Extracto
Antecedentes
inhibidores de la deacetilasa
histonas (HDACIs) vuelven a expresarse con silenciador los genes supresores de tumores y están actualmente en ensayos clínicos. Aunque HDACIs se han conocido para inducir la expresión de genes, un número igual de genes son downregulated a la inhibición de HDAC. El mecanismo detrás de esta regulación a la baja sigue siendo poco clara. Aquí nos proporcionan pruebas de que varios genes de reparación del ADN están regulados a la baja por la inhibición de HDAC y proporcionan un mecanismo que implica el factor de transcripción E2F1 en el proceso.
Metodología /Principales conclusiones
La aplicación de Análisis de anotación funcional (AFA ) en los datos de microarrays de células de cáncer de próstata tratados con HDACIs, encontramos una serie de genes de la respuesta al daño del ADN y las vías de reparación están regulados a la baja por HDACIs. AFA reveló enriquecimiento de recombinación (HR) genes homólogos de reparación del ADN de la vía de BRCA1, así como los genes regulados por el factor de transcripción E2F1. células de cáncer de próstata demostraron una disminución de la capacidad de reparación del ADN y un aumento de la sensibilización a los a los productos químicos y la radio-DNA agentes que dañan a la inhibición de HDAC. El reclutamiento de proteínas clave de reparación de recursos humanos para el sitio de daño en el ADN, así como la capacidad de reparación de recursos humanos se ha visto comprometida por tratamiento HDACi. En base a los datos de la AFA, la hipótesis de que los factores de transcripción E2F pueden jugar un papel en la regulación a la baja de los genes de reparación clave sobre la inhibición de HDAC en células de cáncer de próstata. Chip análisis y ensayos de luciferasa revelan que la regulación a la baja de los principales genes de reparación está mediada por el reclutamiento disminución del factor de transcripción E2F1 y no a través de la represión activa de E2Fs represivas.
Conclusiones /Importancia
Nuestro estudio indica que varios genes en la vía de reparación del ADN se ven afectados a la inhibición de HDAC. Regulación a la baja de los genes de reparación es a causa de una disminución de la cantidad y el promotor de la contratación del factor de transcripción E2F1. Dado que la inhibición de HDAC afecta a varias vías que podría potencialmente tener un impacto en la reparación del ADN, la reparación del ADN en peligro a la inhibición de HDAC también podría atribuirse a varios otras vías además de los investigados en este estudio. Sin embargo, nuestro estudio proporciona conocimientos sobre el mecanismo que rige la regulación a la baja de los genes de reparación del ADN de recursos humanos de la inhibición de HDAC, lo que puede conducir al uso de razón HDACIs en las clínicas
Visto:. Kachhap SK, Rosmus N, Collis SJ , Kortenhorst MSQ, Wissing MD, Hedayati M, et al. (2010) regulación a la baja de ADN recombinación homóloga genes de reparación de HDAC inhibición en el cáncer de próstata está mediada por el factor de transcripción E2F1. PLoS ONE 5 (6): e11208. doi: 10.1371 /journal.pone.0011208
Editor: Kerstin Borgmann, Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Alemania |
Recibido: 17 Marzo, 2010; Aceptado: 25-may de 2010; Publicado: 18 Junio 2010
Derechos de Autor © 2010 Kachhap et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo con el apoyo de asistente de vuelo Instituto de Investigación médica, el Fondo David Koch que fue proporcionado por la Fundación del cáncer de próstata, cáncer de próstata Fundación Grant, Programa de Investigación Especializada beca de excelencia P50-58236, y AEGON. MDW es apoyado por la Fundación Dr. Saal van Zwanenberg. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
regulación epigenética de la expresión génica se cree que está provocada por ambos moduladores de la cromatina que modifican colas N-terminales de las histonas y el ADN metilantes enzimas que metilan grupos CpG en las regiones promotoras de los genomas eucariotas [1], [2 ], [3]. Las células cancerosas modulan la maquinaria epigenética para silenciar supresores de tumores metastásicos y para obtener el crecimiento selectivo y propiedades invasivas [4], [5], [6]. La clase de HDAC I y enzimas de clase II formar complejos con co-represores, tales como NuRD y los complejos SMRT /NCoR [7]. Las células de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata (CaP), reclutar diferentes HDAC asociados a estos grandes complejos multi-proteína co-represor para silenciar genes supresores de tumores y esto sirve como una justificación para el uso de HDACIs para tratar el cáncer [8], [9] .
