Extracto
La función normal de la clase I de antígenos leucocitarios humanos (HLA-I) y maquinaria de procesamiento de antígenos se requiere (APM), las proteínas de las células T mediada antitumoral o inmunidad antiviral, mientras que la supervivencia del tumor indica un fallo del huésped en la vigilancia inmune asociada con la disfunción en la presentación de antígenos, principalmente debido a la desregulación de HLA expresión o función -I y APM. La regulación postranscripcional de HLA-I y la expresión APM puede asociar con modificaciones epigenéticas en el desarrollo del cáncer que no se ha descrito hasta el momento. Aquí demostramos que el desarrollo de neoplasia intraepitelial cervical (CIN) y carcinoma de células escamosas de cuello uterino (CSCC) en mujeres uigures fue acompañada de la pérdida parcial o total de la expresión de proteínas de HLA-I, ß2-m y componentes de APM, incluyendo el transportador asociada con el procesamiento de antígenos (TAP1 /2), proteínas de bajo peso molecular (LMP2, LMP7), retículo endoplasmático aminopeptidasa 1 (ERAP1), moléculas chaperonas incluyen calreticulina (CLR), calnexina (CNX) y ERp57, y esto se demostró una vez más por el análisis de la transcripción de los mismos genes, además de tres genes HLA-a, B y C que codifica HLA-I. Por enfoque de secuenciación de bisulfito, se identificaron objetivo islas CpG metilados en la región promotora del gen de TAP1, TAP2, LMP7, Tapasin y ERp57 en células de carcinoma de cuello uterino. Un análisis más detallado de sitio CpG metilación específica de estos genes en los casos de CSCC y CIN demostró una correlación inversa de alteración de la isla CpG de metilación de TAP1, LMP7 y ERp57 con cambios en la expresión de proteínas. Por otra parte, la metilación del promotor de estos genes fue significativamente mayor en los casos positivos para el virus del papiloma humano 16 (VPH 16) de los negativos. Nuestros resultados sugieren que las modificaciones epigenéticas son responsables de la expresión aberrante de ciertos genes HLA-I y APM, y pueden ayudar a comprender los mecanismos de escape tumoral no revelados de la vigilancia inmune en la carcinogénesis cervical
Visto:. Hasim A, Abudula M, R Aimiduo, Ma JQ, Jiao Z, Akula G, et al. (2012) post-transcripcional y regulación epigenética de la Maquinaria para el procesamiento de antígenos (APM) Componentes y HLA-I en cánceres de cuello uterino de la mujer uigur. PLoS ONE 7 (9): e44952. doi: 10.1371 /journal.pone.0044952
Editor: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, Suecia |
Recibido: 20 de enero de 2012; Aceptado: August 14, 2012; De publicación: septiembre 14 de, 2012
Copyright: © Hasim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado con fondos de la Región Autónoma uigur de Xinjiang Fondo (2009211B14) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81060164). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La formación y la supervivencia de una célula tumoral es una señal de éxito escape inmune y un fallo en la vigilancia inmune de acogida y eliminación. La función normal de leucocitos humanos antígeno de clase I (HLA-I) y maquinaria de procesamiento de antígenos (APM) es un requisito previo para la respuesta inmune innata y adaptativa mediada por células T contra la infección viral o celular carcinogénesis [1] - [3]. HLA-I es un jugador central y trabaja en conjunto con los miembros de APM en la concentración, carga y presentación de péptidos antigénicos endógenos, así como la regulación de la inmunidad celular y humoral [4] - [5]. Por lo tanto, la eliminación de las células tumorales por el sistema inmune depende en gran medida de la expresión de APM y HLA-I.
