Extracto
Aplicaciones
Para investigar el uso de liposomas irinotecán (Irinophore C ™ ) más o menos 5-fluorouracilo (5-FU) para el tratamiento de cáncer colorrectal.
Diseño Experimental
el efecto de irinotecan (IRI) y /o 5-FU tiempos de exposición sobre la citotoxicidad se evaluó
in vitro
contra células de carcinoma de colon humano LS174T HT-29 o. La farmacocinética y la biodistribución de Irinophore C ™ (IRC ™) y 5-FU, administrado solo o en combinación, se compararon
in vivo
. Un modelo subcutáneo de cáncer colorrectal humano HT-29 en ratones Rag2-M se utilizó para evaluar la eficacia de IRC ™ solo, y en combinación con 5-FU.
Resultados
La citotoxicidad de IRI y 5-FU dependían en gran medida de tiempo de exposición. se observaron interacciones sinérgicas después de la exposición prolongada a combinaciones IRI /5-FU. Farmacocinética /estudios de biodistribución demostraron que la tasa de eliminación de 5-FU se redujo significativamente cuando el 5-FU se administró por vía intravenosa con IRC ™, frente solo. Una disminución significativa en la eliminación 5-FU también se observaron en el plasma, con un aumento asociado de 5-FU en algunos tejidos cuando 5-FU se administró mediante inyección intraperitoneal y el IRC ™ se administra por vía intravenosa. La eliminación de IRC ™ no fue significativamente diferente cuando se administra solo o en combinación con 5-FU. estudios terapéuticos demostraron que un solo agente IRC ™ fue significativamente más eficaz que la combinación de IRI /5-FU; sorprendentemente, las combinaciones de IRC ™ /5-FU no eran más eficaces que los IRC ™ solo. La administración de combinaciones de 5-FU (16 mg /kg) e IRC ™ (60 mg IRI /kg) mostró un aumento de la toxicidad en comparación con IRC ™ solo. El tratamiento con IRC ™ solo (60 mg IRI /kg) retrasa el tiempo requerido para un aumento de 5 veces en el volumen inicial del tumor al día 49, en comparación con días 23 para los controles. Cuando se utilizó IRC ™ (40 mg IRI /kg) en combinación con 5-FU (16 mg /kg), el tiempo para aumentar el volumen de tumor de 5 veces fue de 43 días, que era comparable a la conseguida cuando se usa IRC ™ solo ( 40 mg IRI /kg).
Conclusiones
Un único agente IRC ™ fue bien tolerado y tiene un potencial terapéutico significativo. IRC ™ puede ser un sustituto adecuado para el tratamiento IRI, pero su uso con conexión 5-FU se complica por IRC ™ -engendered cambios en la farmacocinética de 5-FU /biodistribución que están asociadas con un aumento de la toxicidad cuando se utiliza la combinación.
Visto: Hare JI, Neijzen RW, Anantha M, Dos Santos N, N Harasym, Webb MS, et al. (2013) Tratamiento de cáncer colorrectal utilizando una combinación de Liposomal Irinotecan (Irinophore C ™) y 5-fluorouracilo. PLoS ONE 8 (4): e62349. doi: 10.1371 /journal.pone.0062349
Editor: Dimitris Fatouros, Universidad Aristóteles de Tesalónica, Grecia
Recibido: 23 Marzo, 2012; Aceptado: March 22, 2013; Publicado: 23 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Hare et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos canadienses de Investigación en Salud (financiación Número de Referencia 82583) y fondos de contrapartida de la Fox Instituto de Investigación Terry (ID Proyecto 2008-010). Los fondos para esta investigación también fue proporcionado por Pfizer /Centro de Investigación Drogas y el Fondo de Innovación para el Desarrollo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1], [2], [3]; en los Estados Unidos, el CRC es la tercera causa más común de muerte por cáncer y el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado, con cerca de 150.000 nuevos casos estimados a ser diagnosticados en 2013 [4], [5]. Las drogas de quimioterapia irinotecán (IRI) se utiliza en varios regímenes de tratamiento de primera línea CRC. Aunque en sí IRI está activo, plasma no específica, el hígado, gastrointestinal (GI), y carboxilesterasas tumorales [6], [7], [8] puede metabolizar IRI a SN-38, que es de 100 a 1000 veces más potente cuando se prueba utilizando
in vitro