La actividad tanto de clase I y de clase II HDAC se inhibe por los ácidos grasos de cadena corta (fenilbutirato, ácido valproico (VPA)) y ácidos hidroxámicos (vorinostat, tricostatina A), mientras que benzamidas (MS-275) parecen ser específicos de la clase I HDACs [8]. A la inversa, clase III HDACs, las sirtuinas, no se inhibieron por cualquiera de estos agentes [10]. Recientemente, vorinostat ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento de linfoma de células T cutáneo. Nosotros y otros han demostrado que el tratamiento del CaP con HDACIs o inhibidores de la ADN metiltransferasa Alivia la represión, haciendo que la reexpresión de los supresores de tumores silenciados que conducen a la detención del ciclo celular, la senescencia y la apoptosis [11], [12], [13]. La combinación de HDACIs con otros agentes ha demostrado ser eficaz para una amplia variedad de cánceres. Aunque HDACIs se han sabido para regular positivamente un número de genes, paradójicamente un número igual de genes son reprimidos a la inhibición de HDAC [14], [15], [16]. La represión de los genes sobre la inhibición de HDAC puede ser el resultado de las acciones indirectas de represores que se activan y provocar la represión de una forma pasiva de HDAC, o la represión podría ser provocada por el reclutamiento activo de HDAC a los promotores de los genes seleccionados [17]. Vías que están regulados a la baja de la inhibición de HDAC crean configuraciones para las modalidades de tratamiento que son ineficaces en su presencia. Informes recientes sugieren que HDACIs tales como fenil-butirato, VPA, MS-275 y SAHA pueden potenciar sensibilidad a la radiación de las células del cáncer [18], [19], [20], [21]. regulación a la baja de la transcripción de ciertos genes implicados en la recombinación homóloga (HR) y recombinación no homóloga (NHEJ) vías de reparación del ADN han sido implicados [18], [19], [20], [22].
doble filamento se rompe (DSBs) pueden ser inducidos por agentes endógenos, tales como especies de oxígeno reactivo y replicación de estrés por las horquillas de replicación atascadas, o pueden ser inducidas por agentes exógenos como la radiación [23] ionizante. Cada vez es más evidente que el daño del ADN es detectada por los complejos de proteínas, denominada sensores de daño en el DNA, que a su vez inducen una cascada de transducción de señales que reclutan proteínas mediadoras y efectoras de los lugares dañados, lo que lleva a la reparación del ADN [24]. Dependiendo de la extensión del daño, más transducción de la señal avisa que la célula o bien retrasar el ciclo celular a través de la activación de punto de control para los procesos de reparación para completar, o someterse a la apoptosis [24]. Cada tipo de daño en el ADN es detectada y reparada por vías de reparación del ADN distintos. El complejo MRN, que consiste en complejo mediador Mre11-Rad50-NBS1, detecta DSBs y recluta ATM, una quinasa PI3K-como, al sitio de DSBs [25]. Cajero automático se activa después de la contratación de las DSB y fosforila los sustratos aguas abajo, iniciando el proceso de transducción de señales [26].
ATM y ATR relacionados quinasas, y DNAPK, fosforilan una variante de la histona H2AX γ-en Ser-139 que carga a sitios de DSB y cubiertas megabases que flanquean las DSB; Esto constituye la focos de irradiación inducida. Fosforilados γ-H2AX recluta varias proteínas mediadoras [27]. Entre estos mediadores son el complejo de vigilancia asociado BRCA1 y 53BP1. La cascada de transducción de señal se amplifica aún más por control-quinasas transductor, CHK1 y CHK2, que se activan después de la fosforilación de ATM y ATR. ATM y ATR junto con CHK1 /quinasas fosforilan CHK2 una serie de sustratos que incluyen efectoras BRCA1, Rad51, p53, y Mdm2 [28]. La fosforilación de p53 conduce a su estabilización, provocando una detención del ciclo celular a través de la inducción de p21, o en el caso de mayor daño en el ADN, la apoptosis. horquillas de replicación atascadas que surgen debido a daños en el ADN y replicación de estrés, son detectadas por PCNA relacionados Rad9-Rad1-Hus1 o el complejo 911, cuya contratación al sitio estancado está mediada por la proteína de replicación A y ATR. Las proteínas efectoras finales que reparan el ADN dañado se activan y reclutados por las quinasas mencionadas anteriormente y las proteínas mediadoras en el sitio del daño y la reparación se produce.