En los últimos años, se han hecho progresos en la comprensión de cómo péptidos presentados por moléculas HLA-I. En particular, se sabe que las proteasas están involucradas y cómo influyen en vías intracelulares presentaciones de antígenos en las células presentadoras de antígeno profesionales y en diversos tipos de enfermedad maligna [6] - [8]. El APM de la célula es un sistema complejo de proteínas que interactúan, incluyendo subunidades del proteasoma, proteínas de bajo peso molecular de masa 2 y 7 (LMP2 y LMP7), transportadores asociados con el procesamiento del antígeno 1 y 2 (TAP1 y TAP2), retículo endoplasmático aminopeptidasa 1 (ERAP1), y las proteínas chaperonas ER calnexina, calreticulina, y Tapasin. Además, la oxidorreductasa tiol ERp57 es responsable de la presentación de HLA-I péptido complejos en la superficie celular y es crucial para el reconocimiento de las células infectadas por virus o malignamente transformadas, mantenimiento de auto-tolerancia, y la vigilancia de los tumores recién surgen por el sistema inmune [ ,,,0],9]. Regulación a la baja de los componentes de HLA-I y APM se ha observado en muchos tumores y está estrechamente asociado con immunoevasion tumor, el crecimiento y la capacidad metastásica [6] - [8]. Los mecanismos moleculares que subyacen el nivel relativamente bajo de transcripción de HLA-I y los componentes de APM en las células cancerosas son en gran parte sin explicación. Las modificaciones epigenéticas del genoma humano, incluyendo la metilación del ADN aberrante, representan eventos tumorales genética que son funcionalmente equivalentes a los cambios genéticos. Regulación a la baja de la expresión de HLA-I causada por la hipermetilación de los genes HLA-I se ha documentado en carcinoma esofágico de células escamosas, carcinoma de colon, y las líneas celulares de melanoma, y esto podría ser invertido tras el tratamiento con inhibidores de la ADN metiltransferasa [10] - [11]. Virus del papiloma humano infección
(VPH) desempeña un papel central en la patogénesis de la neoplasia intraepitelial cervical (NIC) y el cáncer cervical con la infección por VPH considerado como una condición necesaria, pero no siempre suficientes, causar [12]. Desarrollo de cáncer cervical humano sin la participación de un HPV específico es excepcional, y es ampliamente aceptado que, además de la infección por VPH, otros cofactores, incluyendo las hormonas endógenas, factores genéticos, tales como HLA-I, y otros factores relacionados con la respuesta inmune del huésped , pueden tener un papel importante en el desarrollo de lesiones cervicales [13].
el cáncer de cuello uterino en uigur ha ocurrido con las mujeres de alta morbilidad y mortalidad en la región de Xinjiang y considerado como una enfermedad de alta incidencia de la región en china [14]. la infección por VPH se cree que es la causa principal del desarrollo del cáncer de cuello de útero y la infección del virus, especialmente los VPH de alto riesgo es detectable en las mujeres uigures con cáncer de cuello uterino a una velocidad comparable con otras poblaciones dentro y fuera de China [15] . Nuestros estudios previos han demostrado que la tendencia de la tasa de pérdida de la expresión de la proteína HLA-I fue comparable tanto para las mujeres pertenecientes a grupos étnicos uigures y han en el desarrollo del cáncer de cuello de útero, pero la tasa de pérdida total de HLA-I en muestras de carcinoma de células escamosas de cuello uterino (CSCC) y sus lesiones precursoras (CIN II o III) fue mayor en las mujeres uigures (27% y 53%, respectivamente) que en mujeres Han (18% y 37%, respectivamente) [16]. Parece que las diferencias étnicas pueden tener, en cierta medida, la influencia en el desarrollo del tumor debido a los diferentes antecedentes genéticos, hábitos de vida o entorno geográfico. Por lo tanto, teniendo en cuenta que la expresión aberrante de superficie HLA-I en el cáncer de cuello uterino asociado con la infección por HPV16 de alto riesgo frecuentemente causada por la ausencia de APM [17] - [18], se podría preguntar si las modificaciones epigenéticas podrían modular la expresión en superficie de HLA me directa o indirectamente por el silenciamiento o la inactivación de los genes de componentes de APM y conducir al desarrollo de cáncer de cuello uterino en las mujeres uigures.
en este estudio, se centró en 10 genes candidatos pertenecen al HLA-I y la familia APM, analizó la asociación de desarrollo del cáncer con la expresión de genes alterados en diferentes niveles, incluyendo el promotor de la metilación de genes, transcripción y expresión de la proteína. Estos datos proporcionan información sobre los mecanismos desconocidos de la carcinogénesis cervical en relación con la expresión regulación HLA-I y APM y pueden proporcionar con perfil de marcador molecular para el diagnóstico precoz basado en la detección de modificaciones epigenéticas y expresión de estos genes. Además, este estudio permite una mejor comprensión del impacto de HLA-I mediada por la presentación de antígenos en la inmunidad o anomalías antiviral o antitumoral causada por, o pueden incluir, carcinogénesis cervical.
