Extracto
Muchas células cancerosas muestran un CIN (
C
hromosome
En
estabilidad) fenotipo, por el cual se exhiben altas tasas de pérdida o ganancia de cromosomas en cada célula ciclo. Con los años, una serie de diferentes mecanismos, entre ellos la multipolaridad del huso mitótico, insuficiencia citocinesis, y la orientación cinetocoro merotelic, se han propuesto como causas de la NIC. Sin embargo, una teoría completa de la forma CIN se perpetúa aún no existe. Se utilizó células de cáncer colorrectal CIN como un sistema modelo para investigar el posible mecanismo (s) celular subyacente CIN. Encontramos que las células CIN frecuencia montados husos multipolares en la mitosis temprana. Sin embargo, las células anafase multipolares eran muy raros, y los experimentos de células en vivo mostraron que casi todas las células CIN dividen de una manera bipolar. Por otra parte, el análisis de células fijo mostró altas frecuencias de cromosomas rezagados merotelically adjuntos en células CIN anafase bipolar, y las frecuencias más altas de los archivos adjuntos en merotelic multipolares vs. prometaphases bipolares. Finalmente, encontramos que prometaphases CIN multipolares típicamente poseían γ-tubulina en todos los polos del huso, y que una fracción significativa de células CIN bipolar metafase /anafase temprana poseían más de un centrosoma en un solo polo del huso. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren un modelo mediante el cual los archivos adjuntos del cinetocoro merotelic fácilmente se pueden establecer en prometaphases multipolares. La mayor parte de estas células multipolares prometaphase entonces bi-polarizar antes del inicio de la anafase, y los archivos adjuntos merotelic residuales produciría cromosoma mala segregación debido a la anafase los cromosomas rezagados. Proponemos este mecanismo de coalescencia polos del huso como un importante contribuyente a la inestabilidad cromosómica en células de cáncer
Visto:. Silkworth WT, Nardi IK, Scholl LM, Cimini D (2009) multipolar husillo Polo coalescencia es una fuente importante de cinetocoro Mis-Adjunto y el cromosoma mala segregación en las células cancerosas. PLoS ONE 4 (8): e6564. doi: 10.1371 /journal.pone.0006564
Editor: Kevin G. Hardwick, Universidad de Edimburgo, Reino Unido
Recibido: 10 de mayo de 2009; Aceptado: 3 Julio 2009; Publicado: 10 Agosto 2009
Derechos de Autor © 2009 Silkworth et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. IKN era un receptor de un Fralin verano Pregrado beca de investigación en el verano de 2008 y el verano de 2009. Este trabajo fue parcialmente apoyado por la NSF conceder MCB-0842551 y el Thomas F. Miller y Kate Jeffress Memorial Trust otorgan J-828 a DC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
segregación precisa de cromosomas mitótico es necesario mantener un número diploide de cromosomas. La mayoría de las células cancerosas son aneuploides [1], [2] y aneuploidía se sugirió, hace ya un siglo, siendo una causa de cáncer [3]. Además de este estado aneuploides, muchas células cancerosas exhiben altas tasas de cromosoma mala segregación (es decir, la ganancia o pérdida de cromosomas enteros) en cada ciclo celular, una condición conocida como la inestabilidad cromosómica o CIN [4] - [6], lo que contribuye a mantener altos niveles de aneuploidía. Un número de estudios han tratado de identificar el defecto (s) en la segregación cromosómica mitótico potencialmente responsables de la CIN. Los primeros estudios sugirieron defectos en el puesto de control mitótico como la principal causa de CIN [7]. Sin embargo, el trabajo posterior ha mostrado que la mayoría de las células cancerosas tienen un punto de control CIN robusta [8] y su respuesta a los tratamientos mitosis perturbar es indistinguible de la respuesta de las células no CIN [8], [9]. citocinesis fracaso También se ha sugerido en el pasado como una posible causa de CIN [10], [11]. Sin embargo, la insuficiencia citocinesis produciría una única célula hija poliploide, y no podía explicar CIN, que se define como la mala segregación de los cromosomas a tasas más altas. Como resultado, CIN produce tanto altos niveles de aneuploidía y una gran variabilidad en el número de copias de cromosomas dentro de la población [4], mientras que la insuficiencia citocinesis simplemente como resultado una duplicación del número de cromosomas. Por lo tanto, la citocinesis fracaso
per se
no pueden explicar CIN, a menos que sea seguido por otros eventos cromosoma mala segregación en la que los cromosomas individuales (en lugar de todo el genoma) son mis-segregadas. Otros estudios sugieren la multipolaridad como una causa potencial de CIN [12] - [15] basado en la observación de que las células del cáncer de numerosos sitios (revisado en [1]) se reúnen con frecuencia multipolar ejes (por lo general acompañado por amplificación centrosoma). A pesar de que la segregación cromosómica multipolar Podría dar lugar a una extensa cromosoma mala segregación, una serie de estudios sugiere que muchas de estas células multipolares podría someterse a un proceso de polo del huso coalescencia /agrupamiento [16], [17], lo que impediría el MIS masivas de cromosomas -segregation que se asocia con la segregación cromosómica multipolar. Se ha sugerido que este mecanismo polo coalescencia husillo conferiría una ventaja selectiva a las células cuyos niveles de aneuploidía de otro modo sería tan grave como para dar lugar a la muerte celular [18], [19]. altas frecuencias, por último, una serie de estudios han encontrado de los cromosomas menos anafase (es decir, los cromosomas que no segregan al polo del huso, pero se quedan atrás en el ecuador del huso durante la anafase) en diversas células cancerosas, incluyendo las células de cáncer oral [20], [21], humanos células de cáncer de mama [22], [23], las células de carcinoma de ovario [24], y las células de cáncer de colon [22]. Uno de estos estudios [22] también mostró que los cromosomas rezagados estaban orientadas merotelically (es decir, su cinetocoro se une a los microtúbulos de los dos polos del huso en lugar de sólo uno). En resumen, se han propuesto muchos mecanismos alternativos de CIN en los años; Sin embargo, una teoría completa de la forma CIN se perpetúa aún no existe, y no está claro si existe alguna correlación entre algunos de estos mecanismos.
En este estudio, hemos utilizado células de cáncer colorrectal CIN como un sistema modelo para investigar el posible mecanismo (s) subyacente celular CIN. Se encontró que las células CIN frecuencia multipolar ejes montados en la mitosis temprana, pero anafases multipolares son muy raros, y casi todas las células CIN divididas de una manera bipolar. También se encontró que las células CIN anafase bipolar exhiben altas frecuencias de cromosomas rezagados merotelically adjuntos. Por otra parte, una fracción significativa de células CIN bipolar metafase /anafase temprana poseía más de un centrosoma en un solo polo del huso. Por último, encontramos altas frecuencias de archivos adjuntos en merotelic prometaphases multipolares. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren un modelo mediante el cual los archivos adjuntos del cinetocoro merotelic fácilmente se pueden establecer en prometaphases multipolares. La mayor parte de estas células entonces bi-polarizar antes del inicio de la anafase, y los archivos adjuntos merotelic residuales produciría cromosoma mala segregación debido a la anafase los cromosomas rezagados. Proponemos este mecanismo de coalescencia polos del huso como un importante contribuyente a la inestabilidad cromosómica en las células cancerosas.
