Extracto
nesis de los clusters hierro-azufre se ejecuta mediante sistemas de ensamblaje de proteínas distintas. Los mamíferos tienen dos sistemas, el sistema mitocondrial Fe-S conjunto de cluster (ISC) y el sistema de montaje citosólica (CIA), que están conectados por un mecanismo desconocido. Los miembros humanos de la familia de las proteínas NEET 2Fe-2S, nutrientes privación autofagia factor 1 (NAF-1) y mitoNEET (MNT), se encuentran en la interfaz entre la mitocondria y el citosol. Estas proteínas han sido implicados en la proliferación de células de cáncer, y pueden transferir sus grupos 2Fe-2S a una proteína apo-aceptor estándar. Aquí se presenta la primera fisiológica 2Fe-2S aceptador de clúster para ambas proteínas como NEET Anamorsin humana (también conocido como inhibidor-1 inducida por la apoptosis de citoquinas; CIAPIN-1). Anamorsin es una proteína de transferencia de electrones que contiene dos sitios de unión de racimo-hierro-azufre que se requiere para el montaje citosólica Fe-S cluster. Mostramos, utilizando espectroscopia UV-Vis, que tanto NAF-1 y MNT puede transferir sus racimos 2Fe-2S a APO-Anamorsin con las constantes de velocidad de segundo orden similares a los de otras proteínas de transferencia de 2Fe-2S humanos conocidos. Una interacción proteína-proteína directa de las proteínas NEET con apo-Anamorsin se detectó utilizando interferometría capa biológica. Por otra parte, la espectrometría de masas por electrospray de holo-Anamorsin preparado por la transferencia de clúster muestra que recibe tanto de sus 2Fe-2S racimos de los NEET. Proponemos que el TMN y NAF-1 pueden proporcionar rutas paralelas que conectan el sistema ISC mitocondrial y la CIA. 2Fe-2S grupos reunidos en las mitocondrias son recibidas por las proteínas requiere y cuando sea necesario transferidos a Anamorsin, la activación de la CIA
Visto:. Lipper CH, ML Paddock, Onuchic JN, Mittler R, R Nechushtai, Jennings PA ( 2015) relacionadas con el cáncer NEET proteínas de transferencia de 2Fe-2S Clusters de Anamorsin, una proteína necesaria para Cluster citosólica hierro-azufre Biogénesis. PLoS ONE 10 (10): e0139699. doi: 10.1371 /journal.pone.0139699
Editor: Yaakov Koby Levy, Instituto de Ciencia Weizmann, ISRAEL
Recibido: 14 de mayo de 2015; Aceptado: September 15, 2015; Publicado: 8 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Lipper y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación: Este trabajo fue apoyado por el NIH GM101467 adjudicado a PAJ, la Fundación de Ciencias de Israel - ISF 865/13 otorgado a RN, y los fondos de la Universidad del Norte de Texas. Facultad de Artes y Ciencias otorgó a RM. El trabajo en el Centro de Física Teórica Biológica fue patrocinado por la Fundación Nacional de Ciencia (Subvenciones PHY-1427654 y MCB-1214457) y por la Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Texas. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El hierro-azufre (Fe-S) racimos son cofactores antiguos encontrados en las proteínas de todos los reinos de la vida. Las proteínas que contienen azufre agrupaciones de hierro realizan numerosas funciones críticas incluyendo la transferencia de electrones en el metabolismo oxidativo, la fotosíntesis, metabolismo de nucleótidos, síntesis de cofactores de proteínas, y son cruciales para la replicación del ADN y la reparación del ADN [1, 2]. Biosíntesis de Fe-S racimos se produce por los sistemas de montaje complejas de proteínas, que incluyen proteínas de andamiaje, chaperones, proteínas de transferencia de electrones y desulfurases cisteína [3]. En los mamíferos existen dos grupos distintos de Fe-S maquinaria de ensamblaje de clúster: el sistema de montaje del grupo hierro mitocondrial de azufre (ISC) y el sistema de la asamblea citosólica del grupo hierro de azufre (CIA). La CIA suministra Fe-S, las agrupaciones de citosólicas y nucleares proteínas, incluyendo aquellos involucrados en la replicación y reparación del ADN [4]. El sistema ISC mitocondrial se ha informado que sea necesaria para la activación del sistema citosólico [5, 6]. Sin embargo se desconoce la naturaleza exacta de la relación entre los dos sistemas. Existen varias enfermedades humanas asociadas con defectos en la biogénesis de Fe-S, incluyendo la ataxia de Friedreich, anemia sideroblástica, síndrome de disfunción mitocondrial múltiple y el cáncer [3, 7].