Materiales y Métodos
Características clínicas y muestras de tejidos
frescos o fijados en formalina y muestras de tejido cervical incluidos en parafina fueron recogidos de las mujeres uigur con carcinoma cervical de células escamosas (CSCC) y la neoplasia intraepitelial cervical (CIN), o sin enfermedades cervicales , pero tratada por histerectomía. Se pidió a todos los pacientes con cáncer de cuello uterino se refiere entre junio de 2009 y marzo de 2010 debido a un cáncer de cuello de útero para participar en nuestro estudio durante su visita inicial al Departamento de Ginecología del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Xinjiang. Se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes y controles que participan en este estudio. El estudio fue aprobado por el comité ético de la institución.
El examen ginecológico se realizó en todos los pacientes con cáncer de cuello uterino en la estadificación de acuerdo con la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO criterios). 152 casos de, (FFPE) muestras de tejido fijado en formol e incluidos en parafina se obtuvieron del archivo de muestra de tejido del departamento patológica tras el examen de las diapositivas de archivos por patólogos experimentados. Las muestras FFPE (o tejidos del cuello uterino fresco congelado se describen a continuación) se recogieron originalmente durante la visita inicial a la consulta externa o en el examen ginecológico o después del tratamiento quirúrgico bajo anestesia general. De los pacientes con CSCC inscribieron en este estudio, fueron 29 FIGO estadio IIB, 25 FIGO estadio IIIB, IVB 9 FIGO etapa. Entre ellos, 28 casos fueron caracterizados patológicamente como bien diferenciado, moderadamente diferenciado 19 y 16 tumores mal diferenciados. Metástasis ganglionares fue documentado por 31 pacientes con tumores. Se seleccionaron un total de 64 pacientes con CIN para este estudio, incluyendo 33 casos con NIC I-II y 31 con NIC III. La edad media de los pacientes con cáncer de cuello uterino fue de 49,5 años (rango 29-67 años) IQ. casos de control (n = 25) fueron obtenidas de pacientes sin antecedentes de lesiones cervicales o cualquier forma de cáncer y previstas para someterse a una histerectomía por causas no malignas durante el mismo período. Las indicaciones para la histerectomía fueron los fibromas, prolapso uterino o adenomiosis o principalmente una combinación de los fibromas con prolapso uterino
.
Además, 55 biopsias congeladas, incluyendo 20 casos de CIN, 20 CSCC y 15 casos de control, se recogieron según los criterios descritos anteriormente, para la detección de la transcripción de genes por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa semi-cuantitativo (RT-PCR).
inmunohistoquímica Estudios
inmunohistoquímica (IHC) tinción se realizó con primaria anticuerpos que reconocen proteínas diana y juegos de IHC que contienen anticuerpos secundarios marcados con biotina. la clase I de ratón mAb HLA cadena pesada (HC-10,1:300; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) fue reconocido como ß2-m-libre [19]. El anticuerpo policlonal de conejo anti-b2-m-anticuerpo se adquirió de (1:100; Shanghai Jingtian, Biotecnología, China), TAP1 y TAP2 anticuerpo (1:300, Santa Cruz Biotechnology, respectivamente), el anticuerpo LMP2 y LMP7 (1:100 ; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU., respectivamente), el anticuerpo ERAP1 (1:200; Abcam), anticuerpo ERp57 (1:300, Santa Cruz Biotechnology), calnexina y calreticulina anticuerpos (1:50, Shanghai Jingtian, Biotecnología, china, respectivamente), y Tapasin anticuerpo (1:300, Santa Cruz Biotechnology). Brevemente, las secciones de 3 micras de espesor fueron cortadas de los bloques de tejido incluido en parafina. Después de ser desparafinado en xileno y se rehidrataron en alcohol y agua destilada, el antígeno fue recuperado por calentamiento en el horno de microondas durante 15 min a 95 ° C en tampón de EDTA (pH 8,0). Después de enfriamiento y lavado en agua destilada, la actividad de peroxidasa endógena fue bloqueada por las secciones incubando durante 15 min en 3% H
2O
2, seguido de lavado en PBS 0,01 M (pH 7,4) durante 10 min. Las muestras se incubaron previamente con una solución de bloqueo de proteína durante 10 minutos y las secciones fueron incubadas a 4 ° C durante la noche en una cámara húmeda con los anticuerpos indicados, los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS y después se incubaron con un anticuerpo secundario biotinilado (Biotecnología Zhong Shan Goldenbridge Co. Ltd., china) durante 15 min a temperatura ambiente. Los productos de reacción se visualizaron con diaminobencidina (DAB Kit; Zhongshan Goldenbridge Biotecnología). PBS se utilizó en lugar del anticuerpo primario como control negativo y las diapositivas se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron, y se evalúa bajo el microscopio de luz.
