16 horas paclitaxel. Etopósido desencadena la muerte celular mediante la inducción de roturas de doble hebra de ADN que conducen a la activación de ATM. Los resultados mostraron que de hecho indujo la fosforilación de ATM en los cuatro tipos de células. No se observó efecto de la hipoxia sobre la inducción de la P-ATM, incluso en las células HepG2 y MDA-MB231 en el que la hipoxia disminuyó el etopósido inducida por apoptosis (Figura 2A). En las células HepG2 que están protegidos por la hipoxia contra la muerte celular paclitaxel mediada, no parecía hipoxia para prevenir la formación de fibras de microtúbulos gruesas inducida por paclitaxel (Figura 2B y datos no presentados). En conjunto, estos resultados mostraron que la hipoxia protege a las células aguas abajo del daño inducido por fármacos.
(A) Efecto de la hipoxia, etopósido y paclitaxel sobre la abundancia y la fosforilación de ATM. células HepG2, A549, MDA-MB231 y Hep 3B se incubaron 1 hora bajo normoxia (N, 21% O
2) o hipoxia (H, 1% O
2) en presencia o no (CTL) de etopósido (ETO, 100 micras en células Hep 3B y 50 micras de los otros tipos de células) o paclitaxel (TAX, 10 mM) en las células HepG2. ATM y P-ATM se detectaron en extractos de proteínas nucleares por transferencia Western usando anticuerpos específicos. Un experimento representativo de tres. transferencias Western cultivados se presentan en la Figura S1. (B) Efecto de la hipoxia, etopósido y paclitaxel en los microtúbulos. células HepG2 fueron incubadas 16 horas bajo normoxia (21% O
2) o hipoxia (1% O
2) en presencia o no de etopósido (50 M) o paclitaxel (10 M). Después de la incubación, se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron para alfa-tubulina usando un anticuerpo específico. La observación se realizó con un microscopio confocal con un fotomultiplicador constante.
Muchos efectos protectores de la hipoxia son mediados por la HIF-1 (factor-1 inducible por hipoxia) factor de transcripción, que es un heterodímero compuesto de una subunidad expresada constitutivamente, HIF-1 beta, y una subunidad estabilizado sólo bajo condiciones de hipoxia, HIF-1 alfa [5]. Por ello, investigó si este factor se activó de manera efectiva por la hipoxia en las líneas celulares en las que la hipoxia no tiene un efecto protector (Figura 3). La hipoxia induce la acumulación de HIF-1 alfa pero etopósido disminuyó esta acumulación en las células A549, MDA-MB-231 y Hep3B. En las células HepG2, etopósido no tenía o un ligero efecto inhibidor de acuerdo con el experimento. Ya se ha observado el efecto de etopósido en el nivel de proteína HIF-1 alfa [16]. Como evaluado por el reportero de la luciferasa, HIF-1 era activo en cada tipo de células durante la hipoxia y esto se correlaciona con la abundancia de ARNm de dos de sus genes diana (LDHA y BNIP3).
HepG2, A549, MDA-MB231 y células Hep 3B se incubaron 16 horas bajo normoxia (N, 21% o
2) o hipoxia (H, 1% o
2) (AD) en presencia o no (CTL) de etopósido (ETO, 100 M en células Hep 3B y 50 mM en los otros tipos de células) o paclitaxel (TAX, 10 mM) en las células HepG2 (a, C, D). (A) HIF-1 alfa se detectó en extractos de células totales por transferencia Western utilizando un anticuerpo específico. Alfa-tubulina se utilizó como control de carga. Un experimento representativo de tres. transferencias Western cultivados se presentan en la Figura S1. (B) antes de la incubación, las células fueron co-transfectadas con el pGL3- (PGK-HRE6) plásmido reportero -tk-luc que codifica la luciferasa de luciérnaga y el plásmido pCMVß normalización. Los resultados se expresan como la media de la relación entre la actividad de luciferasa de luciérnaga y la actividad ß-galactosidasa ± 1 SD (n = 3). El análisis estadístico se realizó con ANOVA 1. ***: P & lt; 0,001. Los símbolos son una comparación entre las condiciones de normoxia e hipóxicas del mismo tipo celular. (C, D) Después de la incubación, se extrajo el ARN total, sometido a transcripción inversa y luego a la amplificación en presencia de SYBR Green y cebadores específicos para BNIP3 (c) o LDHA (D). RPL13A se utilizó como limpieza de genes para la normalización de datos. Los datos se dan en la tapa de la inducción como la media ± 1 SD (n = 3). El análisis estadístico se realizó con ANOVA 1. ns: no significativo; *: P & lt; 0,05; **: P & lt; 0,01; ***: P & lt; 0,001. Símbolos encima de las columnas de hipoxia son una comparación con la condición de normoxia correspondiente (con el mismo fármaco).