Resultados
CIN células de cáncer colorrectal poseen multipolar ejes en prometaphase, pero no en la anafase
células de cáncer colorrectal se pueden dividir en dos grupos [5], [25], las que presentan CIN, y los que no lo hacen, tradicionalmente llamado MIN debido a su típica
M
icrosatellite
en
estabilidad. Debido a esta característica, células de cáncer colorrectal representan un modelo particularmente interesante para el estudio de cromosoma mala segregación en las células cancerosas, ya que las células MIN se pueden utilizar como un control experimental para las células CIN. Para este estudio, se seleccionaron dos líneas de cáncer colorrectal CIN celulares (HT-29 y SW620) y una línea celular colorrectal MIN (HCT116). Para identificar defectos mitóticos potencialmente responsables de la mala segregación cromosómica en células CIN, hemos realizado experimentos de inmunotinción para etiquetar cinetocoros (utilizando anticuerpos CREST) y husos mitóticos (utilizando anticuerpos anti-alfa-tubulina) en las células CIN y MIN. A continuación, utiliza alta resolución de la microscopía confocal para identificar defectos prometaphase tanto en células MIN (Figura 1) y CIN. Se encontró que el más prominente de defectos en las células prometaphase CIN era multipolaridad husillo y que husillos prometaphase células CIN exhibidos multipolares (Figura 1A) a frecuencias que fueron significativamente más altos que los que se encuentran en las células MIN (Figura 1B). La mayor parte de los husos multipolares exhibieron una morfología tripolar o tetrapolar, aunque también se observaron células multipolares con 5-8 polos del huso (5,4%, 19,5% y 7,9% del total de HCT116 multipolar, HT-29, y SW620, respectivamente). Seguidamente, examinamos la multipolaridad en las células anafase, y encontramos que las frecuencias de los husos multipolares en células CIN anafase eran mucho más bajos que los encontrados en prometaphase (Figura 1B). Además, no hubo diferencias entre las células MIN y CIN en la frecuencia de anafases multipolares (Figura 1B).
A. Ejemplos de MIN (HCT116) y CIN (HT-29, SW620) prometaphase células inmuno de α-tubulina (rojo, columna izquierda) y cinetocoros (verdes, columna central). Todas las imágenes son proyecciones de máxima intensidad de pilas de secciones ópticas adquiridas a intervalos de 0,6 micras a través del eje Z de la célula. imágenes fusionadas se muestran en la columna de la derecha. Para cada línea celular, se muestran un ejemplo de prometaphase bipolares y uno de prometaphase multipolares. Barra de escala, 5 micras. B. Las frecuencias de prometaphase y anafase células con husos multipolares. Los datos que se muestran aquí representan las medias y los errores estándar (barras) de cuatro experimentos independientes. prometaphases CIN multipolares fueron significativamente más frecuentes que prometaphases MIN multipolares (χ
2 test, P & lt; 0,001 para ambos HT-29 y SW620 cuando se comparan con HCT116). Sin embargo, anafases CIN multipolares se produjeron en las frecuencias bajas que no difieren de las de anafases MIN multipolares.
Tanto las células CIN y MIN dividen de una manera bipolar, pero la mitosis dura más tiempo en las células CIN
Las bajas frecuencias de husos multipolares en células CIN anafase sugirieron que prometaphases multipolares podrían no completar una división multipolar, sino que pueden encontrarse con diferentes destinos. Algunas posibilidades incluyen detención de la mitosis, la muerte celular mitótico, o deslizamiento mitótico. Para determinar el posible destino (s) de las células cancerosas CIN mitótico, hemos realizado experimentos de lapso de tiempo. En cada experimento, se han seleccionado varios campos de visión y la imagen por microscopía de contraste de fase con un objetivo de 20 × en un microscopio invertido equipado con una etapa totalmente automatizado. Las imágenes fueron adquiridas cada 30 seg durante tres horas. Las películas de lapso de tiempo se analizaron posteriormente para determinar la duración de la mitosis y destino de las células que entran en mitosis durante el periodo de grabación. Como era de esperar a partir de nuestros datos de células fijo (Fig. 1B), que rara vez se observó la segregación de cromosomas que se produzca de una manera multipolar (Figura 2A). En la mayoría de las células, los cromosomas separados en dos grupos a los lados opuestos de la célula, y un único surco cytokinetic formados entre ellos (Video S1). El número de células que muestran la segregación cromosómica multipolar en nuestros experimentos de células en vivo (Figura 2A) no fue significativamente diferente (χ
2, P & gt; 0,37 para las tres líneas celulares) a partir del número de células anafase multipolares que encontramos en la celda fijo experimentos (Figura 1B). Además, se encontró que 40-67% de las células que presentan CIN segregación cromosómica multipolar no pudo completar la citocinesis (Figura 2A), mientras que no hubo casos de insuficiencia citocinesis en células que muestran la segregación cromosómica bipolar. Por último, no se encontró ninguna indicación de arresto mitótico persistente, la muerte celular durante la mitosis, o deslizamiento mitótico. Estos datos indican que la mayoría de la inestabilidad cromosómica en células CIN debe proceder de defectos de segregación de cromosomas en células en división en una forma bipolar y completar la división celular. Nuestros experimentos de células en vivo también revelaron que el tiempo empleado en la mitosis, medido como el tiempo transcurrido desde el inicio de la celda de redondear a anafase inicio, fue significativamente mayor en las células CIN comparación con las células MIN (Tabla 1), de manera similar a lo que otros han encontrado en otras líneas celulares de cáncer [26].
