Extracto
Antecedentes
Las perturbaciones en las moléculas de adhesión celular están relacionados con alteraciones en los complejos de cadherina-catenina y probablemente juegan un papel importante en la invasión y la metástasis; permanece aún desconocido su impacto en las etapas tempranas precancerosas. Hemos demostrado la sobreexpresión ALCAM en las lesiones orales tempranas y su acumulación citoplasmática en el carcinoma oral de células escamosas (COCE) para ser un predictor de la progresión de la enfermedad y de mal pronóstico. Este estudio probó la hipótesis de que las alteraciones en la E-cadherina y β-catenina expresiones son eventos tempranos en la tumorigénesis orales, relacionados con el pronóstico de la enfermedad, y se correlacionan con las perturbaciones en la expresión de ALCAM.
Métodos
Expresiones de e-cadherina y β-catenina se analizaron en la misma cohorte de 105 OSCCs, 76 lesiones orales y 30 tejidos orales normales mediante técnicas de inmunohistoquímica y se correlacionó con parámetros clínico y el pronóstico. El efecto de siRNA desmontables ALCAM mediada por E-cadherina y β-catenina se determinó mediante Western blot, microscopía confocal y análisis de RT-PCR en células de cáncer oral.
Resultados
La pérdida significativa de membranosa la expresión de e-cadherina y β-catenina se observó a partir de lo normal, hiperplasia, displasia de OSCCs (p
Trend & lt; 0,001); y correlacionada con la acumulación citoplasmática ALCAM en OSCCs (p = 0,006). El análisis multivariado reveló la pérdida de membrana de β-catenina y ALCAM /β-catenina
/acumulación citoplásmica nuclear para ser predictores significativos de la etapa clínica tardía (p & lt; 0,001, OR = 8,7; p = 0,006, OR = 9,9, respectivamente) y ganglionar metástasis (p = 0,003, OR = 3,8; p = 0,025, OR = 3,4, respectivamente). de regresión de Cox mostró pérdida de E-cadherina membrana /ALCAM expresión citoplásmica [p & lt; 0,001; HR = 4,8] para ser pronosticadores independientes adversos en OSCCs. siRNA mediada por silenciamiento de ALCAM resultó en aumento simultáneo de E-cadherina y β-catenina, tanto en los niveles de transcripción y proteínas.
Conclusiones
Las pérdidas de E-cadherina y β-catenina expresiones son principios eventos en la tumorigénesis oral; sus asociaciones con el comportamiento agresivo del tumor y la recurrencia de la enfermedad subrayan su potencial como marcadores de pronóstico. La correlación de la pérdida de E-cadherina y β-catenina con la acumulación citoplasmática ALCAM tanto
in vitro Opiniones y en
in vivo
sugiere que estos cambios dinámicos en el sistema de adhesión celular pueden desempeñar un papel fundamental en el cáncer oral .
Visto: Kaur J, M Sawhney, Dattagupta S, Shukla NK, Srivastava A, Walfish PG, et al. (2013) Importancia clínica de alteraciones en la expresión de β-catenina y E-cadherina en la displasia y el cáncer oral: posible relación con la expresión ALCAM. PLoS ONE 8 (6): e67361. doi: 10.1371 /journal.pone.0067361
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: noviembre 30, 2012; Aceptado: 16-may de 2013; Publicado: 28 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Kaur et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiera apoyo de esta labor desde el monte Fundación Sinaí de Toronto Da Vinci Gala para recaudar fondos, Alex y Simona Presidente Shnaider en cáncer de tiroides, Institutos canadienses de Investigación en Salud para el Presidente en el cáncer avanzado de diagnóstico, George Knudson Oakdale Golf Fondo Torneo Raiser, y el Departamento del hospital Mount Sinai Fondo de Investigación de Medicina se agradece. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores declaran que no existen intereses en competencia
Introducción
Las perturbaciones en la modulación orquestada de defectos causar la adhesión celular en la arquitectura del tejido que juegan un papel crítico en el desarrollo del cáncer [1] - [3]. E-cadherina está localizada en la superficie de las células epiteliales en las regiones de contacto célula-célula conocidas como uniones adherentes y está implicada en la adhesión célula-célula en tejidos epiteliales [4] - [6]. β-catenina interactúa con cadherinas a través de su dominio citoplásmico. α-catenina une la E-cadherina y β-catenina complejo de filamentos de actina. La disociación del complejo de E-cadherina-catenina de membrana celular es importante en la progresión maligna. En muchos cánceres epiteliales, membranosa E-cadherina se pierde y β-catenina se disocia en el citoplasma y se acumula en el núcleo como un factor de transcripción, de forma concomitante con la progresión del tumor [5]. Baja regulación de membranosa E-cadherina y β-catenina, y la acumulación citoplásmica /nuclear de β-catenina se han reportado previamente en varios tipos de cáncer y mantener la promesa como marcadores de pronóstico [7].