Los genes de las vías de reparación del ADN son estrictamente regulados tanto en la transcripción y publicar nivel transcripcional. A nivel transcripcional, los factores de transcripción E2F se han conocido a desempeñar un papel en la regulación de proteínas de reparación. Hay nueve conocidos factores de transcripción E2F que se pueden dividir en activadores de la transcripción (E2F1, E2F2, E2F3a) y represores (E2F4-8); E2F3b ha planteado la hipótesis de funcionar como un represor [29]. E2F1 y E2F4 se han implicado en la regulación de CHK1, los genes BRCA1 y RAD51 [30], [31], [32].
Recientemente, se informó de una novela "de múltiples bucles, de doble cubo" ADNc microarrays de diseño, para analizar los cambios inducidos por inhibidores de HDAC en la expresión génica a través de líneas de células de CaP sensibles y resistentes [16]. Análisis de la aplicación de la anotación funcional (AFA) en el conjunto de datos del experimento de microarrays anterior se encontró que varios genes de la reparación de recursos humanos y vía de respuesta a los daños del ADN están regulados por disminución de la inhibición de la HDAC. En este informe, demuestran la regulación negativa de la transcripción de varios genes de respuesta al daño del ADN en las células ACC a la inhibición de HDAC, proporcionar evidencia funcional de la implicación de la vía de reparación de recursos humanos en la reparación del ADN comprometida, y proporcionar una función del factor E2F1 transcripción en la regulación a la baja de ADN los genes de respuesta al daño.
resultados
AFA revela HDACIs downmodulate varios genes del daño en el ADN y la vía de respuesta en el CaP
AFA se realizó en nuestro conjunto de datos de microarrays publicado recientemente dos líneas celulares PCA (PC3 y DU-145) tratados con vorinostat (anteriormente conocido como SAHA) y VPA [16]. El análisis reveló regulación a la baja de varios genes que participan en la respuesta al daño y reparación del ADN (Tabla 1). análisis de la interacción proteína-proteína en los datos de microarrays reveló varios genes relacionados con la E2F1 y las vías de BRCA1 se downregulated con ambas HDACIs más de 1,3 veces en ambos líneas de células de CaP (Fig. 1a). Muchos de estos genes regulados negativamente están involucrados en la vía de reparación del ADN de recursos humanos. Sorprendentemente, los genes relacionados con la vía NHEJ, específicamente DNAPK y Ku, no se vieron afectados en nuestros arrays. Los informes anteriores han demostrado que RAD51 es downregulated tras el tratamiento inhibidor de HDAC en una variedad de líneas de células [18], [19], [20]. Nuestros datos de microarrays reveló que, además de Rad51 y genes relacionados, una amplia variedad de genes implicados en la ruta de respuesta daño y reparación del ADN como el BRCA1, Chk1, Topo IIα, Hus1, y BubR1, fueron downregulated tras el tratamiento inhibidor de HDAC (Fig. 1b) .
a) las células DU145 y PC3 se trataron con dos diferentes HDACIs (vorinostat (SAHA, 1 M), y VPA (ácido valproico, 1 mM) durante períodos de incubación (2 días y 4 días). AFA revela abajo regulación de los genes implicados en el daño del ADN y la respuesta (ver Tabla 1). los resultados de la AFA para la interacción proteína-proteína BRCA1 y E2F indicar redes de interacción se ven afectados por la inhibición de la HDAC. el código de color representa un 10
-n
p-
valores obtenidos en la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. b) ≥1.3 genes de reparación del ADN downregulated veces en ambos PC3 y células DU-145 tras el tratamiento con VPA y tanto vorinostat. c) Validación de la AFA fue hecho por un análisis de Q-PCR en un subconjunto de los genes regulados negativamente en el tratamiento de VPA 1,5 mM. Los resultados se representan como factor de cambio respecto a las células control sin tratar.
