Extracto
Antecedentes
Las modificaciones de las colas amino-terminales de las histonas afectar el acceso de factores de regulación y los complejos de la cromatina y por lo tanto influyen en los procesos biológicos. Las células cancerosas se caracterizan por el destacado desregulación epigenética, incluyendo modificaciones de las histonas. Sin embargo, el papel funcional de las histonas methyltransferases (HMT) en el cáncer siguen sin estar claros.
Metodología /Principales conclusiones
Se estudió la inhibición basado en RNAi (knockdown, KD) de 2 HMTs H3K9 diferentes, SUV39H1 y G9a. Desmontables de los 2 HMTs en línea celular de cáncer PC3 notablemente inhibió el crecimiento celular y causó profundos cambios morfológicos con la pérdida de la actividad de la telomerasa y los telómeros acortados. SUV39H1 células KD mostraron aumento sustancial de la fracción G2 /M. G9a células KD mostraron un aumento de contenido de ADN (1,7 veces en 2 clones independientes) en comparación con los análisis FACS de controlar. Los análisis de cariotipo mostró que esto era debido a un aumento del número de cromosomas (61 a 102) en las células G9a KD en comparación con PC3 parental. Curiosamente, encontramos morfología centrosoma anormal y el número en aproximadamente 25% de las células G9a KD, mientras que los centrosomas eran morfológicamente normales en las células control. Análisis de microarrays después de KD de SUV39H1 o G9a mostró muy pocos genes hasta reguladas entre los 39.000 genes. Los genes supresores de tumores silenciados
p16 Opiniones y
RASSF1A
no se activa en las células KD.
Conclusiones /Importancia
Estos datos sugieren que los 2 HMTs , SUV39H1 y G9a se requieren para perpetuar el fenotipo maligno. Además, G9a juega un papel crítico en la regulación de la duplicación del centrosoma presumiblemente a través de la estructura de cromatina en lugar de a través de que afecta a la expresión génica en las células cancerosas. La orientación de estas histonas methyltransferases puede ser de beneficio terapéutico en el cáncer
Visto:. Kondo Y, Shen L, Ahmed S, Boumber Y, Sekido Y, Haddad BR, et al. (2008) La regulación por disminución de la histona H3 lisina 9 metiltransferasa G9a induce la interrupción del centrosoma y la inestabilidad cromosómica en células de cáncer. PLoS ONE 3 (4): e2037. doi: 10.1371 /journal.pone.0002037
Editor: Axel Imhof, Universidad de Munich y el Centro de Ciencias de la proteína integrada, Alemania |
Recibido: 26 Diciembre, 2007; Aceptado: March 10, 2008; Publicado: 30 de abril 2008
Derechos de Autor © 2008 Kondo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo el apoyo de subvenciones CA098006 y CA100632 del NIH (JPJI) y una beca de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (YK)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cromatina es un proceso crítico en relación con la replicación del ADN, la expresión génica y la progresión a través del ciclo celular. Las modificaciones específicas se asocian con ciertos procesos de la plantilla de ADN mediada por [1]. La metilación de la lisina de la histona H3 9 (H3K9) es una de las modificaciones de las histonas más bien estudiados. Después de la identificación inicial de Suv39H1 además de la SUV39H2 altamente relacionados como histona metiltransferasa-H3K9 específicos (HMT) [2], por lo menos otros tres HMTs, G9A, ESET /Setdb1 y EuHMTase1, han sido reconocidos como HMTs para H3K9 en mamíferos [3] - [5]. Estas enzimas tienen diferentes afinidades por los estados un-, mono- o dimetilados y producen diferentes estados de metilación. Los estudios en ratones knockout para Suv39h1, 2 y G9a revelaron que G9a es el principal responsable de monometilación (1ME) y dimethylation (2Me) de H3K9, mientras que Suv39h1 y Suv39h2 trimethylation directa (3Me) de H3K9. Por otra parte, 1ME y 2Me en H3K9 residen principalmente en la eucromatina, mientras 2Me y 3Me en H3K9 se encuentran dentro de los diferentes tipos de heterocromatina, heterocromatina facultativa y constitutiva, respectivamente. Estos resultados sugieren que 1ME, 2Me o 3Me en K9H3 ocupan cromosoma dominios distintos y cada uno de los tres estados de metilación H3K9 desempeña un papel único en la organización estructural y funcional de los cromosomas.