El desarrollo de escamosas el carcinoma de células (CCCA) es un proceso de múltiples etapas que implica interacciones entre varios factores, tales como los carcinógenos del tabaco asociada intra-oral, nuez de areca, betel y el consumo de alcohol y /o infecciones virales [8], [9]. OSCCs a menudo son precedidos por lesiones clínicamente evidentes menudo leucoplasia, y el riesgo de cáncer múltiple es 5-10 veces mayor en los pacientes con OSCCs precedidos por la leucoplasia [8], [10]. Estas lesiones a menudo se conviertan en cáncer si no se trata [11]. Una tasa de transformación anual promedio de 1% ha sido propuesta en base a varios estudios que informan de un 5% la transformación observada en los 5 años [11], [12]. En la India, más del 80% de OSCCs surgen de las lesiones orales existentes (MCO) [13], [14]. La capacidad para predecir el resultado de OLS sigue siendo un reto importante para la intervención temprana. La detección temprana de OLS que va a desarrollar en tumores invasivos es necesario mejorar el mal pronóstico de los pacientes con cáncer oral.
Los cambios dinámicos en la adhesión celular que se manifiestan por la disociación del complejo membranosa E-cadherina-β-catenina están implicados en la pérdida de de la cohesión epitelial como un acontecimiento importante en la invasión y metástasis. Activado leucocitos molécula de adhesión celular (ALCAM) /MEMD /CD166) es una glucoproteína transmembrana de la superfamilia de inmunoglobulina que media la adhesión célula-célula a través de ambos homophilic (ALCAM-ALCAM) y heterófilos (ALCAM-CD6) interacciones [15], [16]. expresión de ALCAM Demostramos se incrementa en MCO y su acumulación citoplasmática en CCCA es un predictor de la progresión de la enfermedad y el mal pronóstico [17]. Aquí, hemos tratado de investigar el significado clínico de E-cadherina y β-catenina expresión en secciones de tejido de serie de la misma serie de pacientes de diferentes estadios de la enfermedad mediante técnicas de inmunohistoquímica, para identificar alteraciones en proteínas específicos de la etapa y se determinó su relación con la expresión de ALCAM. Las evidencias experimentales en apoyo de las correlaciones entre las perturbaciones en la expresión de ALCAM y alteraciones en la E-cadherina y β-catenina expresiones fueron proporcionados por interferencia corta de ARN (siRNA) mediada desmontables ALCAM y determinar el cambio en la expresión de estas tres proteínas, tanto en la transcripción y los niveles de proteína.
Materiales y Métodos
muestras de tejido
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humanos de todos India Institute of Medical Sciences, Nueva Delhi, India. Para el análisis inmunohistoquímico resecado quirúrgicamente los tejidos o muestras de biopsia de COCE, displasia, hiperplasia y tejidos orales histológicamente normales se obtuvieron de la Unidad de Oncología Quirúrgica del Dr. B. R. Hospital de Ambedkar Instituto Rotary Cáncer, Instituto de Ciencias Médicas de la India, Nueva Delhi, India, con previo consentimiento informado por escrito de los pacientes.