Las proteínas NEET humanos se descubrieron recientemente una nueva clase de las proteínas 2Fe-2S. Son los únicos proteínas hierro-azufre conocidos localizados en o cerca de la membrana mitocondrial externa, que son en la interfaz entre la mitocondria y citosol. La mejor caracterizada de estos son mitoNEET (MNT, CISD1) y el factor-1 de nutrientes de privación de la autofagia (NAF-1, miner1, ERIS, CISD2) (revisado en [8]). mnt se encuentra en la membrana externa mitocondrial (OMM) y NAF-1 en el retículo endoplasmático (ER) y el mitocondrial asociada a membrana (MAM) de la ER [9-11]. NAF-1 en el MAM está íntimamente conectada a la OMM a través de su complejo con IP
3R, que está directamente atado a la proteína VDAC OMM poros por GRP75 [9, 12]. Estas proteínas NEET están implicados en varias enfermedades humanas, incluyendo cáncer, diabetes, fibrosis quística, síndrome de Wolfram 2, la neurodegeneración y la atrofia muscular [8, 13 a 18]. Las estructuras cristalinas muestran que tanto la MNT y la NAF-1 son homodímeros con la coordinación de un grupo de 2Fe-2S con un 3Cys inusuales cada protómero: la coordinación 1His [19, 20]. La inusual Fe-S coordinación del grupo por tres ligandos de Cys y un ligando no Cys se ha encontrado en proteínas de transferencia de clúster Fe-S [21]. Hemos demostrado la capacidad de las proteínas NEET para transferir sus racimos 2Fe-2S a APO-ferredoxina, la proteína patrón de referencia utilizado para los experimentos de transferencia de racimo Fe-S [22, 23].
La localización subcelular de la NEET proteínas en la interfase del citosol y la mitocondria, así como su función de transferencia de clúster, nos llevó a investigar si se conectan el sistema ISC mitocondrial al sistema de CIA. La proteína citosólica 2Fe-2S Anamorsin (también conocido como inhibidor-1 inducida por la apoptosis de citoquinas; CIAPIN-1) es una proteína de transferencia de electrones que se requiere para un primer paso de Fe-S conjunto de racimo por el sistema CIA [24-26]. En este estudio identificamos Anamorsin como el primer conocido fisiológica 2Fe-2S aceptor clúster directa tanto para MNT y la NAF-1. Similar a nuestros resultados anteriores con ferredoxina, la transferencia sólo se produce cuando el clúster está en las oxidadas [2Fe-2S]
2 + Estado y es inhibida por la mutación del Su ligando a Cys. La tasa de transferencia de clúster para Anamorsin de MNT o NAF-1 es comparable a las de otros 2Fe-2S proteínas de transferencia de clúster humanos conocidos. Mostramos, utilizando interferometría capa biológica, que ambos NEETs forman una interacción proteína-proteína directo con Anamorsin. Adicionalmente, informamos que las proteínas NEET transfieren directamente 2Fe-2S grupos a ambos sitios de unión de racimo-Anamorsin que permiten la reconstitución completa de holo-Anamorsin. Debido a holo-Anamorsin es necesaria para la biosíntesis de Fe-S, las agrupaciones por el sistema de la CIA, 2Fe-2S transferencia de clúster para Apo-Anamorsin sugiere que las proteínas NEET tienen un papel esencial en la regulación /activación del conjunto de racimo por el sistema de la CIA.
Procedimientos experimentales
Expresión y purificación de proteínas
Los dominios solubles de NAF-1 (residuos 57-135) y mNT (residuos 33-108) se expresaron y se purifica como descrito anteriormente [19, 23]. Las proteínas purificadas NEET contienen ≥ 98% de ocupación clúster. El humano Anamorsin ADNc que codifica plásmido (Abgent) se amplificó por PCR y se subclonó en un-a pET28 (+) vector (Novagen) entre los sitios de restricción NdeI y XhoI. El vector añade una etiqueta de His 6x y un sitio de escisión de trombina a la N-terminal del gen. BL-21 Codon Plus células (DE3) RIL (Stratagene) se transformaron con el pET28-a (+) - Anamorsin constructo. Los cultivos se desarrollaron en medio LB que contenía como se describe anteriormente [27]. 750 M FeCl
3 se añadió al cultivo 30 minutos antes de la inducción con IPTG. Las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en 20 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 250 mM, imidazol 5 mM. Las células resuspendidas se lisaron usando un homogeneizador EmulsiFlex-C5 (Avestin) y se centrifugó. El sobrenadante que contiene his-tagged Anamorsin estaba obligado a Ni-NTA agarosa resina (Qiagen), se lavó con el tampón de resuspensión y se eluyó con el mismo tampón con imidazol 300 mM. Eluido Anamorsin se diluyó en 25 mM Tris-HCl pH 7,1 que contiene DTT 5 mM y se purificó adicionalmente usando una columna de intercambio de aniones 5 ml HiTrap Q HP (GE Healthcare). La proteína se eluyó mediante un gradiente de NaCl 150 a 500 mM de pH 7,1 y 5 mM de DTT 25 mM Tris-HCl. Para apo-Anamorsin, el clúster 2Fe-2S se eliminó mediante el método descrito por Kennedy y Beinert [28]. Los mutantes del sitio de clúster individuales de Anamorsin (C1 y C2) fueron diseñados mediante la sustitución de cada uno de los ligandos de racimo 4Cys con Ser mediante mutagénesis dirigida al sitio.