A. Las frecuencias de las células que muestran la segregación cromosómica multipolar en el de contraste de fase experimentos de lapso de tiempo. B. Las frecuencias de la anafase bipolar MIN (HCT116) y CIN (HT-29, SW620) células con cromosomas rezagados. Los datos que se muestran aquí representan las medias y los errores estándar (barras) de cuatro experimentos independientes. Las frecuencias de los cromosomas anafase retraso fueron significativamente mayores en CIN que las células min (χ
2 de prueba, P & lt; 0,001 tanto para HT-29 y SW620 en comparación con HCT116). C. Ejemplos de MIN (HCT116) y CIN (HT-29, SW620) anafase células inmuno de α-tubulina (rojo, primera columna) y cinetocoros (verde, segunda columna). Las imágenes son proyecciones de máxima intensidad de pilas de secciones ópticas adquiridas a intervalos de 0,6 micras a través del eje Z de la célula. imágenes fusionadas se muestran en la tercera columna. Para cada línea celular, se muestra un ejemplo de la anafase normal y una anafase con un cromosoma de retraso. La columna más a la derecha muestra las células con cromosomas menos en un solo plano focal, en el que el contraste se ha mejorado para poner de relieve las conexiones merotelic del cinetocoro cromosoma rezagado. Barra de escala, 5 micras.
células CIN anafase bipolares presentan altas frecuencias de cromosomas rezagados merotelically adjuntos
Como se describió anteriormente, la multipolaridad era común en las células prometaphase CIN, pero rara vez se observan en la anafase (Figura 1B), y la mayoría de las células CIN segregados sus cromosomas de forma bipolar (Figura 2A). Esto indicó que la segregación cromosómica multipolar es una causa probable de la inestabilidad cromosómica en células de CIN, y sugirió que los errores que ocurren durante la segregación cromosómica bipolar fueron la causa más probable de la NIC. Para identificar estos defectos posibles, utilizamos de alta resolución de la microscopía confocal para analizar las células anafase con cinetocoros y los microtúbulos (Figura 2C) inmuno. Se encontró que las células anafase CIN bipolar poseían merotelically unidos cromosomas rezagados (es decir, los cromosomas que se quedó atrás en el ecuador del huso en lugar de segregar al polo del huso, y cuya cinetocoro estaba destinada a haces de microtúbulos a partir de los dos polos del huso en lugar de uno solo; Figura 2C la columna de la derecha) en las frecuencias más altas que las células MIN (Figura 2B). Curiosamente, las frecuencias de células anafase con retraso cromosomas fueron muy similares a las frecuencias de células prometaphase multipolares (comparar Figura 1B con la Figura 2B).
Tanto las células CIN multipolares y bipolares poseen múltiples centrosomas
las bajas frecuencias de anafases multipolares en comparación con los de prometaphases multipolares (Figura 1B) y la segregación cromosómica bipolar observado en células vivas (Figura 2A) sugirió que la mayoría de los husos multipolares podría bipolarize antes de la aparición anafase. Para probar esta hipótesis, se realizó la tinción de γ-tubulina en combinación con los microtúbulos y la inmunotinción kinetochore en células CIN en diferentes etapas de la mitosis (Figura 3A-B). De alta resolución microscopía confocal reveló que en las células CIN prometaphase, la tinción de γ-tubulina estaba presente polos del huso en absoluto en más de 95% de las células (Figura 3A). A continuación, nos fijamos en las células bipolares metafase /principios de anafase (Figura 3B) y se encontró que un número significativo de células mostró múltiples puntos γ-tubulina-positivos en un poste de un solo eje (Figura 3B-C), lo que sugiere que algunos de los polos del huso presente en las células multipolares prometaphase podría moverse juntos en etapas posteriores de la mitosis para generar dos polos del huso enfocadas, y por lo tanto, un huso bipolar. Debe tenerse en cuenta que las frecuencias observadas (6,8% y 10,5% para HT-29 y SW620, respectivamente) podrían subestimar el número real de polos del huso sometidos a este proceso de coalescencia, como algunos de ellos podrían moverse tan cerca unos de otros para que aparezca como uno por tinción con γ-tubulina.