Reglamento del cromosoma de orden superior estructura afecta a la fidelidad mitótico y garantiza la segregación cromosómica balanceada. conjunto de la heterocromatina en centromeres facilita tanto la formación del cinetocoro y cromátida hermana de cohesión [6]. Además, la formación de estructuras de la cromatina en los telómeros también sirve para mantener la longitud de repeticiones teloméricas [7]. Los estudios en la levadura de fisión mostraron que se requiere la interacción entre 3MeH3K9 y Swi6 /HP1 para la segregación de cromosomas en la mitosis [8]. En los mamíferos, los cromosomas mitóticos muestran enriquecido 2MeH3K9 en regiones centroméricas y se pronuncian en 3MeH3K9 pericentric heterocromatina. Knockout de Suv39h1 y Suv39h2 en los resultados de ratón en la inestabilidad genómica generalizada y aumento de la incidencia de linfomas, lo que sugiere que es una modificación 3MeH3K9 crítico mantener entornos cromosómicas [2]. 2MeH3K9 también se ha implicado en el gen asociado DNA-metilación silenciar [9] - [11], pero el control de la enzima de este evento no se ha definido
Las células cancerosas se caracterizan por el prominente desregulación epigenética, incluyendo la cromatina alterada. modificación. Anteriormente hemos encontrado mayor nivel de G9a en los cánceres humanos [12], aunque el papel funcional de la sobreexpresión HMTs en el cáncer sigue siendo poco clara. Aquí, mostramos que desmontables (KD) de G9a y SUV39H1 en las células cancerosas el crecimiento celular notablemente inhibida y dirigidos a las células senescentes morfológicamente con anormalidades de los telómeros. Se encontró que G9a KD pero no SUV39H1 KD induce extensa inestabilidad cromosómica y la alteración del centrosoma. Estos datos sugieren que G9a, así como SUV39H1 están obligados a mantener el fenotipo maligno y podrían ser dianas terapéuticas válidas en la neoplasia humana.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares, condiciones de cultivo y tratamiento de drogas
la línea celular de cáncer de próstata PC3, la línea celular de cáncer de pulmón H1299 y la línea celular de cáncer de mama MCF7 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Ellos fueron cultivadas en medio RPMI (Invitrogen, Carlsbad CA), además de 10% de SFB en placas de cultivo de tejido de plástico en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C. Las células se dividieron 12-24 h antes de 5-Aza-2 'desoxicitidina tratamiento (DAC, Sigma, St. Louis, MO). Las células fueron tratadas con 1 mM de DAC, o PBS (control) al día durante 3 días.
ARN de interferencia
Se diseñó un vector de retrovirus (Psiren-RetroQ RNAi-Ready Vector, BD Biosciences) que codifica una pequeña horquilla de ARN (shRNA) dirigidos contra G9a y SUV39H1 en PC3 (secuencias diana de 5'-AAGATTGAGCCTCCGCTGATT-3 'y 5'-AATCTCAAGTGTGTGCGTATC-3' para G9a y SUV39H1, respectivamente). Como control, se utilizó shRNAs para la luciferasa (Luc) sintetizada por BD Biosciences o vector de ARNhc sin horquilla oligonucleótidos.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
ensayos de chip se lleva a cabo basándose en una modificación del previamente métodos publicados [13]. Brevemente, las células se tratan con 1% de formaldehído durante 8 min para reticular las histonas al ADN. Los sedimentos celulares se resuspenden en tampón de lisis y se sonicaron 8 sec siete veces. Se incuba el lisado con 10 l de anti-K4 dimetilado de histona H3, anti-K9 acetilado H3 histona, anti-K9 dimetilado de histona H3 (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA) y el anticuerpo H3 anti-histona (como un control interno, Abcam, Cambridge, Reino Unido) a 4 ° C durante la noche. Dos% del total de lisado se utiliza para el control de entrada. ADN se extrae por el método de fenol /cloroformo, se precipitó-etanol, y se resuspendió en agua. productos de chips se usaron para la PCR cuantitativa con los cebadores de oligonucleótidos descritos en la Tabla S1. Para la cuantificación, TaqMan Q-PCR se realizaron en un instrumento ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA) por duplicado para los genes diana.