transferencia de espectroscopia de absorción cinética de UV-Vis
Absorción se registraron espectros de 300 a 800 nm en un espectrofotómetro Cary 50 (Varian) con una unidad de control de temperatura fijado en 37 ° C utilizando una cubeta de longitud de trayectoria de 1 cm. Los espectros se obtuvieron en condiciones aerobias a menos que se indique lo contrario. La relación de la absorbancia a 423 nm (característico de la agrupación (s) 2Fe-2S de Anamorsin) a 458 nm (NEET 2Fe-2S clúster firma pico) se controló en la progresión de la transferencia de clúster. La extensión de la reacción de transferencia de clúster se determina y se representa describió anteriormente [23] utilizando la ecuación: Progreso de la transferencia (%) = (R
obs-R
inicial) /(R
última-R
inicial) x 100%, donde R
inicial es la relación de absorbancia 423/458 nm en el tiempo 0, R
obs es la relación 423/458 nm en un momento dado, y R
final es el IS la relación 423/458 nm para la transferencia completa. R
inicial para la transferencia de NAF-1 y MNT es de 0.78. R
valores iniciales para la transferencia de NAF-1 mutante H114C mutante y MNT H87C son 0,93 y 0,90 respectivamente. La relación de absorbancia 423/458 nm de purificado holo-Anamorsin, C1 mutante y mutante C2 (1,04, 1,03, 0,99, respectivamente) fueron utilizados como los valores de transferencia completa (R
final). Para las reacciones de transferencia, apo-Anamorsin se preincubó con DTT 2,5 mM durante 60 minutos para asegurar la reducción de sus grupos de cisteína tiol. mediciones cinéticas se realizaron con concentraciones equimolares de NAF-1 o MNT a APO-Anamorsin (un NEET con dos clúster 2Fe-2S por Anamorsin) en 50 mM Bis-Tris pH 7,0, NaCl 100 mM, DTT 2,5 mM a menos que se indique indique lo contrario. La apo-Anamorsin y DTT se preincubaron durante 60 min antes de la adición de la proteína NEET.
biocapa interferometría
Cinética de la interacción apo-Anamorsin con NAF-1 o mnt se midió en una octeto instrumento Red96 (ForteBio). Apo-Anamorsin se biotiniló mediante la incubación durante 30 minutos con EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotina (Thermo Scientific) a una proporción de 2: 1 molar de reactivo de biotinilación a la proteína luego a intercambio de tampón usando una columna PD10 desalado (GE Healthcare) en 50 mM bis-tris, NaCl 100 mM, 0,1% de Tween 20, 0,5 mg /ml de BSA, DTT 5 mM, pH 7,0. 3,5 M biotinilados Anamorsin se inmovilizó a los biosensores de estreptavidina (ForteBio). Los biosensores cargados se equilibraron en el mismo tampón sin la TDT. Asociación se midió durante 900 segundos. La asociación está determinada por el cambio de longitud de onda (nm). Después de la asociación, disociación se determinó mediante la transferencia de la punta biosensor para amortiguar sin proteína NEET por un período de 1800 segundos. Los controles para la unión no específica para cada concentración NEET se llevaron a cabo sin carga al biosensor y restan de los datos de unión correspondientes. Los datos se ajustaron a un modelo 1: 1 para unirse a apo-Anamorsin y 2: Modelo de ligando heterogénea 1 por la unión a holo-Anamorsin usando el software de octetos. Los datos se representó usando Kaleidagraph (Synergy Software).