El porcentaje y la intensidad de las células tumorales positivamente teñidas en cada lesión se investigó por dos patólogos que no tenían conocimiento de las características de los pacientes. Se llegó a un número de consenso para cada muestra de tumor entre los dos investigadores. Los resultados se puntuaron en una escala de 0 a 3 por el porcentaje y la intensidad de las células positivas entre las células tumorales. El porcentaje de células positivas se puntuó como 0 para ≤10%, 1% de 11 a 25, 2 de 26 a 50%, 3% de 51 a 75, 4 para ≥76%. La intensidad de la tinción es la siguiente: 0 indica ausencia de tinción, 1 indica tinción débil, 2 indica tinción moderada y 3 indica una tinción intensa. Se utilizó la suma de ambas puntuaciones para identificar tres categorías de expresión: expresión normal (puntuación total 7-8), pérdida parcial de la expresión (3-6), y la pérdida total de la expresión (0-2). IHC tinción demostró una fuerte expresión de HLA-I en el tejido estromal y [20].
Extracción de ARN y RT-semicuantitativa células inflamatorias, proporcionando de este modo un control positivo interno, como se sugiere en un estudio previo infiltrantes de tumor PCR
ARN total fue extraído a partir de tejidos de los pacientes utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según lo recomendado por el fabricante. El ARNm (1μg) se transcribió de forma inversa en ADNc con RevertAid (MBI Fermentas, Burlington, Ontario, Canadá) a 42 ° C durante 60 minutos. El cDNA (20 ng) se amplificó por PCR en una mezcla de 25 l bajo las siguientes condiciones: 95 ° C durante 1 min, seguido de 25 o 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, hibridación a 60 ° C durante 30 seg, y síntesis a 68 ° C durante 1 min, y una extensión final a 68 ° C durante 10 min. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 4%, visualizado con GoldView I (Beijing Solarbio Co., Pekín, China) para la detección y cuantificación ultravioleta por el Sistema de Gel de imagen y software profesional (XR GelDoc, Bio-Rad Laboratories, CA, EE.UU.) . Cada análisis se repitió al menos dos veces para asegurar reproducido mRNA, mRNA β-actina se utilizó como una carga interna y el control de normalización. Avance y retroceso pares de cebadores y sus productos se enumeran en la Tabla S1
Líneas Celulares
Se obtuvieron las células de carcinoma humano SiHa de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.). . Las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con 10% FCS, L-glutamina, y antibióticos (Sigma-Aldrich).
Extracción de ADN, tratamiento con bisulfito, y bisulfito de secuenciación PCR (BSP)
se extrajo ADN de células SiHa utilizando un kit de extracción de ADN (QIAGEN, Valencia, CA, EE.UU.), y el ADN genómico (500 ng) fue-bisulfito modificado usando el kit EZ metilación Gold (Zymo Research, Orange, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante [21]. CpG cebadores específicos de fragmentos de la isla fueron diseñados mediante el escaneo de genes regiones promotoras utilizando software especializado de metilo Primer Express (empresa ABI) sobre la base de la información genética obtenida de la base de datos GenBank. ADN tratado con bisulfito de células de cáncer cervical se amplificó por PCR. Los cebadores usados para amplificaciones posteriores se enumeran en la Tabla S2. modificación completa bisulfito se confirmó por análisis de secuencia. BSP amplificaciones se realizaron en las mezclas de reacción de 50 l que contenía 2 l de ADN genómico modificado con bisulfito, dNTPs 2 l, cebadores 1,2 l, 2 l de MgCl
2, sulfato de amonio 20 nM,
. 75 nM Tris-HCl (pH 8,3), y 3 U de Taq ADN polimerasa. Se aplicó el esquema de PCR touch-down para amplificar con las siguientes condiciones de ciclo: 95 ° C desnaturalización durante 15 min, 95 ° C durante 20 s, temperaturas de recocido que van desde 62 ° C a 56 ° C durante 1 min, extensión a 72 ° C durante 1 min para 45 ciclos, y la incubación final a 72 ° C durante 7 min. temperaturas de hibridación fueron los siguientes: HLA-B: 60 ° C, TAP1:62 ° C, TAP2:56 ° C, LMP: 60 ° C, LMP2:58 ° C, Tapasin: 58 ° C, ERAP1:62 ° C, y ERP57:56 ° C. PCR fue seguido por la clonación en vectores y secuenciación para identificar los sitios CpG relacionados con el promotor del gen de metilación.