Con el fin de comprender la consecuencia de modulación negativa y ganar más conocimientos sobre el mecanismo detrás de la modulación negativa, se realizó un análisis adicional utilizando dos células CaP líneas (DU-145 y LNCaP) utilizando el inhibidor de HDAC de VPA. Para validar nuestros datos de microarrays, se realizó un análisis Q-PCR en un subconjunto de los genes de reparación. Nuestros datos revelaron que todos los genes probados se downregulated en las dos líneas celulares, excepto que fue Hus1 downregulated sólo en células LNCaP (Fig. 1c). BRCA1, Rad51 y Chk1 son conocidos por ser regulados por el factor de transcripción E2F [30], [31]. Desde la AFA reveló el enriquecimiento de modulación negativa de los genes diana E2F1, E2F1 incluyéndose a sí mismo, se determinó el nivel de transcripción tanto del activador (E2F1) y represor E2F (E2F4 y 6) factores de transcripción. Nuestros resultados muestran que E2F1 se downregulated significativamente tanto en las líneas de células tratadas con VPA, mientras que los E2Fs represoras no se vieron afectados en ninguna de las líneas de células tras el tratamiento VPA (Fig. 1c).
downmodulation de ADN genes de reparación por la inhibición de HDAC conduce a un aumento de la sensibilidad de las células de CaP a agentes que dañan el ADN
informes previos de nuestro grupo y otros han demostrado que HDACIs como VPA pueden disminuir la proliferación de células de cáncer de próstata [11], [16]. HDACIs también han sido conocidos por actuar como radiosensibilizadores [18], [19], [20]. La hipótesis de que downmodulation de genes de reparación del ADN de la inhibición de HDAC llevaría a un aumento de la sensibilidad a diversos agentes que dañan el ADN. células DU-145 se sometieron a ensayos de supervivencia clonogénicas después del tratamiento con una combinación de HDACIs y diferentes agentes que inducen DSBs como la radiación, el cisplatino y la hidroxiurea. Un ensayo clonogénico radiosensibilidad se realizó con el aumento de dosis de VPA en presencia de una dosis creciente de radiación. Como era de esperar, VPA hizo radiosensibilizar DU-145 células, y se produjo un aumento en la sensibilidad con dosis crecientes (Fig. 2a). Recientemente, se ha demostrado que un defecto en la recombinación homóloga puede conducir a cambios en el perfil de sensibilidad al fármaco, haciendo que los cánceres de mama BRCA1 deficientes sensibles a mitomicina C, cisplatino, etopósido y otras drogas que producen lesiones de doble cadena [33]. Hemos sostenido que esto puede ser cierto para HDACi tratada células de CaP, donde hay una disminución en la expresión de genes relacionados con la vía de BRCA1. ensayos clonogénicos realizados después del tratamiento de las células DU-145 con VPA solo o en combinación con cisplatino y hidroxiurea, revelaron que, en comparación con un único agente, la combinación de VPA, ya sea con hidroxiurea o cisplatino disminuyó en gran medida la supervivencia clonogénico (Fig. 2b y c) .
a) ensayo clonogénico realizado en DU-145 después del tratamiento con diferentes dosis de VPA para 48 h antes de la irradiación con diferentes dosis de radiación. El panel superior muestra las placas representativas clonogénico con 0Gy y 4 Gy de radiación gráfico que aparece a continuación muestra la fracción superviviente después de los tratamientos de VPA y la irradiación. barra de error representa la desviación estándar de tres experimentos independientes. b) ensayo clonogénico a cabo en DU-145 células tratadas con VPA 1,5 mM y cisplatino (100 nM y 250 nM) durante 48 h. barra de error representa la desviación estándar. c) ensayo clonogénico a cabo en DU-145 células tratadas con VPA 1,5 mM e hidroxiurea (0,5 mM y 1 mM) durante 48 h. barra de error representa la desviación estándar.