Immunoblotting
Immunoblotting se realizó con anticuerpos primarios para anti-G9a (Abcam), anti-SUV39H1, anti-K9 dimetilado de histona H3, anti-K9 trimetilada histona H3 (Upstate Biotechnology), histona H3 (Abcam) y ß-actina (Sigma).
RT Los análisis -PCR
El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen), y 2 mg se transcribe de forma inversa con transcriptasa inversa MLV (Invitrogen). Las secuencias de los cebadores utilizados se describen en la Tabla S1. El protocolo de PCR para la RT-PCR fue de 95 ° C durante 4 min, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 ° C, 30 seg a 55 ° C y 30 seg a 72 ° C, y después una extensión final de 5 min a 72 DO. TaqMan Q-PCR se llevaron a cabo por duplicado para los genes diana G9a, SUV39H1 y GAPDH utilizando sonda fija Hs00198710_m1, Hs00162471_m1 y Hs 00266705_gl, respectivamente (Applied Biosystems).
bisulfito de pirosecuenciación análisis de metilación
Se realizó tratamiento con bisulfito como se informó anteriormente [14]. Brevemente, 2 g de ADN genómico se desnaturalizaron con NaOH 2 M durante 10 min, seguido de incubación con bisulfito de sodio 3 M (pH 5,0) durante 16 horas a 50 ° C. Después del tratamiento, el ADN se purificó usando una columna de Asistente Miniprep (Promega, Madison, WI), se precipitó con etanol, y se resuspendió en 30 l de agua diluida. Se utilizó un método altamente cuantitativo para evaluar los niveles de metilación del ADN basado en la tecnología de pirosecuenciación [15] (pirosecuenciación AB, Uppsala, Suecia). Primer secuencias se describen en la Tabla S1.
SA-ß-gal Análisis
células PC3 infectadas con el retrovirus que codifican G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA o control-shRNA fueron examinados para SA-ß actividad gal como se describe anteriormente [16].
ARN Microarray Análisis
El ARN total fue extraído de células infectadas o bien con G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA o control-shRNA como se ha descrito anteriormente. Los objetivos para la hibridación de microarrays se generaron a partir del ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). Se utilizó el gen chip U133A humano (Affymetrix), que contiene transcripciones ~33,000 de perfiles de expresión génica. La hibridación, el lavado, la exploración, y el análisis de chips de genes se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de expresión se analizaron mediante el algoritmo de estadística en el software Microarray Analysis Suite (MAS) 5.0 (Affymetrix), utilizando los parámetros por defecto. Los datos de la tratamiento de control-shRNA y PC3 parental se utilizaron como una expresión de línea de base para la comparación con ya sea G9a-shRNA o SUV39H1-shRNA muestra tratada.
Medición de la telomerasa Actividad Actividad de la telomerasa
era analizada por un método modificado del protocolo de amplificación de la telomerasa de repetición estándar (TRAP), el Kit de detección de telomerasa TRAPeze (Millipore, Billerica, MA) según las instrucciones del fabricante. Los productos de reacción se corrieron en un gel de poliacrilamida nativo al 15% y se tiñeron con bromuro de etidio.
inmunofluorescencia citogenéticos
G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA o control-shRNA células PC3 tratadas fueron cultivadas en la cultura Falcon diapositivas (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Anti-CENP-A anticuerpo monoclonal (Abcam), anti-K9 dimetilado histona H3 y anti-K9 trimetilada anticuerpos policlonales histonas H3 (Upstate Biotechnology) se utilizaron como anticuerpos primarios. Centrosomas se detectaron con un anticuerpo policlonal de γ-tubulina (Sigma) usando un protocolo estándar [17]. El anticuerpo primario se detectó con Alexa Fluor 488 conjugado anticuerpo de cabra anti-ratón (Invitrogen), Alexa Fluor 546 conjugado anticuerpo de cabra anti-conejo (Invitrogen) o anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con fluoresceína (Sigma) y las células se contratiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), y embebidos en solución anti-fade (DABCO 200 mM, 90% de glicerol vol /vol, 20 mM TRIS-HCl, pH 8) para reducir la foto-blanqueo. Puntuación de las células y adquisición de imágenes digitales se realizaron utilizando un 63 × objetivo montado en un microscopio Leica DMRBE (Leica, Wetzlar, Alemania) equipado con filtros de luz para DAPI y FITC (Chroma Technologies, Brattleboro, VT) y un dispositivo de carga enfriado acoplado ( CCD) (Fotometría, Tucson, AZ). El paquete de software IPLab (Scanalytics Inc, Fairfax, VA) se utilizó para la adquisición y procesamiento de imágenes. Para cada una de las preparaciones celulares (3 control, G9a-shRNA o SUV39H1-shRNA células tratadas), 100 núcleos fueron anotados por dos observadores independientes.
