Extracto
Los marcadores moleculares en los fluidos bronquiales puede contribuir al diagnóstico de cáncer de pulmón. previamente se observó un aumento significativo de C4d que contiene fragmentos de degradación del complemento en el lavado broncoalveolar sobrenadantes (BAL) de pacientes con cáncer de pulmón en una cohorte de 50 casos y 22 controles (CUN cohortes). El presente estudio fue diseñado para determinar el rendimiento diagnóstico de estos fragmentos del complemento (en lo sucesivo denominados conjuntamente como C4d) en fluidos bronquiales. los niveles de C4d se determinaron en sobrenadantes BAL a partir de dos cohortes independientes: la cohorte CU (25 casos y 26 controles) y la cohorte HUVR (60 casos y 98 controles). Una serie de muestras de esputo espontáneas de 68 pacientes con cáncer de pulmón y 10 controles también se utilizó (LCCCIO cohorte). El contenido total de proteínas, C4 del complemento, complemento C5a, y CYFRA 21-1 también se midieron en todas las cohortes. los niveles de C4d se incrementaron significativamente en muestras de BAL de pacientes con cáncer de pulmón. El área bajo la curva ROC fue de 0,82 (IC del 95% = 0,71 a 0,94) y 0,67 (95% CI = 0,58 hasta 0,76) para la CU y las cohortes HUVR, respectivamente. Además, a diferencia de los otros marcadores, los niveles de C4d en muestras de BAL fueron muy consistentes a través de las cohortes CUN, Cu y HUVR. Curiosamente, la prueba de C4d aumentó notablemente la sensibilidad de la broncoscopia en las dos cohortes en el que los datos citológicos estaban disponibles (CUN cohortes y HUVR). Por último, en la cohorte LCCCIO, los niveles de C4d eran más altos en los sobrenadantes de esputo de pacientes con cáncer de pulmón (área bajo la curva ROC: 0,7, IC 95% = 0,56 a 0,83). En conclusión, C4d se eleva constantemente en los fluidos bronquiales de pacientes con cáncer de pulmón y puede ser utilizada para mejorar el diagnóstico de la enfermedad
Visto:. Ajona D, C Razquin, Pastor MD, Pajares MJ, García J, Cardenal F, et al. (2015) Niveles elevados de la activación del complemento C4d Producto en bronquiales Fluidos para el diagnóstico de cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (3): e0119878. doi: 10.1371 /journal.pone.0119878
Editor Académico: Cordula M. Stover, Universidad de Leicester, Reino Unido
Recibido: noviembre 20, 2014; Aceptado: February 2, 2015; Publicado: 23 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Ajona et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro de los archivos de papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por "proyecto UTE CIMA", el Gobierno español (Red Tematica de Investigación Cooperativa en cáncer RD12 /0036/0028, RD12 /0036/0040, RD12 /0036/0045, y RD12 /0036/0062, y Fondo de Investigación Sanitaria-Fondo Europeo de Desarrollo regional (FEDER) PI08 /1156, CD09 /00148, PI10 /01652, PI10 /00166, PI11 /00618, PI11 /02688, PI13 /00806, y PI14 /01686), y el Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (SALUD-F2-2010-258677-CURELUNG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. He leído la política de la revista y los autores de este manuscrito tener la siguiente intereses en competencia : Una solicitud de patente provisional ha sido llenado por Digna Biotech por los Dres. Ajona, Pajares, Montuenga, y Pio como inventores de "nuevos marcadores moleculares de cáncer de pulmón." (Aplicación de la Unión Europea de Patente Provisional no. EP12382113.) Esto no altera la adhesión de los autores a PLOS ONE políticas en materia de datos y materiales de uso compartido.