inhibición de HDAC por VPA conduce a una disminución en las proteínas de reparación del ADN de la vía de respuesta HR y DNA Damage
de sensibilidad a diversos agentes que dañan el ADN de la inhibición de HDAC podría ser el resultado de la capacidad de reparación del ADN comprometida o inferior a la normal en las células tratadas. Esto puede ser provocada por la regulación a la baja de los genes de reparación del ADN de la inhibición de HDAC. Radiosensibilización de HDACIs se ha relacionado con una disminución en la expresión del gen Rad51 en el CaP [20]. Para la primera prueba si VPA produce una disminución en la capacidad de reparación del ADN de doble filamento romper de células de CaP se realizó un ensayo cometa neutral para evaluar la capacidad de reparación del ADN de las células de cáncer de próstata a la inhibición de HDAC [34], [35]. En las condiciones experimentales utilizadas, no se encontró ninguna diferencia estadística en el momento de la cola de VPA tratada y células control sin tratar sin radiación. Sin embargo, en ausencia de las células de tratamiento de VPA expuestos a 4 Gy de irradiación fueron capaces de reparar la mayor parte de su ADN dañado dentro de las 4 horas. Sin embargo después del tratamiento VPA ambas líneas celulares de próstata mostraron significativamente más altos momentos de cola 4 horas después de la exposición a 4 Gy de irradiación demostrando una menor capacidad de reparación del ADN (Fig. 3a). Para determinar si la reparación de DSB se ve comprometida en la inhibición de HDAC, se emplearon aclaramiento focos H2AX como un indicador de reparación de DSB eficiente. células DU-145 y LNCaP fueron tratadas con VPA y se irradiaron con 2 Gy, 4 Gy, y 6 Gys de radiación. Las células se fijaron después de 4 horas de reparación y se sondearon con Ser
139 anticuerpos H2AX fosforilada. Como era de esperar, el aumento de H2AX focos se encontró en células de CaP tratados con VPA, lo que indica una disminución en la capacidad de reparación del ADN (Fig. 3b). la reparación del ADN comprometido puede ser el resultado de una disminución de las cantidades totales de proteína de reparación y /o una disminución en la localización o el reclutamiento de proteínas de reparación al sitio dañado. Para probar estas posibilidades, lo primero que investigó los niveles de proteínas de reparación que se mostraron para ser downmodulated en nuestro conjunto de datos de microarrays después del tratamiento de VPA. Muchos de estos genes, como Rad51, BRCA1 y Chk1, son inducidos a daño en el DNA [24]. Para investigar si estas proteínas permanecen downregulated sobre la inhibición de HDAC incluso a daños en el ADN, se realizó el análisis en ausencia y en presencia de radiación. Un aumento de la acetilación total de H3 en células DU-145 y LNCaP demostraron que VPA no causa una inhibición de HDAC mundial eficaz a la dosis utilizada para los experimentos (Fig. 4a y datos no presentados). El aumento de la concentración de VPA causa una disminución en BRCA1 y Rad51 tanto en las células DU-145 y LNCaP, mientras que otras proteínas de reparación, tales como DNAPK y NBS1 no se ven afectados (Fig. 4b y c). los niveles de proteína BRCA1 no son constantes en la célula, y picos a diferentes puntos de tiempo dependiendo de la fase del ciclo celular. Con el fin de entender cuando BRCA1 está regulado por disminución en las células tratadas VPA, lisados se recogieron en cada punto de tiempo después del tratamiento. Se encontró BRCA1 para disminuir tan pronto como 18 h después del tratamiento (Fig. 4c), lo que indica una respuesta rápida a la inhibición de HDAC. La irradiación de células de CaP, tratamiento posterior con VPA, demostró ciertas proteínas de respuesta al daño del ADN y la reparación, tales como ATR y NBS1 no se vio afectado, mientras que DNAPK se indujo por tratamiento VPA en presencia de radiación (Fig. 5a). RAD51, se encontraron los genes BRCA1 y CHK1 seguir regulados a la baja, incluso tras la irradiación en las células tratadas VPA. BRCA1 es una proteína nuclear, que distribuye en el citoplasma bajo ciertas condiciones. Para determinar que el tratamiento con VPA en la regulación a la baja de BRCA1 en el compartimento nuclear, las células DU-145 fueron tratados con VPA y se irradiaron 48 h después del tratamiento con 4 Gy de radiación. Los extractos nucleares preparados a partir de estas células se immunoprobed para BRCA1. Como se muestra en la Fig. 5b, las células tratadas VPA tienen una regulación a la baja de la proteína BRCA1, incluso después de la irradiación.
a) Neutral ensayo cometa realizado en células de cáncer de próstata tratados con VPA 1,5 mM durante 48 h y se irradió con 6 Gy de radiación γ- seguido por una 4 h intervalo de reparación. las células no irradiadas (0Gy) con y sin tratamiento con VPA no mostraron ninguna diferencia significativa en los momentos en cola de cometa. El gráfico representa momento media de la cola de 50 células barra de error indica el valor de SD de tres experimentos. Las comparaciones se han realizado utilizando la prueba t de estudiante. b) La inmunofluorescencia muestra H2AX Ser
139 tinción en las células DU-145 tratadas con VPA 1,5 mM durante 48 h y se irradió con radiación 4Gy seguido de 4 h de tiempo de reparación. El gráfico muestra la cuantificación de focos H2AX en el control (columna azul) y tratados (columna roja) células DU-145 y LNCaP. barra de error representa la desviación estándar de tres experimentos independientes.