Análisis de la longitud del telómero
G9a-shRNA, SUV39H1 -shRNA o células PC3 tratadas con el control shRNA fueron evaluados para la reducción de los telómeros usando el método Telo-FISH para visualizar los telómeros en las poblaciones de células en interfase, como se describe anteriormente [18]. En pocas palabras, el análisis FISH se realizó utilizando una sonda telomérica disponible comercialmente de ácido nucleico peptídico conjugado con Cy3 (PNA) según las instrucciones del fabricante (DAKO Corporation, Carpinteria, CA). El análisis independiente fue realizado por dos observadores ciegos utilizando un microscopio Leica DMRBE equipado con un Cy3 y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) filtros. Más de 100 núcleos en interfase se evaluaron visualmente, y las imágenes digitales se obtuvieron usando un CCD enfriado (dispositivo de carga acoplada).
Resultados
Para evaluar el papel de SUV39H1 y G9a en los cánceres, primera establecimos clones de PC3, en el que cualquiera de estos 2 HMTs fueron regulados a la baja de forma estable por shRNA. Utilizamos PC3, ya endógeno SUV39H1 y G9a fueron altamente expresado en esta célula. En estos clones desmontables (KD), la expresión de los 2 HMTs se redujo en un 80 a 90% (Figs. 1A y 1B). KD células para G9a (G9a-KD) mostraron una reducción de general 2MeH3K9 y 3MeH3K9. KD células para SUV39H1 (SUV-KD) redujeron 3MeH3K9 en general, pero hay un cambio notable en 2MeH3K9 (fig. 1B). 2MeH3K9 se detectó ampliamente en los núcleos de las células de control, incluyendo la UE y la región de heterocromatina (Fig. 1C). Sin embargo, el núcleo de la célula G9a-KD mostró afectada selectivamente amplia tinción euchromatic de 2MeH3K9 y sólo contenía motas borrosas, que se superponen con la región pericéntrica (densamente teñidos con DAPI) y la región centromérica (manchado de CENP-A). 3MeH3K9 se detectó en la región pericentric y región centromérica en las células control. células SUV-KD tuvieron disminuido 3MeH3K9, pero no completamente, en los focos de heterocromatina y no alteraron significativamente los estados 2MeH3K9 (Fig. 1C). G9a-KD no afectó significativamente los patrones 3MeH3K9 de la región pericéntrica y la región centromérica. Estos resultados fueron consistentes con los estudios deficientes G9a- anteriores de células ES [19], [20]. Curiosamente, parece que G9a-KD afectada estado H3K9me3 en la región de eucromatina.
-PCR en tiempo real (A) y Western Blot (B) muestran que la interferencia shRNA regula a la baja eficacia G9a o SUV39H1 expresión. Las barras de error en tiempo real, PCR indican la desviación estándar de la expresión en más de 3 clones aislados independientemente. En cuanto a las modificaciones de H3, el G9a-KD (2 clones independientes) células muestran una reducción de general 2MeH3K9. Por el contrario, SUV-KD reduce 3MeH3K9 en general, pero hay un cambio notable en 2MeH3K9. estados de metilación C, H3-K9 se analizaron mediante inmunofluorescencia con 2MeH3K9 (rojo, izquierda) o 3MeH3K9 (rojo, derecha) anticuerpos específicos en las células de control (Ctrl), células G9a-KD células o SUV-KD. 2MeH3K9 se detectó ampliamente en los núcleos de control. El núcleo G9a-KD reveló manchas débiles de 2MeH3K9 superpuestas con DAPI-densa (azul) del lugar y de la CENP-A tinción (verde). los cuales representan la región pericentric y región centromérica, respectivamente. SUV-KD reduce 3MeH3K9 en los focos de heterocromatina y no alteró significativamente la tinción de los estados eucromática 2MeH3K9. tamaño de la célula es respecto a la barra 10-m. D, G9a-KD y SUV-KD resultado en la inhibición del crecimiento fuerte. Las células se sembraron a la misma densidad y se contaron diariamente por exclusión con azul de Trypan. Los símbolos en negro, triángulos rellenos y cuadrados rellenos indican el crecimiento del control, las células del G9a-KD KD-SUV y, respectivamente. Las barras de error en el gráfico indican la desviación estándar a partir de experimentos por triplicado. E, regulación a la baja de dos histonas methyltransferases como resultado un cambio morfológico notable, que se tiñeron positivamente para SA-beta-gal, lo que indica la inducción de la senescencia. tamaño de la celda es relativa a la barra de 50 micras.