genómico de aislamiento de ADN y cuantitativa metilación del ADN Análisis
ADN genómico fue extraído utilizando un QIAamp DNA Mini Kit ( QIAGEN, Valencia, CA). Para la detección cuantitativa de ADN metilado, MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA, EE.UU.) se utilizó para analizar el ADN de tejido cervical para su contenido de CpG. gen diana pares de cebadores específicos se utilizaron para comparar los niveles de metilación de fragmentos diana y los sitios de CpG entre las diferentes muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante y como se describe anteriormente [22] - [23]. Las regiones analizadas y sitios CpG de promotores de genes candidatos se muestran en la Tabla S3. Los cebadores utilizados fueron diseñados de acuerdo con la Norma Sequenom EpiPanel (Sequenom, noviembre de 2007 y la versión Tabla S4). La amplificación por PCR se realizó con los siguientes parámetros: la mezcla de PCR contenía 10 ADN tratado con bisulfito ng, dNTPs 200 mM, 0,2 U de Hot Start Taq ADN polimerasa (QIAGEN), y 0,2 mM cebadores directos e inversos en un volumen total de 5μl. Los ciclos incluyen un arranque en caliente a 94 ° C durante 15 min, seguido de desnaturalización a 94 ° C durante 20 s, hibridación a 56 ° C durante 30 segundos, extensión a 72 ° C durante 1 min (45 ciclos), con una final de incubación a 72 ° C durante 3 min. No incorporado dNTPs se desfosforiló mediante la adición de 2 ml de premezcla incluyendo 0,3 U con fosfatasa alcalina de camarón (SAP; Sequenom). La mezcla de reacción se incubó a 37 ° C durante 40 min y SAP fue entonces inactivado por calor durante 5 min a 85 ° C. Después del tratamiento SAP, se utilizó 2 ml del producto de PCR como molde para la
in vitro
transcripción y RNasa Se utilizó un corte para la reacción inversa, según las instrucciones del fabricante (Sequenom). Las muestras se acondicionaron y manchados en un 384-pad Spectro-CHIP (Sequenom) utilizando un nanodispenser MassARRAY (Samsung, Irvine, CA, EE.UU.), seguido por la adquisición de espectro en un espectrómetro analizador MassARRAY compacta masa MALDI-TOF (Sequenom). Los análisis de metilación se llevaron a cabo utilizando la aplicación EpiTYPER (Sequenom) para generar resultados cuantitativos para cada sitio CpG o un agregado de múltiples sitios CpG.
Determinación de VPH genotipos
ADN genómico fue extraído de tejidos del cuello uterino usando un kit QIAamp DNA Mini? (QIAGEN, Dusseldorf, Alemania) según las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza del ADN se determinaron por absorbancia a 260 y 280 nm. genotipos de VPH se detectaron utilizando Virus del Papiloma Humano Genotipado Diagnóstico Kit (yjkuang Genetel Pharmaceuticals, Shenzhen, China) y se analizaron utilizando genotipos de VPH ADN sistema de lectura de microarrays (VPH-GenoCam-9600, yjkuang Genetel Pharmaceuticals, Shenzhen, China)) como se describe [24]. Brevemente, el ADN del VPH se extrajo y se amplificó por PCR utilizando los siguientes parámetros: desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 52 ° C durante 45 seg, y 65 ° C durante 90 seg. Al final del último ciclo, la mezcla se incubó a 65 ° C durante 5 min. El chip genético fue preparado, productos de la PCR se hibridó, y se visualizó.