Características clinicopatológicas de los pacientes
Ciento cinco pacientes CCCA primarias (rango de edad, 29-75 años, edad media 40 años) sometidos a cirugía curativa cáncer oral, en la Unidad de Oncología quirúrgica del Dr. BR Cancer Hospital Ambedkar Instituto Rotary, Instituto de Ciencias Médicas de la India, Nueva Delhi, India se inscribieron en este estudio después de obtener el consentimiento previo por escrito de los pacientes. Los datos clínicos y patológicos incluyendo la clasificación clínica TNM (tumor, nódulo, metástasis basado en Unión Internacional Center le Cancer clasificación TNM), el sitio de la lesión, diferenciación histopatológica, la edad y el género se registraron en un previamente pre-diseñado Performa como se describe [ ,,,0],17]. El diagnóstico se basa en el examen clínico y el análisis histopatológico de las muestras de tejido. El sitio de distribución de los casos CCCA era: mucosa bucal (36), lengua (35), alvéolo (12), el labio (6) y otros sitios (16) que incluye surco ginigivobuccal, paladar duro, paladar blando, trígono retromolar y el piso de la boca. Los tumores fueron clasificados histológicamente SCC así, moderadamente diferenciados o mal. Las biopsias de OLs con evidencia histológica de la hiperplasia (56 casos) y la displasia (20 casos) también se incluyeron en este estudio. La distribución sitio de OLs fue: mucosa bucal (53), la lengua (12), alvéolo (5), el labio (4) y el surco ginigivobuccal (2). Treinta tejidos no malignos tomadas de un sitio distante de OSCCs (con diagnóstico histológico de epitelio oral normal aquí a que se refiere a los tejidos normales como orales) también fueron evaluados para la expresión ALCAM. Después de la escisión, los tejidos inmediatamente se congelaron en N líquido
2 y se almacenaron a -80 ° C hasta su utilización posterior y una pieza se recogió en 10% de formalina y embebidos en parafina para análisis histopatológicos e inmunohistoquímicos.
la inmunohistoquímica
embebidos en parafina secciones (5 micras de espesor) de muestras de tejidos orales humanas se tiñeron con hematoxilina y eosina para el análisis histopatológico, y la inmunotinción se realizó en secciones en serie como se ha descrito anteriormente por Sawhney
et al
. [17]. Brevemente, las secciones de tejido después de la recuperación de antígenos en tampón de citrato se incubaron con anticuerpos anti-E-cadherina o anti-β-catenina (0,2 g /ml) (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santacruz, CA) durante 16 horas a 4 ° C. Los anticuerpos se detectaron usando anticuerpo secundario biotinilado y peroxidasa de estreptavidina marcada complejo usando Dako LSAB plus kit (Laboratorios Dako, Glostrup, Dinamarca) utilizando diaminobencidina (DAB) como cromógeno. En los controles negativos, el anticuerpo primario fue sustituido por IgG no inmune del mismo isotipo para asegurar la especificidad. secciones de tejido de cáncer de mama con immunopositivity conocida para la E-cadherina o β-catenina se utilizaron como controles positivos en cada lote de secciones analizadas.
Criterio positivo para la tinción inmunohistoquímica
La inmunotinción fue evaluada en forma aleatoria seleccionado cinco áreas no superpuestas de las secciones de tejido con las células epiteliales de más de 80%. Para E-cadherina, una tinción específica en la membrana se definió como una tinción positiva. Los portaobjetos se obtuvieron de la siguiente manera: las células tumorales ≥50% que muestran inmunoreactividad se calificaron como positivos para la expresión de E-cadherina, mientras que los que muestran la inmunotinción en & lt; 50% las células tumorales fueron clasificados como negativos [18]. Para expresión de la proteína β-catenina, tinción específica en la membrana /citoplasma /núcleos se definió como la tinción positiva. Para la tinción de la membrana de las diapositivas se puntuaron como sigue: las células tumorales que muestran inmunoreactividad ≥50% se clasificaron como positivos, mientras que los que muestran la inmunotinción en & lt; células tumorales 50% se clasificaron como negativos [18]. Para la tinción nuclear /citoplasmática de ß-catenina Los portaobjetos se obtuvo como sigue: 0, & lt; 10% las células tumorales que muestran inmunorreactividad; 1 = 10 a 30% de células tumorales que muestran inmunorreactividad; 2, ≥31-50 células tumorales que muestran inmunoreactividad%; 3, & gt; 50% de células tumorales que muestran inmunoreactividad. La inmunohistoquímica investigación era ciego, es decir, los portaobjetos fueron codificados y el patólogo no tenían conocimiento previo de la carga tumoral local, difusión linfonodular y la clasificación de los OSCCs y anotó la inmunorreactividad.