Tanto SUV-KD y KD-G9a mostraron crecimiento celular marcadamente inhibida y profundos cambios morfológicos, ampliada y aplanada formas. (Figs. 1D y 1E). La senescencia asociado análisis ß-galactosidasa (análisis de SA-ß-gal) demostraron que este cambio morfológico fue consistente con la inducción de la senescencia celular.
La inducción de la senescencia celular en respuesta a estímulos depende principalmente de la p53 o p16-PRB vías [21]. Desde p16 es silenciado por la metilación del ADN en PC3 y su estado de p53 es nulo, el próximo examinado la reactivación de p16 en las células G9a-KD y SUV-KD. Por contraste con el tratamiento con el inhibidor de la ADN metiltransferasa 5-aza-2 'desoxicitidina (DAC), encontramos la activación p16 ni en la G9a-KD ni las células SUV-KD, consistente con ningún efecto sobre el estado epigenético de la región promotora ( Figura 2). También examinamos otro gen supresor de tumor,
RASSF1A
, que es un objetivo de la metilación del ADN en PC3, y se encontró que no había ningún efecto sobre la reactivación de genes, ya sea en la que las células SUV-KD G9a-KD o. Teniendo en cuenta que la metilación del ADN, un mecanismo epigenético crucial para silenciar genes supresores de tumores en la neoplasia humana, ha sido mecánicamente vinculados a la histona 2MeH3K9 metilación [9] - [11]., Estos datos se podría explicar por la compensación por otras HMTs
A, la expresión de ARN de cada gen se examinó por RT-PCR. En contraste con el tratamiento 5-Aza-2 'desoxicitidina (DAC), ni G9a-KD ni SUV-KD reactiva p16 y RASSF1A expresión. p21 y GAPDH se utilizan para los controles de genes activos. B, los cambios de metilación del ADN en el p16 y los promotores RASSF1A se analizaron por el método cuantitativo pirosecuenciación. De acuerdo con el estado de la expresión de ambos genes, la metilación del ADN se disminuye mediante tratamiento DAC, mientras que no se observan cambios en cualquiera de las células SUV-KD G9a-KD o. Las barras de error en el gráfico indican la desviación estándar a partir de experimentos por triplicado. C, las modificaciones de las histonas estudiados por chip se indican a continuación las columnas. K4Me, K9Ac, K9Me y Ab (-) indica dimethylation K4, acetilación K9, dimethylation K9 y sin control de anticuerpo, respectivamente. El eje y representa la proporción de cada IP a una inmunoprecipitación núcleo de histona H3. barras de color negro, barras blancas y barras grises indican el chip de control de la maqueta, la G9a-KD y las células SUV-KD, respectivamente. p21 se utilizó como un control de gen activo, en el que marcas de histona activos, K4Me y K9Ac, son altos. Las barras de error en el gráfico indican la desviación estándar de tres experimentos.
Para examinar los genes diana de silenciamiento depende H3K9 metilación o por cualquiera G9a SUV39H1, se analizaron los genes regulados hasta después de la inhibición de G9a o usando SUV39H1 microarrays de ADN. En el análisis de la matriz de datos, en primer lugar se seleccionaron los genes con intensidades de señal de 50 o menos en cualquiera de sus padres o PC3 control tratado con shRNA (es decir, los genes silenciados). A continuación, se realizaron búsquedas de los genes con intensidades de señal aumentaron más de 2 veces después de KD de cualquiera G9a o SUV39H1. Después de la retirada de las sondas auto-incompatibles entre el mismo gen, podríamos identificar sólo 4 y 6 genes (3 genes son comunes) en las células del SUV-KD-KD y G9a, respectivamente. Examinamos los 7 genes por RT-PCR y se encontró que sólo 2 genes,
Klotho
y
diferenciación del crecimiento factor 8 gratis (
GDF8
), fueron verdaderamente silenciados en el control células y hasta regulado tanto en células SUV-KD-KD y G9a (datos no mostrados). Por lo tanto, muy pocos genes están regulados hasta después de la inhibición de los 2 HMTs en PC3. Aunque, G9a y SUV39H1 participan generalmente en el silenciamiento de genes, encontramos que 12 y 2 genes (2 genes eran comunes) se redujeron regulado en el que las células SUV-KD, respectivamente (Tabla S2) G9a-KD y. Down-regulación de los pocos genes podría ser debido a los efectos secundarios de G9a-KD y la SUV-KD.