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. La tasa de supervivencia de cinco años en general para el cáncer de pulmón es de aproximadamente 15 a 20%, y menos de 5% en los casos de metástasis [2]. Una de las razones de un resultado tan triste es la falta de técnicas eficaces para el diagnóstico precoz de la enfermedad. Actualmente, el diagnóstico de cáncer de pulmón implica la combinación de los análisis radiológico e histológico de las lesiones. La broncoscopia flexible representa una prueba de diagnóstico inicial relativamente no invasiva en pacientes con sospecha de enfermedad, y es la principal herramienta de diagnóstico en pacientes con cáncer de pulmón céntrico. técnicas de broncoscopia para el diagnóstico de cáncer de pulmón incluyen el examen citológico de las muestras de biopsia bronquial, cepillo bronquial, lavado bronquial y lavado broncoalveolar (BAL) [3, 4]. La especificidad de la citología de material broncoscopia es 100%; sin embargo, la sensibilidad sigue siendo baja, especialmente en las lesiones más periféricas, para los que se necesitan rutinariamente procedimientos de diagnóstico más invasivos [5]. Por lo tanto, existe una demanda clínica de los marcadores adjuntos que pueden mejorar la sensibilidad de los procedimientos de diagnóstico de cáncer de pulmón.
múltiples biomarcadores detectables en los fluidos bronquiales de pacientes con cáncer de pulmón se han propuesto [6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12]. Recientemente, hemos demostrado que las células de cáncer de pulmón activan de manera eficiente la vía clásica del complemento. Como consecuencia, C4d, un producto de división estable de esta vía, se encuentra elevada en las muestras de plasma y BAL de pacientes con cáncer de pulmón [13]. El objetivo del presente estudio fue validar nuestra observación anterior en cohortes de casos y controles independientes. También tuvo como objetivo comparar el rendimiento diagnóstico de C4d con otros biomarcadores diagnósticos posibles: CYFRA 21-1, proteínas totales, C4 y C5a. CYFRA 21-1 mucho tiempo se ha propuesto como un biomarcador de cáncer de pulmón en los fluidos bronquiales [7, 14], proteínas de plasma se incrementan en los fluidos BAL de pacientes con cáncer de pulmón [15], C4 es una proteína de plasma abundante de la que se genera después de C4d del complemento activación [16], y C5a es un fragmento de complemento activa aumentó en muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas [17]. Nuestros resultados sugieren que la determinación de C4d en los fluidos de las vías respiratorias supera a los otros marcadores y puede ser útil en el estudio diagnóstico de pacientes con cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Muestras clínicas
El estudio incluyó tres cohortes de muestras de BAL y una de las muestras de esputo. BAL fluidos se obtuvieron de sujetos sometidos a broncoscopia diagnóstica y se almacenaron a -80 ° C. El procedimiento para la recogida de BAL se ha descrito anteriormente [15]. La cohorte de la Clínica Universidad de Navarra (CUN) incluyó muestras de LBA de 50 pacientes con tumores malignos de pulmón y 22 pacientes con enfermedades pulmonares no malignas. Más detalles de esta cohorte se ha informado anteriormente [15]. La cohorte de Charité-Universitätsmedizin (CU) incluye BAL especímenes de 25 pacientes con cáncer de pulmón y 26 sujetos control. Estos individuos de control se sometieron a broncoscopia para las enfermedades de las vías respiratorias no malignas tales como la infección, la estenosis de la vía aérea benigno o sarcoidosis. No se dispone de datos adicionales de esta cohorte. Se obtuvo el tercer cohorte en el Hospital Universitario Virgen del Rocío (HUVR) e incluyó BAL fluidos procedentes de 60 pacientes con cáncer de pulmón y 98 pacientes de control. Las características de estos pacientes se muestran en la Tabla 1. La broncoscopia se requiere en los pacientes de control debido a la presencia de hemoptisis o una lesión pulmonar en el pecho-radiografía o tomografía computarizada. Por último, la Clínica de Cáncer de Pulmón del Instituto Catalán de Oncología (LCCCIO) cohorte de muestras de esputo incluyó 68 muestras de pacientes con cáncer de pulmón y 10 muestras de individuos sanos. Las muestras se recogieron después de la expectoración espontánea, se diluyó en 10 ml de solución salina, ampliamente agitaron en vórtex, y se almacenaron a -80 ° C. Todos los protocolos de los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki, fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación de la Universidad de Navarra (Institutional Review Board#015-2014), y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. Los tumores pulmonares se clasificaron según la clasificación de la OMS de 2004 y el Sistema Internacional para la estadificación del cáncer de pulmón [18, 19].