En conclusión, el hecho de que la hipoxia protege a las células HepG2 y MDA-MB231 contra la muerte, pero no A549 y Hep3B las células no se pueden explicar por una diferencia en el daño etoposide- o paclitaxel-inducido o en la activación de HIF-1.
perfil de expresión de los ARNm implicados en la apoptosis
los resultados de la Figura 2 sugieren que el diferencial efecto de la hipoxia sobre la muerte celular se produce aguas abajo de la inducción de daño celular. por tanto, la hipótesis de que la hipoxia influye en las vías de transducción de señales que desencadenan la apoptosis. Estas vías se depende en particular de p53 sino también de otros factores de transcripción. Así, los estudios de expresión génica se llevaron a cabo para encontrar genes cuya expresión está regulada diferencialmente por la hipoxia en las células protegidas en comparación con las células no protegidas. Se han usado Taqman Arrays de baja densidad (Applied Biosystems) que permiten el estudio de la abundancia de 93 mRNAs conocidos por estar implicados en el proceso de apoptosis (así como 3 mRNAs de limpieza). Los resultados se presentan como un mapa de calor en la Figura 4, mientras que los valores numéricos se proporcionan en la Tabla S2. Como era de esperar, se observó la inducción de genes HIF-1 objetivo (BNIP3, BNIP3L y GAPDH) después de 16 horas de hipoxia en los cuatro tipos de células. Se observó la inducción de genes diana p53 (Apaf-1, BAK1 y BAX) en HepG2 y células A549 después de 16 horas de incubación etopósido pero no en el p53 mutado (células MDA-MB231) o células null (células Hep 3B). El PMAIP1 gen diana p53 (NOXA) fue inducida por etopósido en todos los tipos de células. Se obtuvieron
Resultados El uso de "Panel TLDA humano Apoptosis" (Applied Biosystems) (TLDA). HepG2, A549, las células Hep 3B MDA-MB231 y se incubaron 16 horas bajo normoxia (N, 21% O
2) o hipoxia (H, 1% O
2) en presencia o no de etopósido (E, 100 micras en células Hep 3B y 50 M en los otros tipos de células) o paclitaxel (T, 10 M) en células HepG2. Después de la incubación, se extrajo el ARN total, sometido a transcripción inversa y luego a un análisis TLDA. 18S se utilizó como limpieza de genes para la normalización de datos. valores numéricos reales se proporcionan en la Tabla S2. Los genes que se muestran en negrita son los genes cuya expresión fue validado por QRT-PCT.