Preparación de Anamorsin transferencia posterior a la agrupación de espectrometría de masas y la interferometría biocapa
25 mu M apo-Anamorsin en 50 mM Tris-Bis pH 7,0 y NaCl 100 mM se preincubó con DTT 2,5 mM durante 60 minutos. A continuación se añadió 27,5 M NAF-1 y la mezcla de reacción se incubó en un agitador orbital a 37 ° C durante 3,5 horas. Después de la reacción holo-Anamorsin se purificó a partir NAF-1 usando una columna de intercambio aniónico 1 ml HiTrap Q HP. La proteína se eluyó mediante un gradiente de NaCl 150 a 500 mM en Tris-HCl 25 pH 7,5. Las muestras para espectrometría de masas se cambió de tampón en amonio 10 mM de acetato de pH 7,5 usando Quick columnas de proteína de Spin (Roche).
ionización electrospray espectrometría de masas
Anamorsin muestras de amonio 10 mM de acetato pH 7,5 con una concentración de ~ 1 mg /ml se diluyeron 100 veces en 50% de metanol con ácido acético 0,5% y se inyecta en un sistema de triple cuadrupolo Quattro Ultima (Waters). Los espectros se adquirieron en modo de ion positivo con un rango de m /z de 500-2000. deconvolución de masas se realizó utilizando la herramienta MassEnt1 en el paquete de software MassLynx.
Resultados
NAF-1 o MNT puede transferir sus oxidadas grupos 2Fe-2S a APO-Anamorsin
Anamorsin tiene dos sitios de unión 2Fe-2S, cada uno con una ligadura de clúster 4-Cys ferredoxina-como que difiere de la de los NEETs (3Cys: 1His). Esta diferencia en la ligadura da un espectro de absorbancia UV-Vis que es distinta de la de las proteínas NEET, predominantemente en la región de 400-500 nm. En esta región Anamorsin tiene picos de absorción a 423 y 458 nm, mientras que tanto NAF-1 y mnt sólo tienen un pico a 458 nm (Fig 1). Se determinó el coeficiente de extinción molar del pico clúster Anamorsin 2Fe-2S a 458 nm a ser 5800 M
-1cm
-1 por racimo, mientras que la de los NEET es 5000 M
-1cm
-1 por cluster [29]. Utilizamos la relación de 423 nm a 458 nm para controlar la transferencia de las agrupaciones 2Fe-2S del MNT o NAF-1 a apo-Anamorsin. A medida que se produce la transferencia se espera que el pico de 423 nm a subir, y por lo tanto un aumento en la proporción 423/458. En la pérdida de contraste de la agrupación a la solución daría lugar a la pérdida completa de absorbancia visible en la región de 400-800 nm [19]. Para preparar la proteína de 2Fe-2S estudios de transferencia cluster, las cisteínas libres de apo-Anamorsin se reducen por la pre-incubación con DTT durante 60 minutos para asegurarse de que están listos para la ligadura de clúster. La primera exploración a partir del inicio de la transferencia muestra un espectro de NEET oxidado, lo que indica que la mayoría de la TDT se oxida. Redujo la TDT reducirá los grupos NEET [30], lo que inhibe la transferencia de [23]. Posteriormente, se añadió NAF-1 o MNT a prerreducido apo-Anamorsin y la reacción de transferencia de agrupación fue supervisado por espectrofotometría UV-Vis. La estequiometría de NAF-1 o MNT a APO-Anamorsin fue elegido para proporcionar un racimo 2Fe-2S por Anamorsin como se informó anteriormente que tanto se agrupan los sitios de unión no podían ser reconstituidos al mismo tiempo [24, 27]. Bajo condiciones oxidantes transferencia procede de ambos NAF-1 y MNT sin pérdida de clusters a la solución y los datos están bien ajustarlo a una sola fase exponencial (Figura 2). transferencia de NAF-1 procedió a la finalización mientras que el TMN transferido ~ 80% de sus grupos que muestran una transferencia eficaz de cualquiera de las proteínas de NEET Anamorsin. Exploraciones en selectos puntos de tiempo se puede ver en la figura S1. Reducción de la TDT se ha demostrado en algunos casos para mediar la transferencia de clúster [31]. Para probar si este era el caso para NEET-Anamorsin, DTT se eliminó de apo-Anamorsin siguiente 60 min de incubación con este agente. La TDT libre de apo-Anamorsin es fácilmente capaz de recibir los racimos NEET (S2) Fig. Esto indica que la transferencia de clúster NEET-Anamorsin es un evento exclusivamente mediada por proteínas.