Estudio de Seguimiento
Setenta y dos de los 105 pacientes que se sometieron a CCCA, el tratamiento de la CCCA primaria en el período 2002-2005, se pudo seguir regularmente en la clínica de seguimiento, mientras que 33 pacientes se perdieron durante el seguimiento. estado de supervivencia de los pacientes fue verificada y actualizada regularmente de los registros del Registro de Tumores del Hospital, Instituto del Cáncer de Rotary, a partir de diciembre de 2010. De acuerdo con el protocolo, los pacientes con COCE T
1 y T
2 tumores fueron tratados con radioterapia radical o cirugía sola, mientras que la mayoría de los pacientes con T
3 y T enfermedad
4 fueron tratados con una combinación de cirugía radical seguida de radioterapia radical postoperatorio como se describe [19]. Los pacientes fueron seguidos periódicamente y se registró el tiempo hasta la recurrencia. Si un paciente murió durante el seguimiento, el tiempo de supervivencia de los pacientes fue censurado en el momento de la muerte. Historial médico, examen clínico, radiológico y la evaluación se utilizaron para determinar si la muerte se debió a cáncer recurrente (recidivante pacientes) o por cualquier otra causa. sobrevivientes libres de enfermedad se definieron como pacientes libres de evidencia clínica y radiológica de recidiva local, regional o distante en el momento de la última visita de seguimiento. Loco-regional recaída /muerte se observó en 32/72 (44%) pacientes monitorizados en este estudio. Los pacientes que no mostraron recurrencia estaban vivos hasta el final del periodo de seguimiento. Entre los 33 pacientes que se perdieron durante el seguimiento, el número de muertes no se pudo determinar; por lo tanto, la supervivencia global no se podía considerar como un parámetro independiente en nuestro estudio. Sólo se estudió la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes. supervivencia libre de enfermedad se expresa como el número de meses desde la fecha de la cirugía a la recidiva locorregional. Los pacientes fueron controlados durante un periodo de mediana de 24 meses y un máximo de 91 meses.
Análisis estadístico
Los datos inmunohistoquímicos fueron sometidos a un análisis estadístico utilizando el software 17.0 (Chicago IL) SPSS. Las relaciones entre la E-cadherina, β-catenina y expresión ALCAM y parámetros clínico se puso a prueba en el análisis univariado mediante la prueba de chi-cuadrado, prueba de chi-cuadrado para la tendencia, de la prueba exacta y el análisis de regresión logística Fisher. Para determinar predictores independientes de la tumorigénesis, análisis de regresión logística se llevó a cabo de una manera paso a paso para las variables individuales, parámetros clinicopatholgical y las proteínas E-cadherina, β-catenina y ALCAM. Diferentes combinaciones de variables se generaron para evaluar la asociación entre estas combinaciones y pronóstico del paciente. Los estudios de seguimiento se analizaron por Kaplan-Meier y la prueba de riesgos proporcionales de Cox. la supervivencia libre de enfermedad solamente se evaluó en el presente estudio, ya que el número de muertes debido a la progresión de la enfermedad no permitió un análisis estadístico fiable. La asociación entre el resultado y variables de los pacientes se evaluó mediante la prueba de log-rank. Dos valores de p se calcularon lados y p. & Lt; 0,05 se consideraron significativos
ARN corto de interferencia mediada por derribo ALCAM
Pista humana y la línea celular de carcinoma escamoso del cuello, se mantuvieron las células SCC-4 en DMEM que contenía 10% de FBS, 100 g /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina a 37 ° C en atmósfera humidificada de 5% de CO
2. SCC-4 células fueron transfectadas transitoriamente utilizando el reactivo Hiperfect (Qiagen) y un dúplex de extremos romos de los oligonucleótidos de ARN, 5'-AAG CCC GAU GGC UCC CCA GUA UU-3 'y 5'-AAU ACU GGG GAG CCA GGC UCG UU -3 '. SCC-4 células fueron tratadas con concentraciones variables de siRNA (1-15 nM) y con concentraciones variables de reactivo Hiperfect (1-4,5 l). ALCAM siRNA (15 nM) con 4,5 l de reactivo Hiperfect durante 48 h se encontró que era la mejor concentración con máxima eficiencia de transfección (95%) y el silenciamiento de la expresión génica máxima ALCAM (datos no mostrados). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se utilizaron células tratadas con ARNsi en experimentos posteriores.