mediciones de marcadores
C4d que contiene fragmentos fueron medidos por una enzima prueba de inmunoabsorción ligado (Quidel). Este ensayo reconoce todos los fragmentos que contienen C4d de activado C4 (C4b, iC4b y /o C4d), que en conjunto se hace referencia en este documento como C4d. ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas cuantitativos también se utilizaron para las determinaciones de C4 (Assaypro), C5a (R & amp; D), y CYFRA 21-1 (DRG Internacional). muestras de BAL se diluyeron 1:10, 1: 1000, 1: 100, y 1:25 para el análisis de C4d, C4, C5a, y CYFRA 21-1, respectivamente. especímenes de esputo se diluyeron 1: 4 para C4d cuantificación. La proteína total se midió usando el ensayo de proteínas BCA (Pierce). Todas las mediciones de biomarcadores se realizaron a posteriori por el personal de laboratorio que no conocen el diagnóstico. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en un único laboratorio siguiendo las instrucciones del fabricante.
Los análisis estadísticos
software
SPSS 15,0 se utilizó para el análisis estadístico. La normalidad se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Dos caras prueba de Mann-Whitney o la prueba de Kruskal-Wallis H se utilizaron para comparar los datos no distribuidos normalmente a partir de dos o más grupos, respectivamente. niveles de los marcadores se muestran como mediana (rango intercuartil). (ROC) curvas características de funcionamiento del receptor se generaron con el fin de evaluar el rendimiento diagnóstico de los biomarcadores. Las diferencias estadísticas entre el área bajo la curva ROC y un área de referencia bajo la curva ROC de 0,5 se calcularon con una prueba de puntuación z. También se calcularon los intervalos de noventa y cinco por ciento de confianza. Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
niveles de C4d en los sobrenadantes BAL de pacientes con cáncer de pulmón
En un estudio previo se encontró que los niveles de C4d- que contiene fragmentos de degradación del complemento (se hace referencia de forma conjunta como C4d) se incrementaron en muestras de BAL de pacientes con cáncer de pulmón cuando se compara con muestras de pacientes con enfermedades pulmonares no malignas [13]. En pocas palabras, los niveles de C4d, que se muestran como mediana (rango intercuartil), fueron 0,26 (0,11 a 0,54) mg /ml en el grupo de cáncer de pulmón y 0,11 (0,11-0,23) mg /ml en el grupo de control (P & lt; 0,001). El área bajo la curva ROC fue de 0,73 (IC del 95% = desde 0,61 hasta 0,84; p = 0,002). Este análisis se realizó en muestras de BAL de una cohorte de pacientes en el presente documento denotados como CUN cohorte. Las características de estos pacientes ya se han publicado [15]. En el presente estudio, hemos tratado de validar este resultado utilizando dos cohortes independientes de muestras de BAL: el HUVR y las cohortes de CU. En este último cohorte, los niveles de C4d en muestras de cáncer de pulmón y controles fueron 0,19 (0,11 hasta 0,84) y 0,11 (0,11 a 0,13) g /ml, respectivamente (P & lt; 0,001; Fig. 1A). El área bajo la curva ROC fue de 0,82 (IC del 95% = 0,71 a 0,94; P & lt; 0,001). En la cohorte HUVR, los niveles de C4d en el grupo de cáncer fueron 0,18 (0,15 a 0,26) mg /ml, y en el grupo de control fueron 0,16 (0,14 a 0,18) mg /ml (P & lt; 0,001; Fig. 1B). El área bajo la curva ROC fue de 0,67 (IC del 95% = 0,58 a 0,76; P & lt; 0,001). En esta cohorte, los niveles de C4d tendieron a ser mayores en los fluidos BAL por cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) pacientes o ex fumadores, aunque las diferencias no alcanzaron significación estadística (Tabla 1). De acuerdo con esta observación, en nuestro estudio anterior (CUN cohorte) se encontró un aumento significativo de C4d en los ex fumadores en el grupo de cáncer, y una tendencia hacia niveles de C4d mayor en pacientes con CPCP [13].