A. estructuras (superior) de cristal de MNT (código PDB: 2QH7,), NAF-1 (AP código: 3FNV); clúster NEET 2Fe-2S (medio) con 3-Cys: 1His coordinación; Los espectros (Abajo) La absorción de MNT 25 M y NAF-1. B. Estructura (Top) Crystal del dominio N-terminal de Anamorsin (código PDB: 2YUI) con un esquema adicional de la agrupación 2Fe-2S estructurado dominio de unión; clúster (Medio) Representante Anamorsin 2Fe-2S con la coordinación 4-Cys (de ferredoxina, código PDB: 1RFK); (Abajo) Espectro de absorción de 43 M Anamorsin aislado de
E
.
coli
.
La reacción de transferencia de clúster 2F-2S se controló mediante espectroscopia de absorción UV-Vis. El progreso de la transferencia se representó gráficamente frente al tiempo. transferencia de clúster desde NAF-1 (A) y MNT (B) a APO-Anamorsin se produce sólo cuando el clúster 2Fe-2S se oxida y no cuando es reducida con ditionito de sodio 10 mM. La sustitución de la coordinación de su residuo con Cys (H114C para NAF-1 y H87C para MNT) inhibe, pero no elimina la transferencia. Todos los restos indicados han sido determinados con 25 mu M NAF-1 o MNT (50 mM 2Fe-2S agrupaciones) y 50 mM de apo-Anamorsin en 50 mM bis tris, NaCl 100 mM, DTT 2,5 mM, pH 7,0 a 37 ° C.
además, la prueba si la transferencia de clúster 2Fe-2S de las proteínas NEET a aPO-Anamorsin dependía del estado de oxidación del grupo, ya que encontramos en los estudios anteriores con transferencia de clúster para apo-ferredoxina [22, 23]. El espectro NEET reducida tiene dos picos distintos (S3 FIG), a diferencia del espectro sin rasgos de la reducción de Anamorsin [27]. Cuando el grupo NEET 2Fe-2S es pre-reducido con ditionito de sodio no transferencia a Apo-Anamorsin se observó (Fig 2). Este hallazgo muestra que NEET transferencia clúster para Anamorsin requiere oxida 2Fe-2S racimos como nos encontramos previamente para la transferencia de las proteínas NEET a APO-ferredoxina, así como se observa para la transferencia de la hierro-azufre ISCU proteína de ensamblaje a APO-Fd [32] .
Estamos, además, puso a prueba la importancia de la única Su ligando de mNT y la NAF-1 para la transferencia de clúster eficiente. La sustitución de los residuos de His coordinación con Cys en NAF-1 (H114C) y en MNT (H87C) inhibe la transferencia de Apo-ferredoxina [22, 23, 33, 34]. Los espectros de NAF-1 mutante H114C mutante y mnt H87C se puede ver en la figura S4. Del mismo modo, encontramos que la transferencia de clúster para Apo-Anamorsin también fue inhibida en más de 10 veces en estos mutantes (Figura 2).
Las tasas de transferencia de las proteínas NEET son similares a las de las proteínas de transferencia de cluster-humanos conocidos
Transferencia de clusters 2Fe-2S a aPO-aceptores de proteínas ha sido descrito como de segundo orden [32, 35]. Por lo tanto, a prueba de transferencia de clúster desde mnt o NAF-1 a apo-Anamorsin a diferentes concentraciones de los donantes de dímero NEET (3,13 M, 6,25 M, 12,5 M y 25 M). La tasa observada para cada concentración (k
obs) fue linealmente dependiente de la concentración de proteína NEET (Fig 3). La aparente segundo orden constante de velocidad (
k
2) para cada uno se determina a partir del lineal se ajusta a la k
valores obs. El
k
2 valores calculados para la NAF-1 y MNT son 600 ± 90 M
-1 min
-1 y 460 ± 60 H
-1 min
-1, respectivamente, que son similares en evaluar las constantes medidos para la 2Fe-2S proteínas de transferencia de clúster ISCA humana y ISCU [32, 35] (Tabla 1). Las velocidades de transferencia de algunas proteínas de transferencia de 2Fe-2S se ven reforzadas por las chaperonas dependientes de ATP. ISCU de
Azotobacter vinelandii
en presencia del sistema cochaperone HSCA /HSCB y transferencias cofactores necesarios con una constante de velocidad informado de que es sólo ligeramente mayores que las de las proteínas NEET [36] (Tabla 1). Una similitud adicional entre los NEETs y ISCU es el requisito para la oxidación del grupo 2Fe-2S para la transferencia de [32]. En conjunto, la transferencia NEETs tan eficazmente como ISCU y es probable que funcionar de una manera similar. Transferencia
NAF-1 (A) y mnt (B) a APO-Anamorsin se monitorizó mediante espectroscopía de absorción UV-Vis para una serie de concentraciones NEET. Para cada concentración NEET se mantuvo la proporción 1 NEET dímero por cada 2 apo-anamorisn. La constante de velocidad, k
obs, se determina a partir del ajuste de los datos a un aumento exponencial y se representa gráficamente frente a la concentración para NAF-1 (C) o mnt (D). Se utilizó la pendiente de la línea de mejor ajuste para determinar las constantes de velocidad de segundo orden aparente (
k
2) para la NAF-1 y MNT, que son 600 ± 90 M
-1 min
-1 y 460 ± 60 H
-1 min
-1, respectivamente.