La figura muestra ejemplos de prometaphase multipolar (a) y metafase bipolar (B) células CIN inmunoteñidas para α-tubulina, cinetocoros, y γ-tubulina. Las imágenes mostradas se obtuvieron mediante la fusión de proyecciones de máxima intensidad de cualquiera de CREST (cinetocoros) imágenes (columna izquierda) o α-tubulina y gamma-tubulina imágenes (columna derecha) α-tubulina y. A. células prometaphase más multipolares (porcentajes exactos que se muestran en la esquina inferior derecha de los paneles de la derecha) mostraron tinción γ-tubulina en todos los polos del huso. B. Ejemplos de metafase bipolar células CIN con múltiples centrosomas en un solo polo del huso (flechas apuntan a los puntos manchados-γ-tubulina). Barra de escala, 5 micras. C. Las frecuencias de las células bipolares metafase /anafase primeros CIN que poseen múltiples centrosomas (como se visualizaron por tinción con γ-tubulina) en un solo polo del huso.
Las frecuencias más altas de los archivos adjuntos en merotelic multipolar vs bipolar prometaphase CIN células
las señales de gamma-tubulina múltiples en polos del huso de células en metafase CIN bipolar, junto con la aparición de retraso cromosomas en anafases bipolares en las frecuencias que se parecen mucho las frecuencias de prometaphases multipolar, sugirieron que los archivos adjuntos merotelic podrían ser preferencialmente formado en prometaphase células multipolares que posteriormente bi-polarizan por coalescencia polo del huso. Para probar esta hipótesis, se utilizó microscopía de alta resolución confocal combinado con visualización 3-D y de procesamiento de imágenes (véase Materiales y Métodos para más detalles) para identificar los cinetocoros merotelic en tratados en frío (para inducir el desmontaje de los microtúbulos no cinetocoro, pero conservar los microtúbulos del cinetocoro ) las células CIN prometaphase inmunoteñidas para cinetocoros y los microtúbulos (Figura 4A-D). Se determinó el número de células en los cinetocoros merotelic CIN prometaphase bipolares vs. multipolar mediante la identificación de todos los cinetocoros unidos a dos haces de microtúbulos orientados en direcciones opuestas, y encontramos que las células multipolares prometaphase poseían un número significativamente mayor de los archivos adjuntos que merotelic prometaphase células bipolares (Figura 4E ), lo que sugiere adjuntos merotelic en prometaphases tales multipolares como una fuente importante de los cromosomas menos en anafase células bipolares.
a. plano focal de una sola HT-29 prometaphase multipolar sin procesar. Barra de escala, a 2,5 micras. B. misma célula y mismo plano focal como en (A) obtenido después del procesamiento de las imágenes en los dos canales de filtrado especial, la fusión, y suavizado (ver Materiales y Métodos para detalles). Un cinetocoro merotelic es visible en el área de caja. KT: cinetocoros. MT: los microtúbulos. C. Relación vista del plano focal se muestra en (A) y (B). Regiones de yuxtaposición entre el cinetocoro y su paquete (s) de microtúbulos aparecen en verde. D. Ampliación (400%) del área de caja en (B). E. Número medio de cinetocoros merotelic en las células bipolares CIN prometaphase vs. multipolar. prometaphases multipolares poseen cinetocoros significativamente más merotelic que prometaphases bipolares (t-test, P & lt; 0,001 para ambas líneas celulares) guía empresas
Discusión
citocinesis fracaso no contribuye a CIN
.