A pesar de efectos mínimos sobre la expresión génica, se observó crecimiento celular marcadamente inhibida tanto en el G9a-KD y las células SUV-KD. Examinamos estas células por FACS análisis para determinar el mecanismo involucrado. Se encontró que las células G9a-KD mostraron un aumento de contenido de ADN (1,7 veces en 2 clones independientes) y las células SUV-KD evidenció un aumento sustancial en el G2 fracción /M (del 29% al 40%) en comparación con el control (Fig. 3A). De acuerdo con estos datos, los análisis de cariotipo (Fig. 3B) revelaron un aumento del número de cromosomas en las células G9a-KD en comparación con las células SUV-KD y la línea celular PC3 parental (Fig. 3B). Números del cromosoma se contaron en más de 8 núcleo de cada célula KD (Fig. 3B). células G9a-KD observó una elevación significativa el número de cromosomas (media, 119 cromosomas,
P Hotel & lt; 0,01) que las células SUV-KD (63 cromosomas) y las células de control (65 cromosomas). Esto era cierto independientemente de los tipos de líneas celulares utilizadas. Ambos clones estables G9a-KD de la línea celular de cáncer de mama MCF7 y la línea celular de cáncer de pulmón H1299 también mostraron un aumento del número de cromosomas en comparación con las células control (MCF7-control frente a MCF7-G9a-KD, 60 cromosomas frente al 98 cromosomas; H1299- el control vs H1299-G9a-KD, 72 cromosomas vs 104 cromosomas;. Figura S1)
a, análisis FACS que muestra el contenido de ADN se aumenta 1,5-2 veces en las células G9a-KD comparación con el control simulado en dos clones aislados de forma independiente-(G9a-C1 y C2). Las células SUV-KD muestran una alta cantidad de células G2M comparación con el control simulado. B, los análisis mostraron cariotipo 61, 102 y 61 cromosomas en el PC3, el control de la las líneas celulares de SUV-KD-KD y G9a, respectivamente. el número de cromosomas se incrementa notablemente en las células G9a-KD. Números del cromosoma se contaron en más de 8 núcleo de cada célula KD. células G9a-KD observó una elevación significativa el número de cromosomas de las células SUV-KD y control de las células. eje Y indica el número de cromosomas. Las barras de error indican la desviación estándar. *,
P Hotel & lt; 0,01. C, Los núcleos se tiñeron con DAPI. Centrosomas se detectaron utilizando un anticuerpo contra γ-tubulina. En las células control y células SUV-KD, 1-2 centrosomas que aparecen como estructuras semejantes a puntos se ven en cada celda. En las células G9a-KD, morfología centrosoma anormal y número, sugestivo de amplificación centrosoma se observó en aproximadamente el 25% de las células. centrosomas anormalmente amplificadas se magnifican en las cajas.
Los centrosomas son esenciales para la polaridad celular adecuada y equilibrada distribución de los cromosomas [22]. Se utilizó un anticuerpo contra γ-tubulina para evaluar los centrosomas en las células KD. Aunque la mayoría de las células en el control y G9a-KD mostró normal (1 a 2) centrosoma números, se detectó la amplificación centrosoma en aproximadamente 25% de las células en las células G9a-KD. Esto no se detectó en las células control y células SUV-KD (Fig. 3C). anormalidad Centrosoma también se observó tanto en las células MCF7-G9a-KD y células H1299-G9a-KD en alrededor de 20% de las células (Figura S1). Por lo tanto, G9a podría desempeñar un papel crítico en la regulación de la duplicación del centrosoma, presumiblemente a través de la estructura de cromatina en lugar de al afectar la expresión génica en las células cancerosas.