Aquí demostramos que 2Fe-2S agrupaciones se transfieren a Anamorsin de las proteínas NEET. Para hacer frente a la posibilidad de que los NEETs son simplemente proveedores de hierro y sulfuro de a través de un mecanismo de liberación y de captura, se realizó la transferencia en presencia de EDTA (un quelante de hierro que secuestra hierro libre y por lo tanto inhibe la Asamblea clúster). Mientras que el hierro libre y sulfuro pueden formar espontáneamente racimos en Anamorsin [24, 27], EDTA suprime la asamblea. Sin embargo, la transferencia de cada uno de los NEET a APO-Anamorsin actúa de forma eficiente en presencia de EDTA (S5 figura). Por lo tanto, el papel de los NEET en este proceso está más allá de la simple entrega de hierro y sulfuro e interacción directa es necesaria para la transferencia eficiente.
NAF-1 o se unen directamente a MNT Apo-Anamorsin
Para investigar el potencial para la interacción proteína-proteína entre las proteínas y los NEET Anamorsin que emplea biocapa interferometría (BLI). Tanto NAF-1 y MNT ligados directamente a inmovilizada apo-Anamorsin. Las curvas de asociación y disociación se muestran en la Figura 4. On (
k
en) y fuera de tarifas (
k
off) medidos para cada interacción se muestran en Tabla 2. los controles sobre tarifas de NAF-1 y mNT difieren en un factor de dos, mientras que fuera de la tasa de NAF-1 es ~ 18 veces más rápido que el de la mNT. También se analizó la unión de los holo-NEET en Holo-Anamorsin (S6 figura).
sensogramas para la unión de holo-NAF-1 (A) y holo-MNT (B) para biotinilado apo-Anamorsin inmovilizado para biosensores recubiertas con estreptavidina se muestran. La asociación fue seguido durante 900 segundos (el aumento de señal), seguido por 1800 segundos de disociación (señal de descomposición). Los datos se ajustaron a un modelo de uno-a-uno (curvas negras). Dentro y fuera de las tasas fueron determinados a partir de los ajustes para cada concentración NEET-Anamorsin (que se muestra en la Tabla 2).
NEET proteínas pueden transferir a cada uno de los sitios de unión de racimo-Anamorsin
Anamorsin tiene dos 2Fe-2S sitios de unión de clúster y
in vitro
reconstitución química mostró que cada sitio de clúster podría ser reconstituido pero la unión fue clúster mutuamente excluyentes [27]. Nos referimos a la primera sitio como C1 y la segunda como C2 (Fig 5A). Anamorsin mutantes que contienen sólo un único sitio de unión al clúster se produjeron en el que los cuatro residuos de cisteína desde el otro sitio se sustituyeron con serinas para poner a prueba para su posible transferencia preferencial de MNT o NAF-1 a apo-Anamorsin. El espectro de absorbancia para cada mutante se puede ver en la figura S7. Como se muestra en la figura 5, cada mutante Anamorsin recibido conglomerados de cada proteína donante NEET que muestran poca preferencia para la transferencia a cualquiera de los sitios aceptores de C1 o C2
Anamorsin mutantes que contienen un sitio único grupo de unión se muestran.; el otro sitio de clúster se interrumpió mediante la sustitución de todos los residuos de Cys por Ser. se muestran (A) Esquema de Anamorsin-C1 (verde) y Anamorsin-C2 (magenta). 2Fe-2S transferencia de clúster desde NAF-1 (B) o MNT (C) a cada sola apo-Anamorsin mutante de unión de clúster se controló mediante espectroscopia de absorción UV-Vis. Las huellas se obtuvieron con 25 mM NAF-1 o MNT (50 micras 2Fe-2S racimos) y 50 mM de apo-Anamorsin.