A) los niveles de C4d y la curva ROC a partir de sobrenadantes BAL de la cohorte de CU. B) los niveles de C4d y la curva ROC de muestras de BAL de la cohorte HUVR. Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante la prueba de Mann-Whitney. Las áreas bajo la curva ROC (AUC) y sus valores asociados P se indican.
Comparación de rendimiento de C4d con otros marcadores moleculares
Con el fin de evaluar la utilidad de C4d como biomarcador de diagnóstico en los fluidos BAL, que comparó su desempeño con otros marcadores moleculares de diagnóstico potenciales. Con este fin, hemos medido los niveles de CYFRA 21-1, C4 y C5a en las cohortes CUN, CU, y HUVR. A excepción de CYFRA 21-1 y C5a en la cohorte CUN, y por C5a en la cohorte HUVR, los niveles de todos los marcadores fueron significativamente superiores en pacientes con cáncer de pulmón (Tabla 2).
La acumulación de las proteínas plasmáticas en el intersticio del tumor es una característica común de los tumores sólidos [20]. De hecho, las proteínas del plasma se pueden encontrar en los fluidos BAL de pacientes con cáncer de pulmón [15]. De acuerdo con esta observación, en las tres cohortes, los niveles de proteínas totales se encontraron un aumento en los fluidos BAL de pacientes con cáncer de pulmón en comparación con los controles (Tabla 2). Para evaluar la posibilidad de que el C4d, CYFRA 21-1, C4 y C5a se encontraron en muestras de BAL como una mera consecuencia de su extravasación de la sangre, analizamos el enriquecimiento de estos marcadores en muestras de BAL de pacientes con cáncer de pulmón con respecto al uso de la sangre contenido total de proteína como de referencia (Tabla 3). proporciones muy similares de C4 fueron encontrados en muestras de BAL y la sangre, lo que sugiere que la presencia de esta proteína del complemento en el microambiente tumoral es debido principalmente a su extravasación. Sin embargo, CYFRA 21-1, C4d, y C5a mostraron una proporción significativamente más alta en los fluidos BAL, lo que sugiere una producción local de estas moléculas en el microambiente tumoral.
Un factor que influye mucho en el rendimiento y utilidad de un marcador diagnóstico es su consistencia a través de diferentes poblaciones de pacientes. por lo tanto, se compararon los niveles de los cuatro marcadores moleculares a través de las tres cohortes independientes. Como se muestra en la Fig. 2, no se observaron diferencias significativas entre los pacientes con cáncer de pulmón en las cohortes CUN, CU, y HUVR de CYFRA 21-1, C5a, C4 y proteína total (P & lt; 0,001, P & lt; 0,001, P & lt; 0,001 y P = 0,029, respectivamente). Hemos observado mayores niveles de estos marcadores en la cohorte Cun, aunque la razón de esta diferencia no está clara. Sin embargo, los niveles de C4d eran notablemente similares en las tres series sin diferencias significativas entre ellos (p = 0,922). La consistencia de los niveles de C4d permitió proponer valores de corte de C4d con una sensibilidad y especificidad satisfactoria a través de las tres cohortes. Por ejemplo, con un valor de corte de 0,18 g /ml, la sensibilidad en el diagnóstico de cáncer de pulmón fue del 62%, 52% y 53%, con una especificidad del 73% (odds ratio (OR) = 4,35, 95 % CI = 1,45 a 13,05, P = 0,009), 100% y 80% (OR CI = 4,46, 95% = 02/20 a 09/03, P & lt; 0,001) en las cohortes CUN, Cu y HUVR, respectivamente. Cuando se combinaron los tres estudios en conjunto, la sensibilidad fue del 56% y la especificidad fue del 82% (OR = 5,94, IC del 95% = 3,45 a 10,24, P & lt; 0,001). En resumen, podemos concluir que el C4d se produce dentro del microambiente del tumor de pulmón, lo que resulta en un aumento constante de esta molécula en los fluidos BAL de pacientes con cáncer de pulmón.