transcripción inversa-PCR Análisis
ARN total fue aislado de las células SCC-4 (control y transfectantes siRNA) como se describió anteriormente [20]. La amplificación por PCR se llevó a cabo en un volumen total de 20 l que contenía 3 l de tampón a transcripción inversa de ADNc, 10X PCR, mM dNTPs 10, 20 M de cada cebador y 1 unidad de Taq polimerasa, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Después de 5 minutos de desnaturalización inicial, 35 ciclos de amplificación de 1 minuto a 94 ° C, 2 minutos a temperatura de recocido específico y 1 minuto a 72 ° C se llevaron a cabo, seguido por un alargamiento de 10 minutos a 72 ° C. Para la amplificación de cDNA ALCAM cebador directo, 5'-GTC TGG GCA ATA GTG ACT CC-3 'y el cebador inverso 5'-AAC CAT TGC AAG TGG AAA CC-3' se utilizaron. Para E-cadherina ADNc, cebador directo 5'-CAG CAC CAC GTA CCT AGC AA-3 'y el cebador inverso 5'-GGC ACC TGA TTT GGA TTC CT-3' se utilizaron. se utilizaron para la β-catenina ADNc, cebador directo 5'-GAA TTC ACG TCG AGT TGA GC-3 'y el cebador inverso 5'-CTG GCC ATA TCC ACC AGA GT-3'. β-actina se utilizó como control interno para asegurar que la misma cantidad de RNA se utilizó en el control y las células transfectadas siRNA. Para ADNc β-actina, cebador directo 5'-CCA CAG TGT ACG CTA TTG TCC AG-3 'y el cebador inverso 5'-GTT TCG TGG ATG CAG CCA GAC 3' se utilizaron. Los productos de PCR se separaron en gel de agarosa al 1,5%, se tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron con AlphaEase FC software (versión 3.1.1) Las intensidades de las bandas de PCR se cuantificó con Chemi Imager IS-4400 (Alpha Innotech Corp, CA) como se describió anteriormente [14].
Immunoblotting
se utilizaron ALCAM siRNA transfectadas SCC-4 células para 48 h y las células de control sin tratar para la preparación de extractos celulares mediante ebullición del sedimento celular en tampón de SDS-lisis. Brevemente, el extracto de células enteras (100 g de proteína /carril) se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa [21]. Las membranas de nitrocelulosa se bloquearon con leche no grasa al 10% durante la noche a 4 ° C y se sondaron con anti-ALCAM; anticuerpos E-cadherina y β-catenina (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santacruz, CA) durante 2 horas a 37 ° C. A continuación, las membranas se probaron con anticuerpos secundarios a estas proteínas (anti-cabra 1:5000 y dilución anti-ratón 1:2000). Las transferencias se volvieron a sondar con α-tubulina para normalizar la carga igual de proteínas. Las transferencias fueron desarrolladas utilizando el reactivo de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) como se describe [21].
Microscopía Confocal Laser
células SCC-4 cultivadas en cubreobjetos fueron tratados con ALCAM siRNA durante 48 h y se procesaron para microscopía láser confocal como se describe anteriormente [21]. Las células se enjuagaron en PBS de Dulbecco (DPBS), se fijaron en metanol durante 5 min. a -20 ° C y se incubaron con anti-ALCAM, E-cadherina y anticuerpos β-catenina (10 ng /ml) obtenida de SantaCruz Biotecnologías Inc., Santacruz, CA. Después de enjuagar en DPBS, los cubreobjetos se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado (anti-conejo /cabra, LSAB + Kit, DAKO Cytomations, Glostrup, Dinamarca) durante 45 min. a 37 ° C seguido de incubación con fluorocromo conjugada con estreptavidina, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (DAKO Cytomations, Dinamarca). A partir de entonces, los cubreobjetos se contratiñeron con yoduro de propidio (PI) (10 mg /ml; Sigma-Aldrich, MO) durante 30 seg. Los cubreobjetos se enjuagaron entonces y se montaron en medio de montaje. Las láminas fueron examinados con microscopio confocal de barrido láser como se describe anteriormente [21].