Los análisis estadísticos
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS versión 17. Todos los valores de p fueron de dos caras y el nivel de significación fue
P Hotel & lt; 0,05. prueba de Mann-Whitney se utilizaron para probar las variables continuas para las diferencias en las puntuaciones de tinción inmunohistoquímica entre el tumor y los tejidos normales de los componentes HLA-I y APM. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para la evaluación de las asociaciones con parámetros clínicos patológicos. los datos de metilación del ADN cuantitativos derivados de MassARRAY fueron tratados como variables continuas y las mediciones faltantes fueron imputados en los análisis de regresión multivariable usando muestras con reemplazo de los valores no perdidos (imputations individuales). asociaciones lineales entre 2 variables continuas se cuantificaron mediante el coeficiente de correlación de Pearson.
Resultados
APM componente y HLA-I Expresión en lesiones de cuello uterino
Todos los anticuerpos fueron probados en formalina fijo, embebido en parafina, tejidos cervicales normales, CIN y CSCC. patrones de tinción representativos de la clase I HLA cadenas pesadas, ß2-M y APM componentes se muestran en las figuras. 1 y la Figura S1. Como se muestra en la Figura 1, la tinción de HLA de clase I cadenas pesadas y ß2-m fueron localizados en las membranas de las células del epitelio cervical y células intersticiales, mientras que la tinción de los componentes de APM se localiza principalmente en el citoplasma del epitelio cervical. Anti- HLA de clase I y anticuerpos anti-ß2-M mostraron una fuerte tinción de las membranas celulares en el tejido cervical normal, mientras que un perfil de expresión muy variables en muestras de tejido CIN y CSCC, que van desde la pérdida parcial a la pérdida total de la expresión, pero disminución de la expresión, a la expresión normal. La expresión del HLA de clase I cadenas pesadas, ß2-M y APM componentes se resumen en la Tabla 1.
A-C. patrones de tinción de HLA-I, ß2-m y ERAP1, respectivamente. (APM Otros componentes TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, calnexina, calreticulina, ERp57, y la tinción Tapasin se muestra en la Figura S1), paneles A1-C1 representan los tejidos normales del cuello uterino con la expresión de la proteína normal. Paneles A2-C2 muestran la neoplasia intraepitelial cervical con pérdida parcial de la expresión de la proteína. Paneles A3-C3 muestran con carcinoma de cuello uterino débil o pérdida total de la expresión de proteínas.
De los 64 casos de CIN y los 63 casos CSCC se inscribieron en este estudio (Tabla I y Figura 2), el nivel de expresión de la proteína de los componentes de HLA de clase I y APM fue alterado de expresión normal a la pérdida parcial o pérdida total, con el desarrollo de epitelio normal de cuello uterino de CIN y CSCC. La pérdida total de la expresión de proteínas fue notable para la mayoría de los miembros de HLA de clase I y de la familia APM en CSCC comparación con los controles CIN o normales, a excepción de CNX y CRT. La pérdida parcial de la expresión de proteínas de HLA-I, ß2-m, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, Tapasin y ERp57 fue estadísticamente significativa para los casos de CIN en comparación con los controles normales.
Analizar las características clínico-patológicas ( graduado del tumor, estadio clínico y la metástasis del nódulo linfático) con la expresión de proteínas de HLA-I y componentes de APM (TAP-1, T-2, LMP2, LMP7, Tapasin, ERAP1, CNX, CRT y ERp57) en cancer.Results cervicales están representados como porcentaje (%). histograma superior A1 muestran los componentes de APM HLA-I y se expresa en tumores bien diferenciados, A2 muestran expresado en moderado a tumores poco diferenciados. B1 muestran expresado en ≤II un espectáculo tumor y B2 expresada en ≥II B, C1 espectáculo expresado en linfáticos metástasis en los ganglios tumorales negativos y C2 muestran expresado en metástasis de nódulos linfáticos del tumor positivo, respectivamente. *
P Hotel & lt; 0.05.