citocinesis fracaso se ha sugerido en el pasado como un mecanismo responsable de aneuploidía en las células del cáncer [10], [11]. De hecho, un número de estudios han demostrado que la poliploidía inducida experimentalmente mediante la inhibición de la citocinesis, puede conducir a la transformación maligna y la tumorigénesis [27], [28]. Sin embargo, como se ha señalado en la introducción, la citocinesis fracaso
per se
podría no ser suficiente para explicar CIN, es decir, alta tasas de cromosomas mala segregación. Sin embargo, la insuficiencia citocinesis podría ser un factor que contribuye a CIN, de este modo se determinó la frecuencia de fallo de la citocinesis tanto en células que muestran la segregación cromosómica bipolar y en las células con la segregación de cromosomas tripolar. Nunca se observó insuficiencia citocinesis en células en proceso de división celular bipolar, y este fenómeno sólo se produjo en aproximadamente la mitad de las células en proceso de división celular multipolar (Figura 2A). Debido a que muy pocas células exhiben la segregación cromosómica multipolar, las tasas observadas de la citocinesis fracaso representan un evento muy raro en la población general de la célula. Por lo tanto, la citocinesis fracaso no puede explicar tanto las altas tasas de cromosoma mala segregación observadas en las células CIN [4], [5] y las altas tasas de los cromosomas menos que se encuentran en las células del cáncer [20] - [24] (Figura 2B). En conclusión, aunque la citocinesis fracaso podría representar un evento raro, temprano en el desarrollo del tumor [27], [28], no parece contribuir de manera significativa a la NIC en las células de cáncer en etapas posteriores de la progresión del tumor.
multipolaridad y la segregación de los cromosomas en las células cancerosas multipolar CIN
Muchas células cancerosas se han demostrado previamente para exhibir la amplificación centrosoma [12], [15], [29], [30], y mitótico multipolaridad husillo se ha observado en el cáncer células de varios sitios [1], [12], [15], [20], [21], [24], [29] - [34]. Se ha sugerido que la segregación cromosómica multipolar produciría células hijas en gran medida aneuploides, que muy probablemente no sobreviviría ciclos celulares posteriores [18], [19]. De hecho, nuestros experimentos de células en vivo mostraron que la división celular multipolar es un evento raro en las células CIN (Figura 2A). Además, un estudio reciente mostró que la división celular multipolar en el CIN células da como resultado ya sea la muerte celular o la detención del ciclo celular [35]. Se sugirió previamente que las células cancerosas multipolares pueden someterse a un proceso de bipolarización, que se produciría a través de la agrupación centrosoma, y daría lugar a la segregación cromosómica bipolar [16] - [18]. Estudios recientes han demostrado que varios jugadores pueden participar en la promoción de la agrupación centrosoma (revisado en [36]). Estos incluyen mecanismos de actina asociada a [16], la dineína [17], kinesin 14s (NCD /PONH) [16], [37], y tal vez otras proteínas /mecanismos [16], [36], [37]. Estudios recientes [16], [26], [37] también han sugerido un posible papel de la asamblea de control de huso en dando tiempo para que la bipolarización del huso en las células multipolares, como la inhibición Mad2 impidió bipolarización husillo [16], [37] y la mitosis acelerada salida en las células multipolares [26]. De acuerdo con estos estudios, encontramos que las células con frecuencias más altas de husos multipolares invierten, de media veces, más largos en la mitosis (Tabla 1). Sin embargo, la inhibición Mad2 acelera la salida de mitosis, independientemente del número de polos del huso y el apego cinetocoro [38] - [40], por lo que su efecto sobre multipolar husillo bipolarización podría ser simplemente un efecto secundario. También se encontró que las células multipolares poseen un mayor número de cinetocoros merotelic. Sin embargo, los archivos adjuntos merotelic no son detectados por la asamblea de control de huso (revisado en [1]), y por lo tanto esto parece poco probable que sea la razón del retraso mitótico. Por otro lado, las células cancerosas CIN tienen números de cromosomas excesivas, por lo que es fácil imaginar que el logro de los archivos adjuntos estables para todos los cromosomas se tardará más en tales células en comparación con células diploides bipolares. Sin embargo, Yang et al. [26] demostraron recientemente que las células diploides RPE1 multipolares generados experimentalmente toman el doble de tiempo para