NAF-1 homodímeros pueden suministrar ambos grupos 2Fe-2S a Anamorsin
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, decidimos probar si bien un único homodímero NEET podría suministrar 2Fe-2S grupos a ambos sitios aceptores C1 y C2 de una sola apo-Anamorsin. transferencia de clúster se ha medido la NAF-1 con el racimo estequiométrica de donantes a sitios aceptores (50 mM NAF-1 dímero y 50 micras apo-Anamorsin) (Figura 6A). Nos centramos en NAF-1 porque sólo NAF-1 mostró una transferencia completa con un exceso de apo-Anamorsin (figura 2). Transferencia de ~ 1,5 2Fe-2S se encontró racimos por Anamorsin, sorprendentemente demuestra que al menos la mitad de las proteínas Anamorsin aceptados dos grupos después de la incubación con NAF-1. Se observó ninguna pérdida de clúster a la solución (amplitud espectral). Como los datos están bien en condiciones de una sola fase exponencial, ambos grupos son transferidos en pasos cinéticamente indistinguibles. La explicación más simple es que ambos grupos se transfieren en un único acontecimiento de unión, aunque pueden ser ligeramente diferentes velocidades debido a la diferente composición de aminoácidos alrededor de los dos sitios de unión de racimo-Anamorsin. La transferencia incompleta puede ser debido a la formación de enlaces disulfuro intramoleculares en apo-Anamorsin o posiblemente debido a cisteína cadenas laterales modificadas en apo-Anamorsin. El primero se sugirió anteriormente para la transferencia incompleta de ISCU a APO-ferredoxina [32]. Para confirmar la formación de después de la transferencia de holo-Anamorsin totalmente ocupada de NAF-1 se utilizó ionización electrospray espectrometría de masas (ESI-MS). La holo-Anamorsin formado por una reacción de transferencia con NAF-1 se purificó a partir NAF-1 usando cromatografía de intercambio de aniones. La holo-Anamorsin resultante se analizó mediante ESI-MS. Además adquirimos ESI-MS espectros para apo-Anamorsin y Anamorsin ya que fue purificado de
E
.
coli
. Los espectros resultantes se muestran en la figura 6B. La masa prevista para el apo-Anamorsin construcción es 35614 Da y la masa esperada de un grupo 2Fe-2S es de 176 Da. Nos encontramos con que el Anamorsin purificó a partir de
E
.
coli
es predominantemente contiene un solo grupo, mientras que la fracción mayor de Anamorsin posterior a la transferencia contiene dos grupos 2Fe-2S; previamente la reconstitución química informó de ocupación clúster para que sea mutuamente excluyentes [27]. Este resultado pone de manifiesto la necesidad de la transferencia directa para activar Anamorsin.
(A) 2Fe-2S traslado desde 50 M diméricas Naf-1 a 50 micras apo-Anamorsin (dos grupos 2Fe-2S por Anamorsin) (mostrados en rojo) se compara con el 25 M NAF-1 a 50 micras apo-Anamorsin (un racimo 2Fe-2S por Anamorsin) (en azul). De transferencia casi completa para el clúster 2Fe-2S Anamorsin por muestra y es aproximadamente un 75% de avance para los dos clúster 2Fe-2S Anamorsin por muestra. Este último resultado muestra que al menos la mitad de la Anamorsin es capaz de recibir dos grupos 2Fe-2S a partir de una sola NAF-1 homodímero. (B) Anamorsin después de una reacción de transferencia con NAF-1 se purificó y se analizó mediante ESI-MS (mostrado en rojo). Los espectros de masas de la apo-Anamorsin (sólida línea de negro) se compara con el pico principal de post-transferencia Anamorsin (sólida línea roja), que muestra un aumento en la masa correspondiente a la incorporación de dos grupos 2Fe-2S. También hay un pico menor a 35.856 Da, que probablemente corresponde a Anamorsin con un solo grupo 2Fe-2 y un ion de hierro unido que puede ser un resto de un clúster que degrada durante el proceso de preparación de la muestra.
E
.
coli
-purified Anamorsin se muestra para la comparación (línea de puntos) que muestra Anamorsin que contiene un solo grupo 2Fe-2S.