La asociación entre la expresión de HLA de clase I, ß2-m, y componentes de APM y las características clinicopatológicas se investigó en lesiones CSCC. Como puede verse en la Figura 2A, hubo una correlación inversa con la regulación por disminución de HLA-I, ß2-m TAP1, LMP7, y expresión de proteínas ERp57 y grado de diferenciación del tumor. Utilizando los criterios de clasificación de FIGO, la expresión de proteínas ERp57 fue significativamente menor en los tumores en etapas menores que en las etapas superiores (Figura 2B). Además, la regulación por disminución de HLA-I, TAP1, LMP7, Tapasin, CRT, y ERp57 tenía una correlación inversa con la metástasis de los ganglios linfáticos (Figura 2C). Ambas correlaciones fueron estadísticamente significativas (P & lt; 0,05). La regulación a la baja de los ß2-m, TAP1, TAP2, LMP7, ERAP1, Tapasin, y la expresión de la proteína ERp57 asociado positivamente con la expresión de HLA-I en las lesiones de NIC, mientras que ß2-m, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, ERp57, y expresión Tapasin positivamente asociado con HLA-I en las lesiones cancerosas. El descenso de regulación de cualquier componente de APM, excepto calnexina y calreticulina se asoció significativamente con el HLA de clase I baja regulación de la NIC y el grupo CSCC (P & lt; 0,05).
A fin de verificar los resultados del análisis de la tinción inmunohistoquímica, detectamos la transcripción de los componentes de APM HLA de clase I y por semi-cuantitativos RT-PCR. El nivel de expresión de HLA-A, -B y -C codificación para HLA-I fue menor en tanto CIN y CSCC que en los controles (Figura 3). Las transcripciones de TAP-1/2 y LMP2 /7 eran difíciles de detectar, y no hay transcripción de Tapasin y ERp57, en los tejidos CIN y CSCC. Sin embargo, no se encontraron diferencias para CNX y CRT de transcripción entre el CIN o CSCC y los controles (Figura 4). Aunque las muestras de RT-PCR y análisis de IHC eran de origen diferente, estos resultados sugieren que la tendencia de la regulación a la baja de la expresión génica objetivo, tanto a nivel transcripcional y traduccional fue comparable en el desarrollo de cáncer cervical, especialmente en la patogénesis de las lesiones precursoras.
M: 100-600 pb escaleras marcador. Los carriles 1 a mostrar el tejido cervical normal, 2 y 3 se muestra CIN, 4 muestra de tejido CSCC. los niveles de mRNA se normalizaron a beta-actina mRNA (D). La expresión del ARNm de la falta de un solo alelo de HLA-I afecta a la expresión normal de la superficie de las moléculas HLA-I de acuerdo con la proteína detectada por IHC.
Los niveles de expresión de los componentes de APM (TAP-1, TAP-2, LMP2, LMP7, Tapasin, ERAP1, CNX, CRT y ERp57) fueron analizados por semi-cuantitativos RT-PCR en el tejido normal de cuello uterino, CIN y CSCC. En comparación con el control, CIN y CSCC, los niveles de mRNA se normalizaron a beta-actina mRNA. El histograma superior ha mostrado los niveles de expresión de los componentes de APM en el tejido normal en cuello uterino, CIN y CSCC. Los resultados de la RT-PCR se representan como la media ± SD de 15 controles, 30 y 33 CIN CSCC, respectivamente. *
P Hotel & lt; 0.05.
perfiles de metilación del gen de la familia de APM en una línea celular CSCC
Debido a la relación teórica entre la hipermetilación del promotor del gen como una modificación epigenética con la regulación a la baja de la transcripción génica, se analizado HLA-B, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, ERAP1, Tapasin, y ERp57, debido a la regulación a la baja de estos genes en el cáncer o precursores lesiones cervicales, por estado de metilación de las islas CpG en la región promotora en células de carcinoma cervical SiHa por enfoque con bisulfito secuenciación. Por amplificación de diana islas CpG identificados por el software profesional con cebadores de secuenciación bisulfato (BSP, Figura 5) utilizando ADN genómico como molde, y seguido por la clonación y secuenciación, hemos encontrado varios grados de CpG metilación sitio de TAP1, TAP2, LMP7, Tapasin y ERp57 genes. Sin embargo, no se detectó metilación para HLA-B, LMP2, y ERAP1. Todos los sitios CpG metilados de genes candidatos se muestran en la Tabla S4, en el que la localización de los cebadores se presentaron en los subrayados, los sitios diana CpG en cursiva y en negrita metilado CpGs.