entrar en la anafase en comparación con sus homólogos bipolares, lo que sugiere que el aumento en el número centrosoma podría ser suficiente para retrasar el inicio anafase. Los autores sugirieron que la presencia de múltiples ásteres de microtúbulos podría perturbar la estabilidad de los archivos adjuntos del cinetocoro [26], lo que conduce a un aumento en el tiempo necesario para completar fijación cinetocoro, y por lo tanto el alargamiento de la mitosis. Esta es una posibilidad intrigante, que tendrá que ser probado en futuros experimentos. En conclusión, cómo centrosomas adicional retrasar el inicio anafase todavía no está claro, pero estos estudios sugieren que tanto los cromosomas adicionales y los centrosomas adicionales en células de cáncer de CIN podrían contribuir al aumento en el tiempo medio de permanencia en la mitosis, durante el cual las células multipolares bipolarize a través de husillo coalescencia poste. La agrupación centrosoma asociado con husillo bi-polarización se sugirió anteriormente para conferir las células cancerosas con una ventaja selectiva que impida masiva cromosoma mala segregación y permitir que las células de cáncer para continúan dividiéndose incluso en presencia de los centrosomas adicionales [18], [19]. Por lo tanto, los estudios anteriores propuestos, tales proceso polo coalescencia husillo como un mecanismo para prevenir la segregación cromosómica errónea. Por el contrario, se propone aquí que el conjunto del eje multipolar seguido por coalescencia polo del huso representa un importante mecanismo del cromosoma mala segregación en las células cancerosas CIN (véase la siguiente sección para una descripción detallada de nuestro modelo propuesto).
multipolaridad células del cáncer y cinetocoro merotelic archivo adjunto: dos caras de la misma moneda
el bajo número de anafases multipolares en comparación con prometaphases multipolares (Figura 1B), el bajo número de divisiones celulares multipolares (Figura 2A), y la presencia de múltiples γ -tubulina señales positivas en los polos del huso individuales en células en metafase /anafase temprana CIN (Figura 3B-C), sugieren que la mayoría de los prometaphases multipolares se someten a un proceso de coalescencia polo del huso antes del inicio de la anafase, como se sugirió anteriormente [16] - [19 ].
proponemos que cuando las células cancerosas se ensamblan inicialmente CIN multipolar ejes, cinetocoros individuales son más propensos que los que estarían dentro de un huso bipolar a cara (Figura 5A), y se adhieren a (Figura 5B), dos polos del huso (fijación merotelic). Por lo tanto, se esperaría que las células multipolares prometaphase poseer archivos adjuntos más merotelic comparación con prometaphases bipolares. De hecho, encontramos prometaphase células multipolares poseer cinetocoros más merotelic comparación con prometaphases bipolares (Figura 4). Como se describió anteriormente, husos multipolares probable bipolarize a través de un proceso de coalescencia polo del huso (Figura 5B-C) antes de la aparición anafase. A pesar de que existen mecanismos de corrección para la unión cinetocoro merotelic [39], [41], [42], este cinetocóricos mis-adjunto no es detectado por el puesto de control mitótico [43], [44], y las células pueden entrar en anafase antes de alcanzar la corrección completa [ ,,,0],39], [43]. Dado que las células que transitoriamente se ensamblan multipolar ejes empezarían con los accesorios más merotelic comparación con las células bipolares (Figura 4 y 5B), se espera que más de tales mis-adjuntos de persistencia durante la anafase y producir los cromosomas menos (es decir, los cromosomas que se quedan atrás en el ecuador del huso en lugar de segregar al polo del huso; Figura 5D), y por lo tanto cromosoma mala segregación y aneuploidía. Sorprendentemente, también se encontró que las frecuencias de anafase células con cromosomas rezagados orientadas merotelically fueron muy similares a las frecuencias de células prometaphase multipolares (comparar Figura 1B y la Figura 2B), lo que sugiere la intrigante posibilidad de que los cromosomas más rezagados se encuentran en las células que inicialmente montar husos multipolares. En resumen, mientras que la multipolaridad del husillo y la anafase los cromosomas menos habían sido previamente sugerido como causas no relacionadas de CIN, se muestra aquí por primera vez que un gran número de forma cinetocoros merotelic en prometaphase células multipolares, revelando así la estrecha relación entre la multipolaridad y la anafase los cromosomas rezagados .