Resultados
Análisis inmunohistoquímico de la expresión membranosa E-cadherina en los tejidos normales oral, hiperplasia, displasia y COCE
E-cadherina en la membrana de las células epiteliales se observó en 27/30 (90%) de los tejidos orales histológicamente normal con la expresión citoplasmática de vez en cuando (Tabla 1, Figura 1A). se observó una pérdida significativa de E-cadherina expresión membranosa en la hiperplasia [19/56, 34% (Figura 1B) en comparación con los tejidos orales normales (3/30, 10%), [p = 0,015; OR = 4,6, 95% C.I. = 1,2-17,2] y en 12/20, 60% displasia (Figura 1C) [H /D: p = 0,06; OR = 2,9, 95% C.I. = 1,0-8,4]. análisis de tendencias de chi-cuadrado mostró una pérdida significativa de la E-cadherina expresión membranosa en los tejidos de diferentes etapas de desarrollo de cáncer oral (normal, hiperplasia, displasia y cáncer invasivo; p
Trend & lt; 0,001). No se observó pérdida de E-cadherina expresión membranosa en 61/105 (58%) OSCCs (Tabla 1, Figura 1 D) y se asoció con el estadio clínico tarde (p = 0,006 IC, OR = 3,1, 95% = 1,3-7,0), aumento de la carga tumoral (p = 0,03; OR = 2,4, IC del 95% = 1.1 a 5.3), y la metástasis ganglionar (p = 0,04; OR = 2,4, IC del 95% = 1.1 a 5.3)
histológicamente normales. secciones de tejido que muestran inmunoreactividad membranosa de e-cadherina (a), y las proteínas β-catenina (G). Hiperplásico (B), displásicos (C), las secciones de tejido COCE (d) Pérdida de tinción membranosa que representan para la E-cadherina. Hiperplásico (H), displásicos (I), las secciones de tejido COCE (J) la pérdida de la tinción membranosa de β-catenina que representan. En los controles negativos, para la E-cadherina (E) y β-catenina (F), el anticuerpo primario fue sustituido por IgG no inmune del mismo isotipo para asegurar la especificidad. secciones de tejido de cáncer de mama usadas como control positivo mostró tinción de membrana para la E-cadherina (K) y β-catenina (L) proteínas. Magnificación original X 200.
Asociación de la pérdida de expresión de E-cadherina membranosa con enfermedad resultados
Setenta y dos pacientes CCCA podrían ser objeto de seguimiento durante un periodo máximo de 91 meses (mediana de 24 meses). Kaplan-Meier análisis de supervivencia y modelo de riesgos proporcionales de Cox reveló que los pacientes con tumores positivos para E-cadherina habían aumentado la supervivencia media libre de enfermedad (DFS) de 74 meses, en comparación con aquellos con pérdida de immunopositivity membranosa (mediana DFS = 18 meses) [p = 0,001; HR = 3,9; IC del 95% = 1.6 a 9.6] (Figura 2A)
A: pérdida de membranosa E-cadherina (E-cad
-) expresión, B:. La pérdida de membranosa β-catenina (β-CATM
-) expresión, C: pérdida de e-cadherina y membranosa β-catenina (e-cad
- /β-cat M
- expresión), D: pérdida de la membrana positiva y e-cadherina citoplasmática ALCAM (e-cad
- /ALCAM C
+).
Análisis inmunohistoquímico de la expresión β-catenina en los tejidos orales normales, hiperplasia, displasia y COCE
β catenina fue principalmente presente en la membrana de las células epiteliales en 27/30 (90%) de los tejidos orales histológicamente normales; de vez en cuando también se observó tinción citoplásmica /nuclear (Tabla 1, Figura 1G). se observó pérdida significativa de la expresión de membrana β-catenina en la hiperplasia [20/56, 36%, p = 0,01; OR = 5,0, 95% C.I. = 1,3 a 18,6, (Figura 1H)] en comparación con los tejidos orales normales (3/30, 10%), y en la displasia en comparación con la hiperplasia [14/20, 70%, (Figura 1I), p = 0,008; OR = 4,2, 95% C.I. = 01/04 hasta 12/06]. Se observó un aumento significativo en la acumulación citoplásmica /nuclear de β-catenina en la displasia en comparación con la hiperplasia (p = 0,046; OR = 3,1; 95% C.I. = 1,0 a 9,5) (Tabla 1). análisis de tendencias de chi-cuadrado mostró una pérdida significativa de la expresión y el aumento de su acumulación citoplásmica /nuclear en los tejidos de diferentes etapas de cáncer oral (normal, hiperplasia, displasia y cáncer invasivo membranosa β-catenina, p
Trend & lt; 0,001 y p
tendencia = 0,003, respectivamente).