A continuación, tratamos de genes cuya expresión es el perfil paralelo al perfil de la muerte celular en cada uno de los cuatro tipos de células, es decir, genes cuya la expresión se downregulated por la hipoxia en las células HepG2 y MDA-MB231 y no afectados o se incrementa en A549 y células Hep 3B, o el vice-versa. Sin embargo, no se pudo observar tales perfil de expresión. Curiosamente, la expresión de BCL2L11 (también llamado BIM), BIK, CASP10, CASP3, DEDD2, NALP1 y TRADD se redujo por la hipoxia en las células HepG2 de etopósido-incubadas mientras que su expresión se aumentó o sin modificar en las células A549, en correlación con el perfil apoptótica de estos dos tipos de células. Por otra parte, BIRC3 y MCL1 perfil de expresión fue inversa del perfil de apoptosis para las células HepG2 y A549. El perfil de expresión de estos genes se validó en tiempo real las reacciones individuales de RT-PCR. Los resultados se presentan como un mapa de calor en la Figura 5, mientras que los valores numéricos se proporcionan en la Tabla S3. El perfil de BAK1, BAX, BBC3 (también llamado PUMA) y PMAIP1 (también llamado NOXA) también fue validado ya que son mediadores conocidos de la muerte celular inducida por etopósido-. La mayor parte de los resultados obtenidos utilizando Taqman arrays de baja densidad fueron confirmados. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la expresión de genes casi todos estudiados se redujo por la hipoxia en todas las células de etopósido-expuesta.
HepG2, A549, las células Hep 3B MDA-MB231 y se incubaron 16 horas bajo normoxia (N, 21% o
2) o hipoxia (H, 1% o
2) en presencia o no de etopósido (e, 100 micras en células Hep 3B y 50 micras de los otros tipos de células) o paclitaxel (T, 10 M) en células HepG2. Después de la incubación, se extrajo el ARN total, sometido a transcripción inversa y luego a PCR en tiempo real en presencia de SYBR Green y cebadores específicos. valores numéricos reales se proporcionan en la Tabla S3. Los genes que se muestran en negrita son los genes cuya expresión se evaluó a nivel de proteínas mediante análisis de Western blot.
perfil de expresión de las proteínas implicadas en la apoptosis
Además de ser regulada por los cambios en el gen la expresión, la mayoría de las proteínas implicadas en la apoptosis se sabe que están también regulados a nivel post-traduccional [2]. El etopósido y paclitaxel inducen la apoptosis mediante la activación de la vía intrínseca principalmente [17], [18], [19], que está regulada por la abundancia y la localización subcelular de las proteínas de la familia Bcl-2. Por ello, estudiaron la abundancia de proteínas de Bcl-2 de proteínas en los cuatro tipos de células, así como la localización subcelular de algunos de ellos en HepG2 y células A549 (Figura 6).
HepG2, A549, MDA-MB231 y células Hep 3B se incubaron 16 horas bajo normoxia (N, 21% o
2) o hipoxia (H, 1% de o
2) en presencia o no (CTL) de etopósido (ETO, 100 micras en Hep3B las células y los 50 M en los otros tipos de células) o paclitaxel (TAX, 10 mM) en las células HepG2. Se detectaron proteínas (A) en extractos de células totales por Western Blot, utilizando anticuerpos específicos. alfa-tubulina se utilizó como control de carga. Un experimento representativo de tres. transferencias Western cultivados se presentan en la Figura S1. (B) Después de la incubación, el fraccionamiento subcelular se llevó a cabo y no se detectaron proteínas en los MLP (mitocondrias-lisosoma-peroxisoma) y S (citosólico) fracciones por Western Blot, utilizando anticuerpos específicos. Tom20 y β-actina se utilizaron como controles de carga para las fracciones MLP y S respectivamente. Un experimento representativo de tres. transferencias Western cultivados se presentan en la Figura S1.
En primer lugar, estudiamos los pro-apoptóticos proteínas BAX y BAK. nivel de proteína total BAX se aumentó ligeramente por etopósido en HepG2, células A549 y Hep 3B, pero no se vio afectado en las células MDA-MB231. La hipoxia disminuido ligeramente abundancia BAX en las células HepG2 pero no tuvo efecto en otros tipos de células. Esta proteína estaba presente en la fracción MLP (mitocondrias-lisosoma-peroxisomas), así como en el citosol de HepG2 y células A549. El etopósido mayor abundancia BAX en el citosol de las células HepG2 y en la fracción de MLP de células A549; este aumento fue impedido por la hipoxia.