A) C4d (datos de la cohorte CUN se publicó anteriormente [ ,,,0],13]). B) CYFRA 21-1. C) C5a. D) C4. E) La proteína total. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba de Kruskal-Wallis.
La determinación de C4d en los sobrenadantes BAL como un complemento de la citología para el diagnóstico del cáncer de pulmón
Se evaluó la capacidad de la próxima determinación de C4d a mejorar el rendimiento diagnóstico del examen citológico del material de broncoscopia, una técnica con una alta especificidad pero baja sensibilidad. Para este fin se utilizó las dos cohortes de la que hemos tenido datos de citología: CUN y HUVR cohortes. En la cohorte de Cun, el examen citológico de las muestras de BAL dio una especificidad del 100% y una sensibilidad del 32%. Examinando el valor diagnóstico de la información proporcionada por C4d, encontramos que este marcador se incrementó significativamente en ambos sobrenadantes BAL citológicamente positivos y negativos de pacientes con cáncer de pulmón (Fig. 3). Los niveles de C4d en el grupo de control fueron 0,11 (0,11 hasta 0,23) mg /ml y aumentó a 0,33 (0,23 hasta 0,5) mg /ml en muestras citológicamente positivos (P & lt; 0,001), y a 0,24 (,11-,62) g /ml en muestras citológicamente negativos (P = 0,018). Las áreas bajo las curvas ROC fueron 0,85 (IC del 95% = 0,71-0,98; p & lt; 0,001) y 0,67 (IC del 95% = 0,53 a 0,81; p = 0,033), respectivamente. El rendimiento diagnóstico de C4d fue mejor en muestras de BAL con citología positiva, aunque no se encontraron diferencias significativas entre estos dos grupos (p = 0,187). Este resultado sugiere que la determinación de los niveles de C4d puede ser útil incluso en los casos en los que el examen citológico de los fluidos de BAL se reporta como negativo. De hecho, utilizando el valor de corte establecido anteriormente (0,18 g /ml), 18 de los 34 cánceres de pulmón reportados como negativos por el examen citológico fueron clasificados como positivos por determinación de C4d, el aumento de la sensibilidad en el diagnóstico de cáncer de pulmón de un 32% a 68%, con una especificidad del 73%. Esta observación fue validada con el análisis de la cohorte HUVR. El examen citológico en esta cohorte arrojó una sensibilidad del 32% y una especificidad del 100%. El contenido de C4d en BAL sobrenadantes aumentó significativamente en ambos sobrenadantes citológicamente positivos y negativos BAL de cáncer de pulmón en comparación con los sujetos control (Fig. 4). los niveles de C4d en el grupo de control fueron 0,16 (0,14 hasta 0,18) mg /ml, y aumentó a 0,22 (0,16 a 0,40) mg /ml en muestras citológicamente positivos (P & lt; 0,001), y a 0,18 (0,15 a 0,23) g /ml en muestras de citología negativa (p = 0,017). Las áreas bajo las curvas ROC fueron 0,76 (IC del 95% = 0,63 hasta 0,88; P & lt; 0,001) y 0,63 (IC del 95% = 0,52 a 0,74; p = 0,011), respectivamente. No se observaron diferencias significativas en los niveles de C4d entre muestras de BAL citología positiva y negativa (P = 0,123). Con un valor de corte de 0,18 g /ml, 19 de los 41 tipos de cáncer reportados como negativos por citología fueron clasificados como positivos por C4d, el aumento de la sensibilidad en el diagnóstico de cáncer de pulmón de 32% a 63%, con una especificidad del 80 %.
los valores de p se calcularon utilizando la prueba de Mann-Whitney. Las áreas bajo la curva ROC (AUC) y sus valores asociados P se indican.