No se observó pérdida de expresión membranosa β-catenina en 65 de 105 (62%) OSCCs (Figura 1J, Tabla 1) y se asoció con el estadio clínico tarde (p = 0,001, OR = 7,4, IC del 95% = 3,1-18,1), el aumento de la carga tumoral (p = 0,001, OR = 4,1, IC del 95% = 1.8 a 9.4) y la metástasis ganglionar (p = 0,003, OR = 3,7, 95% CI = 1/6 a 8/9). En OSCCs 28 de 105 (27%) de los casos se detectó la acumulación citoplásmica /nuclear de β-catenina y se asoció con la última etapa clínica (p = 0,014, OR = 3,6, IC del 95% = 01/02 a 10/06) y la carga tumoral (p = 0,025 , OR = 2,8, IC del 95% = 1.1 a 7.2).
Asociación de Pérdida de membranosa expresión β-catenina con el resultado de la enfermedad
la pérdida de membranosa immunopositivity β-catenina se asocia con la enfermedad reducida supervivencia libre (mediana DFS = 15 meses) en comparación con los pacientes con tumores de membrana β-catenina positivos DFS (mediana = 78 meses) [p & lt; 0,001; HR = 7,8; 95% IC = 2,7-22,3] (Figura 2B).
Asociación entre E-cadherina y β-catenina en las lesiones orales y OSCCs
Se observó una asociación significativa entre la pérdida de E-cadherina membranosa y expresiones β-catenina en OLS (p = 0,001 IC, OR = 16,7, 95% = 5,3-52,7, Tabla 2) y OSCCs (p = 0,001, OR = 8,8, IC del 95% = 3,6-21,7, Tabla 2). La pérdida de membranosa E-cadherina y β-catenina cuando se toma como un fenotipo (E-cad
- /β-cat M
-) se correlacionó significativamente con el estadio tumoral avanzado (p = 0,004, OR = 3,2, 95% IC = 1.4 a 7.1), metástasis ganglionar (p = 0,005, OR = 3,1, IC del 95% = 1.4 a 6.9) y el estadio clínico tarde (p & lt; 0,001, OR = 5,5, IC del 95% = 2,2-13,4). análisis de tendencias de chi-cuadrado mostró una pérdida significativa de membranosa E-cadherina y β-catenina (E-cad
- /β-cat M
-) en diferentes etapas de la carcinogénesis oral (lo normal, hiperplasia, displasia y cáncer invasivo ; p
tendencia = 0,008). Por otra parte, la pérdida de E-cad
- /β-cat M
- immunopositivity se asoció significativamente con la enfermedad reducida supervivencia libre [mediana DFS = 14 meses, en comparación con ß-catenina tumores positivos y E-cadherina de membrana con supervivencia libre de enfermedad mediana de 71 meses. (p & lt; 0,001; HR = 4,7; IC del 95% = 2.1-10.1)] (Figura 2C) guía empresas
Asociación entre la e-cadherina, β-catenina y expresión ALCAM en lesiones orales
para explorar la importancia de ALCAM en el desarrollo biológico del cáncer invasivo y la metástasis, es importante para determinar su correlación con las perturbaciones en la expresión de los componentes de unión adherente. Las asociaciones entre las expresiones de proteínas de E-cadherina, β-catenina y ALCAM se determinaron también habían sido analizados en la misma cohorte de pacientes en un estudio anterior [17] (Tabla 2) como expresión de la proteína ALCAM. Se encontró pérdida de expresión de β-catenina membranosa que se asociaron significativamente con la global (p = 0,018, OR = 3,3, IC del 95% = 1.2 a 8.8, Tabla 2) y citoplasmática (p = 0,008, OR = 3,6, IC 95% = 1.4 a 9.3, Tabla 2) expresión de ALCAM.