La estructura de la cromatina en los telómeros también es importante para mantener la longitud de repeticiones teloméricas [7 ]. Hemos investigado la función de los telómeros en las células del SUV-KD-KD y G9a. En primer lugar, se utilizó el ensayo telo-FISH para evaluar la longitud del telómero. se observó una reducción significativa en la intensidad de señal de los telómeros en las células PC3 tratadas G9a-KD y SUV-KD, en comparación con las células de control que sugieren que la regulación de la longitud de los telómeros fue interrumpido en estas células KD. Un ejemplo representativo de la disminución de la señal de los telómeros se muestra en la figura 4A. A continuación cuantificó la actividad de la telomerasa en las células mediante el ensayo TRAP y encontramos reducción de la actividad de la telomerasa en la línea celular G9a-KD (Fig. 4B). Por lo tanto, la longitud de los telómeros en las células acortado G9a-KD podría ser el resultado de la actividad telomerasa alterada. La disminución del nivel de expresión de hTERT en las células G9a-KD se presta apoyo a estos resultados (Fig. 4C). En contraste, las células SUV-KD mostraron niveles similares de actividad de la telomerasa de las células de control, lo que indica que la disfunción de los telómeros en las células SUV-KD podría depender de mecanismos distintos de la expresión de hTERT, probablemente debido a alteraciones del estado de metilación H3K9 en heterocromatina telomérica.
A, los núcleos en interfase se hibridaron con Cy3 conjugado con el ácido nucleico peptídico (ANP) y la sonda telomérica contratinción con DAPI. marcada reducción en la señal de los telómeros se observa en núcleos en interfase de KD células en comparación con los núcleos de la línea de control. Se muestra en las inserciones son las imágenes ampliadas de las áreas indicadas. B, la actividad, la telomerasa se evaluó mediante el ensayo TRAP. Las muestras con actividad de la telomerasa producen un 6-base de la escalera incremental de los productos TRAP en los geles. bandas de control interno aparecen en la parte inferior del gel. Una intensidad de señal reducida de la actividad telomerasa se observa en las líneas celulares G9a-KD. La señal no se observa cuando los extractos se tratan previamente con calor para suprimir los componentes proteicos de la telomerasa, lo que sugiere la especificidad de la telomerasa de la señal medida por este ensayo. C, el nivel de expresión de hTERT se midió por PCR en tiempo real. la expresión de hTERT se reduce en las células G9a-KD en comparación con aquellos en el PC3 de control y las células SUV-KD. Las barras de error indican la desviación estándar de los 3 ensayos independientes.
Dsicussion
El presente estudio demuestra que la expresión de SUV39H1 y G9a es importante apoyar el crecimiento de las células malignas, a pesar de que juegan papeles distintos en las células cancerosas. De forma inesperada, muy pocos genes están regulados hasta después de la inhibición de los 2 HMTs, lo que sugiere que H3K9 metilación silenciamiento asociado, que ha sido mecánicamente vinculado a la metilación del ADN [9] - [11], es estable una vez que se establece en las células del cáncer, posiblemente a través de la acción de múltiples HMTs.
Centrómero media múltiples funciones de segregación, incluyendo la formación del cinetocoro, los movimientos de husillos mediada, hermana de cohesión y de un puesto de control mitótico [6]. La arquitectura de la heterocromatina pericéntrica juega un papel crucial en la segregación cromosómica, así como en el establecimiento de la represión transcripcional. La pérdida de Suv39h1 y SUV39H2 HMTases en modelo de ratón abolió H3-K9 metilación en pericentric heterocromatina y la inestabilidad cromosómica inducida. Sin embargo, las interrupciones de un solo gen, ya sea para Suv39h1 o Suv39h2 no parecen afectar a la viabilidad y la fertilidad de los ratones mutantes, lo que sugiere estas dos enzimas son redundantes [2]. Estudio en G9a ratón knockout mostró que G9a era necesario para el desarrollo embrionario o la diferenciación y crecimiento defecto embrionario en células ES deficientes en G9a podría ser debido a la muerte celular apoptótica, pero no la detención del ciclo celular. En ese modelo, la inestabilidad cromosómica no fue percibido en las células knockout [19]. Encontramos aquí que en las células cancerosas, que a menudo albergan los números aberrantes del cromosoma, G9a KD induce la interrupción del centrosoma y más extensa inestabilidad cromosómica, lo que resultó en la inhibición del crecimiento celular y la senescencia celular. Parecía que 3MeH3K9 también se vio disminuida en la región de eucromática en las células G9a KD. Esto podría ser debido a la drástica disminución de 2MeH3K9, que es prerrequisito para la modificación de tri-metilación en el loci. Estos datos sugirieron que el papel de G9a en las células cancerosas es crítica y parece ser la protección más interrupciones cromosómico. Por el contrario, solo Suv39H1 KD suprimió parcialmente en 3MeH3K9 región pericentric pero no podía inducir inestabilidad cromosómica, probablemente debido a las funciones redundantes para SUV39H HMTases [2].