a) Transferencia Western que muestra la acetilación de la proteína histona H3 en células DU-145 después del tratamiento con diferentes dosis de VPA durante 48 h. b) DNAPK y los niveles de proteína NBS1 en VPA trataron células DU-145 durante 48 h. c) Western blot que muestra RAD51 y los niveles de proteína BRCA1 en LNCaP y las células DU-145 tratadas con diferentes dosis de VPA durante 48 h. Blot de la derecha muestra las células DU-145 tratadas con VPA 1,5 mM durante diversos puntos de tiempo sondeadas para la proteína BRCA1.
a) líneas de células tratadas con VPA PCA 1,5 mM durante 48 h, se irradia con diferentes dosis de radiación, sondeado para diversas proteínas de reparación por el Western Blot. también se incluyeron no irradiado (células 0Gy). b) Total y extracto nuclear de VPA (1,5 mM durante 48 h) trataron células DU-145 con y sin irradiación sondeado para la proteína BRCA1. también se incluyeron no irradiado (células 0Gy). c) El panel superior muestra el nivel de proteína TOPO IIα en extracto nuclear de células DU-145 por tratamiento de VPA. El panel inferior es un gel de agarosa que muestra la actividad TOPO IIα en los mismos extractos, carril 4 es un control negativo.
Nuestros resultados indicaron una marcada reducción en los niveles de transcripción TOPO IIα tras el tratamiento con VPA. TOPO IIα resuelve ADN catenated mediante la inducción de un OSD transitoria y posterior religación [36]. TOPO IIα ha sido implicado en una variedad de procesos celulares, incluyendo la replicación del ADN, la transcripción y la segregación cromosómica [37]. Esperábamos regulación a la baja de la proteína TOPO IIα después de la inhibición de la HDAC. Para nuestra sorpresa, hemos encontrado proteína TOPO IIα está regulada positivamente en el tratamiento VPA en ambas líneas celulares de próstata (Fig. 5c y datos no presentados). Para investigar si esto conduce a un aumento en la actividad de la proteína TOPO IIα, se utilizó extracto nuclear de VPA tratada células DU-145 para medir la actividad de decatenation TOPO IIα. Como se ve en la Fig. 5c, VPA células decatenated cinetoplasto ADN más eficientemente que las células de control no tratadas tratada. Esto sugiere que aunque TOPO IIα está regulado por disminución en el nivel de transcripción de la inhibición de HDAC, existe una regulación post translacional lo que la proteína se estabiliza a la inhibición de la HDAC.
El reclutamiento de proteínas clave de reparación del ADN de recursos humanos se ve afectado en la inhibición de HDAC líder a una disminución en la reparación del ADN HR
reclutamiento espacial y temporal de las proteínas mediador y de reparación del ADN a la irradiación inducida focos es necesario para la reparación del ADN eficiente que se produzca [24]. Hemos investigado si una disminución de la respuesta y de reparación de las proteínas de daño en el DNA de la inhibición de HDAC también condujo a una disminución en el reclutamiento de las proteínas de reparación del ADN al sitio dañado. VPA tratada DU-145 y las células LNCaP fueron irradiados con 4 Gy de radiación y posteriormente fijado después de cuatro horas de reparación.
inmunofluorescencia se llevó a cabo para BRCA1 y RAD51 junto con las proteínas H2AX fosforilada. Había una marcada reducción en la tinción para BRCA1 y focos RAD51 tras el tratamiento VPA; las células de control, por otra parte mostraron discretos BRCA1 y RAD51 focos que colocalized con H2AX fosforilada (Fig. 6a y b). La tinción y la localización de NBS1, sin embargo, se mantuvo sin cambios después del tratamiento VPA (Fig. 6a). Se cuantificó el número de focos RAD51 BRCA1 y contándolas en células que tienen más de veinte focos H2AX. Como se muestra en la figura 6c, se encontró que había una reducción significativa en el número de focos de reparación para ambas de las proteínas de reparación por tratamiento VPA. Tanto las células LNCaP y DU-145 mostraron tinción citoplásmica puntiforme para ambos RAD51 y BRCA1. Estos resultados indican que además de regulación a la baja, hay una problemas de reclutamiento de las proteínas de reparación en el sitio dañado en la inhibición de HDAC.