ensayos [9], [10]. Gut carboxilesterasas (CE) generar altas concentraciones locales de SN-38 [11], [12]. Esta conversión puede estar asociada con actividad terapéutica, sin embargo, también ha sido relacionado con el daño intestinal que es responsable de gran parte de la toxicidad GI adverso de IRI [13], [14], [15]. Un inconveniente secundario al uso de IRI y SN-38 es la conversión dependiente del pH hidrolítica a partir de una forma lactona activa, a pH ácido, a una forma de carboxilato inactivo, a pH fisiológico, lo que limita la dosis de fármaco activo que alcanza el objetivo [16], [17], [18], [19]. Algunos de la conversión mediada por CE toxicidades adversas y de IRI se puede mejorar mediante el uso de sistemas de administración de fármacos [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Irinophore C ™ (IRC ™) es una formulación de IRI encapsulado en unilamelar, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DSPC) /liposomas de colesterol (100 nm de diámetro) que contiene un interior acuoso ácido de no tamponada CuSO
4. IRI está atrapado en el interior acuoso ácido de los liposomas cuando un gradiente de pH se genera en presencia del ionóforo A23187 de metal divalente, que se requiere para la estabilidad y el mantenimiento del gradiente de pH [21], [26]. La combinación del gradiente de pH generada por ionóforos, junto con la presencia de Cu encapsulado
2 +, da como resultado excelentes propiedades de retención de medicamentos para la formulación
in vivo
[26], [27], [28 ].
en estudios preclínicos, IRC ™ demostró que la actividad de IRI se puede aumentar de manera significativa en una amplia gama de modelos de tumores [21], [26], [29], [30], con una mejora perfil de seguridad en relación con el fármaco libre [21]. El aumento en el índice terapéutico para el IRC ™, en comparación con el IRI, se cree que es debido a varios factores: i) el mantenimiento de IRI en su forma lactona activa durante períodos prolongados de tiempo [21], [27], [30]; ii) una mayor entrega de IRI a los sitios de crecimiento del tumor [21]; iii) prolongada exposición sistémica a la forma lactona activa de SN-38 [21]; y iv) la existencia de una actividad anti-vascular que no se observa después de la administración en bolo de libre IRI [29], [31]. La hipótesis de que el impacto terapéutico de IRC ™ será más importante cuando se utiliza como parte de una combinación de fármacos - por ejemplo, en el régimen de quimioterapia FOLFIRI (leucovorina, 5-fluorouracilo (5-FU), y IRI), donde IRC ™ sería sustituido de forma gratuita IRI. Esta hipótesis se puso a prueba en un entorno preclínico aquí, donde se evaluaron combinaciones de IRC ™ /5-FU y el IRI /5-FU en un modelo murino de CRC. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que investiga el uso de formulaciones liposómicas de IRI, incluyendo IRC ™, en combinación con 5-FU para el tratamiento de CRC. Los resultados terapéuticos, sorprendentemente, demostraron que la eficacia de esta combinación no fue mejor que el conseguido con IRC ™ monoterapia. Además, en el modelo utilizado aquí, no hubo un aumento inesperado de la toxicidad de la combinación de fármacos, lo que requiere una reducción de la dosis de IRC ™ a un nivel que era mucho menos activo que una dosis mayor de IRC ™, pero podría administrarse de forma segura cuando se utiliza como agente único.
Materiales y Métodos
Materiales
DSPC y colesterol se obtuvieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, Estados Unidos). [
3H] colesterilo hexadecylether (CHE) se adquirió de PerkinElmer (Waltham, Massachusetts, Estados Unidos). [
14C] 5-FU fue adquirido de Moravek Bioquímicos (Brea, California, Estados Unidos). A23187 se adquirió de Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, CA). Saline, 5% de dextrosa en agua (D5W), irinotecan (Camptosar, Sandoz), y 5-FU (Alfa Aesar) se obtuvieron de la Agencia BC Cáncer (Vancouver, Columbia Británica, CA). El reactivo alamarBlue, suero bovino fetal (FBS), L-glutamina, y bicarbonato de sodio se adquirieron de Invitrogen (Burlington, Ontario, CA). medio esencial mínimo de Eagle (MEM) con solución salina equilibrada de Earle (BSS), medio 5A de McCoy, BSS de Hank (HBSS), no esenciales aminoácidos, piruvato de sodio, y la penicilina /estreptomicina se obtuvieron de StemCell Technologies (Vancouver, Columbia Británica, CALIFORNIA). Todos los demás productos químicos fueron de grado analítico.