Los valores de p se calcularon utilizando la prueba de Mann-Whitney. Las áreas bajo la curva ROC (AUC) y sus valores asociados P se indican.
niveles de C4d en los sobrenadantes del esputo de pacientes con cáncer de pulmón
El diagnóstico de cáncer de pulmón en un examen de esputo es una alternativa atractiva a broncoscopia. Con el fin de evaluar la utilidad preliminar de C4d como marcador de diagnóstico en este espécimen biológico, los niveles de C4d se determinaron en muestras de esputo espontáneas de pacientes con cáncer de pulmón (n = 68) de la cohorte LCCCIO. los niveles de C4d variaron de 0,04 a 0,56 g /ml, con una mediana (IQR) de 0,06 (0,06-0,07) g /ml. No se encontraron asociaciones significativas entre los niveles del marcador y los datos clínico-patológicos, como el sexo, el tabaquismo, la histología (NSCLC contra SCLC) o de la etapa (I-III vs IV). Por último, se compararon los niveles de C4d en estas muestras de esputo con los niveles en 10 controles sanos. Como se muestra en la Fig. 5, los niveles de C4d eran ligeramente superiores en los sobrenadantes de esputo de pacientes con cáncer de pulmón que en los de los sujetos control (p = 0,047). El área bajo la curva ROC fue de 0,7 (IC 95% = 0,56-0,83, P = 0,047). Con un 0,06 g /ml de corte, la sensibilidad y especificidad fueron del 54% y 80%, respectivamente. En conclusión, los niveles de C4d son significativamente superiores en las muestras de esputo espontáneas de pacientes con cáncer de pulmón que en esas muestras de sujetos sin cáncer.
Los valores de p se calcularon utilizando la prueba de Mann-Whitney. El área bajo la curva ROC (AUC) y su valor de p asociado se indican.
Discusión
En este estudio, hemos demostrado que C4d que contiene fragmentos de degradación del complemento (denominados conjuntamente como C4d) se encuentra elevado en los fluidos bronquiales de pacientes con cáncer de pulmón y su determinación se comporta mejor que los biomarcadores de proteínas previamente propuestos para el diagnóstico del cáncer de pulmón. Nuestras conclusiones están soportadas por cuatro observaciones principales: i) hemos validado, en dos cohortes independientes, el aumento de C4d observado previamente en una cohorte de muestras de BAL de pacientes con cáncer de pulmón [13]; ii) no se observaron diferencias en los niveles del marcador a través de muestras de BAL de pacientes con cáncer de pulmón de tres cohortes independientes; iii) C4d cuantificación mejoró la sensibilidad del examen citológico del BAL fluidos; y iv) los niveles de C4d se incrementaron ligeramente en el sobrenadante de esputo de pacientes con cáncer de pulmón
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Hasta ahora, los esfuerzos para identificar clínicamente valiosos marcadores de diagnóstico para el cáncer de pulmón han fracasado o han tenido un éxito limitado. Esto puede explicarse en parte por el bajo grado de reproducibilidad entre los estudios independientes, debido a la gran heterogeneidad genética y fenotípica de los tumores de pulmón [21]. Para superar esta limitación, se ha sugerido que los marcadores relacionados con la inmunidad podría ser más homogénea y sensible que marcadores de cáncer derivado de [22]. En este sentido, durante la transformación neoplásica, las células tumorales de pulmón de diferentes subtipos histológicos pueden ser reconocidos por el sistema del complemento [17], [23, 24]. El complemento es una parte importante de la respuesta inmune innata que defiende al huésped contra los elementos no propios. Curiosamente, debido a la elevada expresión de inhibidores del complemento, las células de cáncer de pulmón de control de la activación del complemento y son resistentes a la citotoxicidad [23, 24, 25, 26, 27] mediada por el complemento. Esta respuesta inmune controlada puede resultar en una liberación permanente de fragmentos de complemento al microambiente del tumor, lo que explicaría por qué C4d, un fragmento se originó a partir del complemento C4, se incrementó en los fluidos biológicos de pacientes con cáncer de pulmón [13]. Curiosamente, hemos observado concentraciones notablemente similares de C4d a través de muestras de BAL de las tres cohortes estudiadas. Este es un punto relevante, ya que la normalización de las mediciones entre diferentes estudios es un problema importante en el descubrimiento de biomarcadores [28, 29]. En relación con la fuente primaria de C4d, esta molécula es un fragmento proteolítico de complemento C4 generada después de la activación de la vía clásica del complemento [16]. Por lo tanto, la explicación más plausible para su presencia en el microambiente tumoral sería su producción local después de la activación de esta vía canónica. Sin embargo, no podemos descartar otros mecanismos. Por ejemplo, exoproteasas presentes en los fluidos biológicos de pacientes con cáncer pueden generar péptidos a partir de proteínas del complemento [30]. Por otro lado, aunque los niveles de C4d también aumentan en el plasma de pacientes con cáncer de pulmón [13], los niveles del marcador en fluidos bronquiales son notablemente más altos que los esperados por la extravasación, lo que favorece el origen local de C4d.