a) El análisis de inmunofluorescencia de las células DU-145 tratadas con VPA 1,5 mM durante 48 h y se irradió con 4Gy de la radiación probaron para BRCA1 (rojo) y NBS1 (verde). Los núcleos se contratiñeron con DAPI. BRCA1 citoplasmática (flecha) se observa en células tratadas con VPA sugieren problemas de reclutamiento de BRCA1 en las células tratadas VPA. b) El análisis de inmunofluorescencia de células LNCaP tratadas con VPA 1,5 mM durante 48 h y se irradió con 4Gy de la radiación probaron para H2AX Ser
139 (rojo) y RAD51 (verde). Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Las células que tienen & gt; 25 H2AX Ser
139foci se analizaron. Citoplasmática RAD51 (flecha) se observa en células tratadas con VPA sugieren problemas de reclutamiento de BRCA1 en las células tratadas VPA. c) Cuantificación del número de BRCA1 y RAD51 focos colocalizing con H2AX Ser
139 focos en células DU-145 y LNCaP después del tratamiento con VPA 1,5 mM y la irradiación con 4Gy de radiación. Un total de 100 células que tienen & gt; 25 H2AX Ser
139foci se contaron. Las barras de error indican la desviación estándar de la media. d) análisis FACS que representa un ensayo de reparación de HR usando un constructo reportero plásmido en células LNCaP después del tratamiento con diferentes concentraciones de VPA.
Si esto conduce a una disminución en la reparación de HR fue la siguiente pregunta se investigó. Para ello, se empleó un enfoque basado en el plásmido de anotar para la eficiencia de recursos humanos en las células LNCaP. Hemos generado una recombinación constructo indicador EGFP por clonación de un EGFP sin promotor aguas arriba del vector pEGFPN1. Un sitio Bcl I fue diseñado en este gen para inducir DSBs. El gen EGFP por delante del promotor CMV fue mutado, con la consecuencia de que la funcionalidad de EGFP sólo se restaura cuando hay reparación HR eficiente. Como se muestra en la figura 6d, hubo una reducción significativa en el número de HR células LNCaP competentes por tratamiento VPA. Estos resultados indican claramente una implicación de la vía de recursos humanos en células de CaP a la inhibición de la HDAC.
E2F1 está implicado en la regulación a la baja de las proteínas de reparación clave sobre la inhibición de HDAC
Desde nuestros datos demuestran regulación a la baja de la transcripción de los genes de reparación la inhibición de HDAC, se investigó el estado de acetilación de histonas H3 de los promotores de un subconjunto de genes regulados negativamente utilizando ensayos de chip. Curiosamente, nuestros resultados revelaron una disminución de H3 estado de acetilación de las regiones proximales del promotor de todos los genes investigados (Fig. 7a). Una disminución en la acetilación de regiones promotoras también se acompaña de un aumento de la unión de las proteínas represor transcripcional de los promotores [7]. Para investigar los factores de transcripción que pueden provocar la represión de la transcripción de los genes de reparación del ADN sobre la inhibición de HDAC, nos centramos nuestra atención en los factores de transcripción E2F. BRCA1 y Rad51 tienen dos sitios de unión a E2F en la región promotora proximal [31]. Tanto los genes BRCA1 y Rad51 son reprimidos en condiciones de hipoxia por el reclutamiento de E2F4 represores /p130 de transcripción. Bajo condiciones de hipoxia, E2F1 y E2F4 se unen simultáneamente el promotor Brca1 en dos sitios E2F adyacentes para llevar a cabo la represión transcripcional de la expresión génica BRCA1 [30], [31]. Del mismo modo, Chk1 y BubR1 tienen sitios de unión de transcripción de factores de transcripción E2F y son inducidos por E2F1 [32], [38].
a) Chip análisis de VPA (1,5 mM durante 48 h) tratados células DU-145 para el estado de la histona H3 acetilada en los promotores de los genes de reparación. El diagrama de barras que es una lectura densitometría del gel de agarosa se muestra normalizado a los insumos. b) las células activador y represor E2F niveles de proteína en VPA (1,5 mM durante 48 h) tratados niveles LNCaP y DU-145 cells.E2F quedaron regulados a la baja tras el tratamiento VPA incluso después de la irradiación con radiación 4Gy como se muestra en las células DU-145, no irradiado (0Gy células) sirvió como control de radiación. c) ensayos de reportero de luciferasa en células DU-145 y LNCaP, tratados con diferentes concentraciones de VPA, utilizando regiones promotoras proximales, que abarca E2F regiones de los genes de reparación downregulated unión. d) Chip análisis para la ocupación E2F en las regiones promotoras de los genes regulados negativamente. ChIP se realizó utilizando anticuerpos contra E2Fs (1, 4, y 6) en VPA (1,5 mM durante 48 h) tratado y de control de las células DU-145. El diagrama de barras que representa las lecturas densitométricas normalizaron a las entradas respectivas.