Los informes recientes han demostrado que las combinaciones específicas de la cromatina centromérica de modificaciones de las histonas y la organización tridimensional de los cromosomas también podría ser importante para el reclutamiento de los complejos de cohesión a heterocromatina cinetocoros cerca de la hermana [23] [24]. 2MeH3K9 cromatina, que está presente en el espacio interior kinetochore entre cromátidas hermanas mitóticas y en las regiones que flanquean la cromatina centromérica, podría ser atribuible a la posición de CENP-A hacia la cara hacia el polo del cromosoma mitótico [25]. La disminución del nivel de 2MeH3K9 en la región de acompañamiento de la cromatina del centrómero por G9a KD podría afectar a la organización tridimensional de los cromosomas centrómero, lo que resulta en la inestabilidad cromosómica que encontramos aquí.
Los centrosomas comienzan a duplicar en la tarde G1 /principios de la fase S del ciclo celular, y dos centrosomas funcionales se forman durante G2 [22]. Si las células no pueden someterse a la citocinesis después de la síntesis de ADN y las siguientes hojas de vida del ciclo celular, que podrían contener el doble de ADN normal y el número centrosoma. Por lo tanto, los datos actuales sugirió que el fracaso en la citocinesis podría ser una explicación para las anormalidades en el número cromosómico y centrosomas en las células G9a-KD.
G9a parece ser necesario para la expresión de hTERT y el mantenimiento de los telómeros. SUV39H1 también es necesaria para la regulación de control de los telómeros. En el modelo de ratón, fibroblastos de embriones de ratones nulos con tanto Suv39h1 y Suv39h2 mostró telómeros alargamiento anormal [26]. La abrogación de los dos HMTs resultado la pérdida de características heterocromáticas en los telómeros en las células madre embrionarias y fibroblastos embrionarios de ratón. Nuestros datos sugieren que SUV39H1 KD en las células cancerosas tienen telómeros más cortos. Las razones por las que encontramos el acortamiento de los telómeros en las células SUV39KD por contraste con los resultados previamente podrían deberse a la célula de los tipos estudiados (es decir, células normales frente a células cancerosas), ya que la función de los telómeros fue generalmente de forma aberrante regulada en las células del cáncer [27]. Necesitan más estudios para abordar los vínculos entre mecanicistas G9a, SUV39H1 y estructuras cromosómicas /telómeros, así como la expresión de hTERT en células cancerosas. También podría ser interesante ver si los efectos individuales de G9a y SUV39H1 son cooperativas, cuando ambos están agotando, y si la reintroducción de los dos HMTs revierte el fenotipo. Sin embargo, la orientación de estas histonas methyltransferases podría ser de beneficio terapéutico en tratamientos contra el cáncer.
Información de Apoyo
figura S1.
regulación a la baja de G9a metiltransferasa en líneas celulares MCF7 y H1299. A, PCR en tiempo real muestra que la interferencia shRNA regula a la baja eficacia G9a en MCF7 y H1299. Las barras de error en tiempo real, PCR indican la desviación estándar de la expresión en 3 clones aislados independientemente. B, análisis de FACS que muestra el contenido de ADN se aumenta 1,5-2 veces en las células G9a-KD comparación con el control simulado en un clon aislado. Se observó un aumento del contenido de ADN en dos clones aislados independientemente-(datos no mostrados). C, análisis de cariotipo mostró pequeñas y el aumento de los cromosomas en las dos líneas celulares MCF7-G9a-KD-H11299 y G9a-KD. D, centrosomas se detectaron utilizando un anticuerpo contra γ-tubulina. En las células de control, se ven 1-2 centrosomas que aparecen como estructuras semejantes a puntos.