A. Dentro de un husillo multipolar, un solo cinetocoro es más probable que se enfrentan dos polos del huso de lo que sería en un huso bipolar. B. Debido a la geometría del husillo multipolar, un solo cinetocoro se puede unir fácilmente los microtúbulos que emanan de dos polos del huso en lugar de partir de un solo polo. Después del establecimiento de la unión cinetocoro merotelic, el huso mitótico bi-polariza por un proceso de coalescencia polo del huso (o agrupación centrosoma). C. Merotelic apego cinetocoro puede persistir a lo largo de la metafase y la anafase en. D. Durante la anafase, el archivo adjunto cinetocoro merotelic puede dar lugar a un cromosoma de retraso.
Hay que señalar que, aunque en frecuencias mucho más bajas que en las células CIN, encontramos dos husos multipolares prometaphase (Figura 1 ) y anafase los cromosomas menos (Figura 2B-C) en las células HCT116 (MIN). Sin embargo, estas células han demostrado previamente no exhibir CIN [4], [22], y se les mostró a no tolerar cromosómicas inducidas experimentalmente mala segregación [22], lo que sugiere que la CIN debe ser el resultado de una combinación de altas mal cromosómicas las tasas de -segregation (no observados en las células HCT116) y algún otro rasgo fenotípico que hace que las células tolerantes para la aneuploidía [22].
los futuros experimentos deben estar dirigidas a prueba nuestro modelo y su predicción de que la inhibición de la coalescencia polo del huso debe dar lugar a frecuencias más bajas de los cromosomas menos en anafase células bipolares. Time-lapse de las células con cinetocoros y los microtúbulos marcados confirmaría la secuencia de acontecimientos que aquí se proponen (Figura 5) si se observan los cromosomas menos anafase merotelically adjunta con mayor frecuencia en células de partida con la mitosis multipolar ejes comparación con las células que empiezan con husillos bipolares. Por otra parte, la agrupación polo del huso podría ser inhibido para desacoplar la multipolaridad husillo de anafase los cromosomas rezagados, y así demostrar la relación de causalidad entre estos dos fenómenos. Por ejemplo, mediante la realización de una pantalla de RNAi de todo el genoma en células S2 de Drosophila, Kwon et al. [16] encontró muchos genes diferentes implicados en una variedad de procesos celulares, incluyendo la organización de husillo de montaje, forma celular y la polaridad, y la adhesión celular, de participar en la agrupación centrosoma. Según nuestro modelo, el silenciamiento de estos genes en células CIN debe dar lugar a frecuencias reducidas de los cromosomas menos en anafases bipolares, y los experimentos futuros debe ser dirigido a comprobar esta hipótesis. Aunque el experimento inverso (es decir, la reducción de unión merotelic en células multipolares) sería mucho más difícil, algunos experimentos podrían proporcionar evidencia indirecta de que la reducción de fijación merotelic resultaría en una reducción en los cromosomas anafase quedando en las células que transitoriamente montar un husillo multipolar. Por ejemplo, el inicio anafase podría retrasarse por tratamiento de las células multipolares con un inhibidor de proteasoma. Durante el tiempo de la inhibición del proteasoma, se espera que los husos multipolares para bi-polarizar, y se espera que los archivos adjuntos merotelic ser corregido. Así, al lavado del inhibidor, las células deben entrar en anafase y exhibir las frecuencias bajas de los cromosomas menos.
¿Hay algún otro mecanismo contribuye a cin?
no se descarta que otros mecanismos podrían contribuir a la inestabilidad cromosómica en células de cáncer. Por ejemplo, estudios recientes sugieren que los mecanismos de corrección kinetochore merotelic no son muy eficientes en las células cancerosas CIN [9], [45].