Discusión
En este estudio, se Anamorsin identificado como el primer 2Fe-2S proteína aceptora agrupación humana, tanto para el mNT relacionada con el cáncer y las proteínas OMM NAF-1. Recientemente, Ferecatu
et al
. [37] determinó que el TMN adquiere sus racimos 2Fe-2S del sistema ISC mitocondrial. Nuestros resultados muestran que una vez obtenido, el TMN (y NAF-1) puede transferir sus racimos 2Fe-2S a Anamorsin proporcionando de este modo una vía bien definida desde el ISC a la CIA a través de la membrana externa atado MNT (figura 7).
mNT en la OMM y la NAF-1 en el MAM reciben grupos 2Fe-2S producidos dentro de la mitocondria por el sistema ISC. Tanto MNT y la NAF-1 de transferencia de estos 2Fe-2S racimos a Anamorsin. Anamorsin recibe electrones de la reductasa diflavin NDOR1 y los suministra al sistema de la CIA como un primer paso necesario para la producción de racimos 4Fe-4S. Este paso requiere la forma holo de Anamorsin. Tanto MNT y la NAF-1 pueden proporcionar rutas paralelas que unen la CIA al ISC. CIA produjo racimos están dirigidos a las proteínas en el citoplasma y el núcleo y son importantes para el metabolismo celular, el mantenimiento y la proliferación.
Anamorsin, que es un componente esencial de la CIA, alberga dos clúster Fe-S -sitios de unión y se encontró que el TMN o NAF-1 pueden transferir 2Fe-2S grupos a ambos sitios de unión de racimo. Las proteínas NEET pueden suministrar todos los grupos necesarios para la activación de Anamorsin por su función de transferencia de electrones. Esto vincula ahora la necesidad de ensamblaje mitocondrial clúster Fe-S con la función de la CIA citosólico [37, 38].
La ubicación del NEET en el OMM /MAM y sus similitudes función de transferencia de clústeres para ISCU sugieren que puede ser parte de una vía que une montaje 2Fe-2S mitocondrial al sistema de CIA. Mientras Ferecatu
et al
. demostrado que desmontables de MNT no tuvo un impacto significativo en la maduración de la CIA que dependen de las proteínas Fe-S [37], se muestra que la NAF-1 es más eficiente en la transferencia de Apo-Anamorsin y puede ser una ruta paralela a la CIA .
las propiedades de las proteínas NEET sugieren que, además de transporte 2Fe-2S mitocondrial, funcionan como depósitos que permiten 2Fe-2S racimos para ser montados en condiciones favorables dentro de la mitocondria y se almacenan disponibilidad más rápida cuando citosólica 2Fe se necesitan grupos -2S. Esto permite una respuesta más rápida a las necesidades inmediatas de lo que sería posible si el montaje mitocondrial y el transporte a través de dos membranas a las proteínas citosólicas. En apoyo de esta función, MNT se ha descubierto recientemente para volver a montar /reparar el clúster 4Fe-4S de hierro citosólico proteína reguladora 1 (IRP1; aconitasa citosólica) después del daño oxidativo [37]. Así, los NEETs pueden funcionar en el transporte de 2Fe-2S grupos fuera de la mitocondria, así como un depósito de grupos fácilmente disponibles 2Fe-2S.
NAF-1, y mnt Anamorsin cada uno se han implicado en el cáncer [15 , 39-41]. Ambas proteínas NEET son sobre-expresado en células de cáncer de mama epiteliales, y la disminución de su expresión a través de shRNA caídas resultados en disminución de la proliferación de células de cáncer y la disminución de crecimiento del tumor. Como las proteínas Fe-S son esenciales para la replicación del ADN y el crecimiento celular, la necesidad de suministro rápido de Fe-S racimos une convenientemente las proteínas NEET a la proliferación de células de cáncer. Además, se requiere que el homólogo de la levadura Anamorsin (Dre2) para el montaje del cofactor radical diférrica-tirosil de la ribonucleótido reductasa [42], que es necesaria para la producción de desoxinucleótidos. Una disponibilidad limitada de desoxinucleótidos también inhibir la replicación del ADN y así la proliferación de células de cáncer. Orientación de las proteínas NEET puede ser un medio conveniente para controlar muchos de los procesos que son necesarios para la proliferación acelerada de las células cancerosas con la posibilidad de modular usando pequeña molécula dirigida a diana de las proteínas NEET [43].
En este estudio, proporcionamos un enlace bien definido entre el CAI y los sistemas de la CIA a través de mNT y la NAF-1, que son las únicas proteínas conocidas 2Fe-2S asociados con la OMM. Se demuestra que las proteínas NEET pueden transferir tanto de sus racimos 2Fe-2S través de una interacción directa proteína-proteína para activar la proteína esencial de la CIA, Anamorsin.
Apoyo a la Información
S1 Fig.