Entre las hiperplasias analizadas (n = 56) en este estudio, se encontró que la pérdida de E-cadherina membranosa que se asociaron significativamente con la pérdida de la expresión de β-catenina (p & lt ; 0,001, OR = 24,0; IC del 95% = 5,6 a 102). Se encontró pérdida de expresión de β-catenina membranosa que se asociaron significativamente con la expresión de ALCAM global (p = 0,017, OR = 4,5, 95% C.I. = 1,2-16,0). La pérdida de la membrana de E-cadherina y β-catenina tomada en conjunto como un fenotipo (E-cad
- /β-CATM
-) correlacionó significativamente con immunopositivity general ALCAM en la hiperplasia. Entre las displasias analizadas (n = 20), se encontró que la pérdida de expresión membranosa β-catenina que se asociaron significativamente con ALCAM immunopositivity citoplasmática (p = 0,05; OR = 9,0, IC del 95% = 1,0 a 100)
Asociación entre la e-cadherina, β-catenina y expresión ALCAM en COCE
Las asociaciones entre ALCAM, e-cadherina y expresiones β-catenina se determinaron en COCE (Tabla 2). Se encontró pérdida de E-cadherina expresión membranosa que se asociaron significativamente con la expresión citoplasmática ALCAM (p = 0,038, OR = 2,2, 95% C.I. = 1,0-5,0). La pérdida de la expresión en la membrana β-catenina se correlacionó significativamente con la expresión de ALCAM global (p = 0,001, OR = 3,9, IC 95% = 1,7-9,0), y immunopositivity ALCAM citoplasmática (p = 0,002, OR = 3,7, IC del 95% = 1.6- 8.7). La pérdida de la membrana de E-cadherina y β-catenina cuando se toma como un fenotipo (E-cad
- /β-cat M
-). Correlacionó significativamente con immunopositivity general y citoplasmática ALCAM en COCE (Tabla 2)
predictores independientes de transición de normal a ol y canceroso Fenotipo
para determinar los predictores independientes para la transición de normal a OL, el análisis de regresión logística se llevó a cabo de una manera escalonada. De estas variables, los parámetros que surgieron significativas en el análisis univariante y multivariante se resumen en la Tabla 3. ALCAM citoplasmática expresión (p = 0,024, OR = 11,6; IC del 95% = 1,4-98,2) surgió para ser el fenotipo más significativo para la transición de mucosa oral normal de OL. La pérdida de expresión β-catenina membranosa emergió como el predictor más significativo para la transición de hiperplasia a lesiones displásicas (p = 0,01, OR = 4,2, 95% C.I. = 01/03 a 12/06). Los análisis de regresión logística multivariante reveló que la pérdida de expresión de E-cadherina membranosa es el fenotipo más significativo para la transición de OL de COCE (p = 0,02; OR = 2,0; IC del 95% = 1.1 a 3.7) guía empresas
el resultado clínico de los pacientes
los predictores independientes de los parámetros clínicos, la carga tumoral, afectación ganglionar y la etapa clínica de la CCCA.
para determinar los predictores independientes de los parámetros clínicos, la carga tumoral, afectación ganglionar y clínica etapa, análisis de regresión logística se llevó a cabo de una manera escalonada para e-cadherina, β-catenina y ALCAM individualmente, o en combinación, en 105 OSCCs (Tabla 3). pérdida de membrana de β-catenina (p = 0,001, OR = 4,2; IC del 95% = 01.08 a 10.02) y β-catenina nuclear /citoplasmática acumulación (p = 0,027, OR = 3,1; IC del 95% = 1.1 a 8.3) fueron los más predictores significativos para una mayor carga tumoral. pérdida de membrana de β-catenina (p = 0,003, OR = 3,8; IC del 95% = 1.6 a 9.3) y la expresión de ALCAM /β-catenina nuclear /citoplasmática acumulación global (p = 0,025, OR = 3,4, IC del 95% = 1.2 a 9.7 ) fueron los predictores más importantes para la metástasis ganglionar. marcadores combinados, la expresión de ALCAM /β-catenina nuclear /acumulación citoplasmática (p = 0,006, OR = 9,9, IC del 95% = 1,9-51,5) y la pérdida de la membrana β-catenina (p & lt; 0,001, OR = 8,7; IC del 95% = 3,3 -22.8) fueron los predictores más importantes para la etapa clínica tardía (Tabla 3).
Asociación de alteraciones en la e-cadherina, β-catenina y expresión ALCAM con el resultado de la enfermedad.
asociación significativa observado entre la enfermedad reducida libre de la supervivencia y el estadio del tumor [p = 0,03; Hazard Ratio (HR) = 2,5; 95% C.I. = 1.1 a 5.6].
Para posibles capacidad pronóstica aditivo análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y el modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizaron para analizar diferentes combinaciones de biomarcadores potenciales con el fin de evaluar la asociación de alteraciones en diversos biomarcadores con el resultado clínico . Aunque se encontraron varias combinaciones para ser significativa (Tabla 3), el fenotipo más significativo que surgió como pronosticador adverso fue: aumento de la expresión citoplásmica ALCAM + pérdida de membranosa E-cadherina; ALCAM C
+ /E-cad
- (p & lt; 0,001; HR = 4,8; IC del 95% = 2.2 a 9.9, Figura 2D). (Tabla 3)
En base a los datos,