también encontró que C4d obtenido mejores resultados que otros marcadores relacionados del complemento C4, y C5a, o el marcador tumoral propuesta CYFRA 21-1. En el caso de C4, la molécula precursora para C4d, llegamos a la conclusión de que su presencia en los fluidos de las vías respiratorias es sobre todo debido a su extravasación de la sangre. Del mismo modo, el aumento de los niveles de otras proteínas plasmáticas extravasadas, como el factor H del complemento o albúmina, se observaron previamente en los fluidos bronquiales de pacientes con cáncer de pulmón [15]. Por otro lado, nuestros datos sugieren una producción local de C5a, una anafilotoxina que puede ser producido por las células de cáncer de pulmón [17]. Sin embargo, se encontró que este marcador aumentado significativamente en muestras de BAL de pacientes con cáncer de pulmón en sólo una de las tres cohortes. Se observaron resultados similares con CYFRA 21-1, uno de los biomarcadores de cáncer de pulmón más estudiados en la literatura [7, 14]. Nuestros datos sugieren una producción local de CYFRA 21-1 en el microambiente del tumor, pero sus niveles a través de las cohortes fueron poco consistente y no se encontraron diferencias entre las muestras malignas y no malignas en una de las series. Estas observaciones sugieren que C5a y CYFRA 21-1 se producen en la presencia de tumores de pulmón, sino también en la presencia de condiciones inflamatorias no malignos comunes a los pacientes sometidos a broncoscopia.
Dada la relativamente baja sensibilidad de la citología examen de las muestras de broncoscopia, por lo general se necesitan pruebas de diagnóstico más invasivos. En este contexto, un procedimiento de diagnóstico útil para determinar qué pacientes con sospecha de cáncer de pulmón, pero broncoscopias negativos, deben ser sometidos a las pruebas de diagnóstico adicional sería clínicamente relevante. En este estudio, la adición de C4d cuantificación para el procedimiento de diagnóstico aumentó la sensibilidad de la broncoscopia, aunque reducido su especificidad. La reducción de la especificidad puede limitar su adopción como una herramienta de diagnóstico clínico de rutina. Sin embargo, la consistencia del marcador a través de las cohortes independientes de muestras de fluidos bronquiales y su mejor rendimiento que los biomarcadores previamente propuestos fomentar la integración de C4d en un panel de biomarcadores para complementar la citología en el diagnóstico de la enfermedad. Este es un punto importante, ya que los nuevos paneles de biomarcadores tales como autoanticuerpos, microARNs o clasificadores proteómicos han arrojado resultados prometedores en muestras de sangre de cohortes clínicas de cáncer de pulmón [31, 32, 33]. Además, nuestros datos sugieren que la evaluación C4d en muestras de esputo no invasivos también puede ser una herramienta útil para el diagnóstico del cáncer de pulmón. Esta observación, basada en una pequeña cohorte de muestras de esputo, merece una evaluación adicional en serie más grandes usando clínicamente más relevantes controles con enfermedades pulmonares no malignas. Otros aspectos que deben aclararse son el rendimiento del ensayo en los diferentes subtipos histológicos, así como la influencia de fumar, y enfermedades respiratorias no malignas específicas y tratamientos sobre los niveles de C4d. En la actualidad, podemos concluir que los niveles de C4d se incrementan constantemente en los fluidos bronquiales de pacientes con cáncer de pulmón y pueden complementar la citología en el diagnóstico de la enfermedad.
Reconocimientos
Agradecemos Amaya Lavin, Usua Montes y Ana Remírez de asistencia técnica.