Desde E2F1 transcripción fue downregulated de HDACIs, la hipótesis de que la inhibición de HDAC puede aumentar la unión de E2Fs represivas a los promotores de genes de reparación de regulación a la baja, y por lo tanto dar lugar a represión activa de genes de reparación del ADN. Nosotros investigamos primero los niveles de proteína de tanto el activador y E2Fs represivas después del tratamiento con VPA tanto en células LNCaP y DU-145. De acuerdo con los niveles de transcripción, el nivel de proteína E2F1 se downregulated por tratamiento VPA, mientras que los E2Fs represivos (E2F4 y 6) no cambiaron. E2F1 permaneció downregulated incluso después de la inducción del daño del ADN por irradiación (Fig. 7b). Así, hay una respuesta diferencial de los activadores y represores E2Fs a la inhibición de HDAC. Hay informes que sugieren un aumento de la actividad transcripcional E2F1 durante la apoptosis neuronal en la inhibición de HDAC [39]. Esto podría ser tejido-dependiente, como vorinostat mediada resultados de inhibición de HDAC en la regulación por disminución de genes relacionados con E2F en el mieloma múltiple [40]. Además, la unión de E2F1 al promotor ARHI ha demostrado ser reducida por el inhibidor de HDAC tricostatina A [41]. Aunque hemos encontrado niveles de proteína E2F1 downregulated sobre la inhibición de HDAC, había una posibilidad de que la actividad de la piscina restante de E2F1 se aumentó después de la inhibición de HDAC. Para investigar esto, hemos clonado regiones proximales de BRCA1, Rad51 y Chk1, que abarca los sitios de unión E2F, en el básico vector indicador de luciferasa pGL3. VPA tratada DU-145 y las células LNCaP fueron transfectadas con el reportero promotor construye junto con el vector de control de luciferasa de Renilla. Los lisados se sometieron a un ensayo de luciferasa dual. Nuestros datos revelaron una regulación a la baja significativa de todos los promotores de genes por tratamiento de VPA, con el promotor de BRCA1 siendo los más afectados, en comparación con las células control (Fig. 7c). Si esto implica disminución de la unión de E2F1 o aumento de la unión de E2F4 o E2F6 represiva de los promotores de genes regulados negativamente fue la pregunta siguiente nos dirigimos. Los cebadores para ensayos de chip se diseñaron para flanquear los sitios E2F en proximal promotores de los genes BRCA1, Rad51, Chk1 y BubR1. Cromatina de VPA tratada y células control sin tratar se inmunoprecipitó utilizando anticuerpos contra E2F1, E2F4 y E2F6. amplificación por PCR de ADN de la cromatina precipitada reveló promotor de ocupación de estos factores de transcripción. Corroborando un informe anterior, encontramos la ocupación simultánea de E2F1 y E2F4 para BRCA1 y Rad51 promotores de genes y encontramos un patrón similar para el promotor BubR1. Bajo condiciones experimentales, no se encontró ninguna E2F6 unirse a cualquiera de los promotores investigados. Si bien E2F1 ligada fuertemente a regiones promotoras en los controles no tratados, había una reducción significativa del reclutamiento de E2F1 a la inhibición de HDAC (Fig. 7d). Contrariamente a nuestra hipótesis, encontramos que la regulación a la baja de los genes de reparación no es como consecuencia de la represión activa de E2Fs represivas, pero una disminución general en la contratación del activador de E2F1 a los promotores.
Discusión
Durante la evolución de CaP, ciertas vías de reparación del ADN son inactivados, como resultado de lo cual, PCa adquiere la inestabilidad genómica. Esto representa un mayor nivel de daño del ADN endógeno en células de CaP que las células normales [42], [43]. Para la supervivencia celular continuo, otras vías de respuesta al daño del ADN y de reparación se inducen y mantienen.