Cada verticales indican un sitio CpG individuo . posiciones de las líneas sólidas de cebadores BSP. Todos los cebadores BSP están diseñados para cubrir el sitio de inicio de la transcripción debe estar cerca de la transcripción sitio web inicial. Paneles AH representan HLA-B, TAP-1, T-2, LMP2, LMP7, Tapasin, ERAP1 y ERp57.
metilación del ADN en las lesiones cervicales y su asociación con la expresión del ARNm y la infección por el VPH
por un enfoque utilizando la plataforma de Sequenom MassARRAY para la detección cuantitativa de ADN metilado, se encontró que el nivel de metilación global del objetivo islas CpG de TAP1, LMP7 y genes ERp57 fue significativamente mayor en el ADN genómico de CSCC que en cualquiera CIN o normal se encontró, pero no hay diferencia para TAP2 y Tapasin (Tabla 2);
controles (0,05
P & lt). El nivel de metilación de TAP1 fue significativamente mayor en ambos CIN y CSCC que en los controles (
P
= 0,015 y 0,001, respectivamente). De LMP7 y genes ERp57, el nivel de metilación en CSCC, pero no en CIN, significativamente diferente del control (
P =
0.001). Un análisis más detallado de un solo sitio CpG metilación específica dentro de TAP1, LMP7 y ERp57 indica un aumento significativo en el nivel de metilación de la mayoría de los sitios CpG en Target islas CpG de TAP1, LMP7, y genes ERp57 en CSCC comparación con los controles, mientras que no significación estadística fue encontrado entre CIN y el control (
P Hotel & gt; 0,05).
Un análisis más detallado de los datos dio como resultado del análisis cuantitativo de metilación de CpG sitio único por la plataforma Sequenom MassARRAY, tiene TAP1 demostrado que el gen contiene 23 sitios CpG y el nivel de metilación entre dos o tres sitios CpG de CpG_1, CpG_2.3, CpG_4, CpG_16, CpG_19, CpG_20, CpG_21, CpG_22 y CpG_23 asociados entre sí, pero no se encontró asociación para el relación de la metilación de otros sitios CpG. LMP7 gen contiene 22 sitios CpG y el nivel de metilación entre CpG_1, CpG_2, CpG_6, CpG_8, CpG_9, CpG_12, 13, 14, CpG_20 y CpG_22 asociados entre sí. ERp57 gen contiene 9 sitios CpG, en el que CpG_1, CpG_2, CpG_5, CpG_6, CpG_7 tienen un significado entre el control y el grupo de cáncer. Aunque no significación estadística se encontraron de objetivo todo CpG nivel fragmento de metilación de TAP2 entre tres grupos, el análisis de los datos de resultado a partir del análisis cuantitativo de TAP2 solo sitio de metilación CpG ha demostrado que no había diferencias significativas en el nivel de metilación de sitios CpG_8 entre CSCC y los controles, pero no se encontró asociación para la relación de metilación de otros sitios CpG (
P Hotel & lt; 0,05).
Además, el análisis comparativo de TAP1, LMP7 y ERp57 metilación con los niveles de expresión de proteínas y la infección por HPV16 de alto riesgo mostró una correlación inversa de una alteración en la metilación isla CpG con los cambios en la expresión de proteínas de los genes correspondientes. Por otra parte, el nivel de metilación de estos genes fue significativamente mayor en los casos positivos para la infección por HPV16 que en los negativos (Tablas 3 y 4).
Discusión
inmunocompetencia reducida asociada con la regulación a la baja de HLA-I expresión ha sido frecuentemente reportado para los pacientes con aumento de la invasión tumoral y la metástasis, lo que implica que la anormalidad funcional de HLA-I en la presentación del antígeno celular más probablemente ser un evento clave en el desarrollo y progresión del tumor [20], [ ,,,0],25] - [26]
en este estudio, se investigó la asociación de la carcinogénesis cervical y la patogénesis de sus lesiones precursoras con la regulación aberrante de HLA-I y la expresión de APM en diferentes niveles, incluyendo la metilación del promotor del gen, transcripción. y la expresión de proteínas.