Cell Cultura y
Las líneas celulares colorrectal LS174T humana y HT-29 se obtuvieron a partir de ATCC (Manassas, Virginia, Estados Unidos). células Stock líneas se mantuvieron en ausencia de la penicilina y la estreptomicina, y fueron seleccionados para la
Mycoplasma
antes de preparar una reserva de células que se congelan para su uso en experimentos. Las células se resuspendieron en medio de congelación (10% (vol /vol; v /v) en dimetilsulfóxido SFB) y se congelaron lentamente en Nalgene de 1 ° C contenedores de congelación (Rochester, Nueva York, EE.UU.) que contiene 100% de isopropanol a -80 ° C durante 24 h antes de su almacenamiento en nitrógeno líquido. Las células congeladas se descongelaron rápidamente a 37 ° C, se centrifuga para eliminar el medio de congelación, chapado y se pasaron dos veces antes de su uso en los experimentos. células LS174T se cultivaron en MEM de Eagle con BSS de Earle suplementado con 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 0,1 mM aminoácidos no esenciales, 1,5 g /bicarbonato de sodio L, 1% (v /v) de penicilina /estreptomicina, y 10% (v /v) de FBS, a 37 ° C en un 5% de CO
2 medio ambiente. células HT-29 fueron cultivadas en medio modificado de McCoy 5A suplementado con 1,5 mM de L-glutamina, 2,2 g /bicarbonato de sodio L, 1% (v /v) de penicilina /estreptomicina, y 10% (v /v) FBS, a 37 ° C en un 5% de CO
2 medio ambiente.
Ensayos de citotoxicidad
la viabilidad de las líneas celulares de CRC humanos tras la exposición a diferentes concentraciones de IRI y /o 5-FU se determinó utilizando el alamarBlue de ensayo [32], [33]. Las células (LS174T, 10.000 células /pocillo; HT-29, 5.000 células /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano. Después se había producido adherencia de las células, se añadieron concentraciones crecientes de IRI o 5-FU a las células durante 1 a 72 h, con lavado del fármaco como se requiere en el punto de tiempo indicado. En los experimentos para determinar la dependencia del tiempo de la exposición de las células a combinaciones de fármacos, las células HT-29 se expusieron a IRI /5-FU en una proporción 01:01 molar de 1 a 48 h, con lavado del fármaco como se requiere en el indicado puntos de tiempo). Para todos los experimentos, la viabilidad celular se evaluó a las 72 h después del inicio de la exposición al fármaco. El reactivo alamarBlue se añadieron a cada pocillo a una dilución de 1:10, y se incubaron las células durante 4-8 h adicional antes de medir la fluorescencia. Para los datos de viabilidad, la fracción afectada (FA) fue una medida de la fluorescencia alamarBlue normalizaron a la fluorescencia de los controles: un sin células de control que define el 100% afectan a nivel y un control libre de drogas definir el 0% afectan nivel. Las interacciones entre el IRI /5-FU cuando se usa en combinación
in vitro
se determinaron sobre la base de un solo punto final del ensayo (ensayo de viabilidad alamarBlue, arriba), y los resultados se analizaron mediante el principio del efecto mediano [34 ], según se estimó con el software CompuSyn (ComboSyn, Inc .; Paramus, Nueva Jersey, EE.UU.) [35]. Para cada tiempo de exposición, las curvas de dosis-respuesta se generaron para los agentes, solos y en combinación, y, posteriormente, los valores de índice de combinación (IC) se calcularon en diferentes afectan los niveles (que se define como la fracción afectada). Un valor CI de 0,8 a 1,2 representa una interacción aditiva, a menos de 0,8 representa una interacción sinérgica y mayor que 1,2 representa una interacción antagonista.
Preparación de Irinophore C ™ móvil
IRC ™ se preparó como se describe por Ramsay
et al
. [26]. DSPC: colesterol (55:45 mol%) liposomas se prepararon como se describe anteriormente [36], [37], el uso de pequeñas cantidades de la no metabolizable, trazador de lípidos no intercambiable [
3H] CHE [38]. La película de lípido se hidrató delgada con un
solución CuSO 300 mM 4 a 65 ° C, las vesículas lipídicas resultantes se sometieron a 5 ciclos de congelación-y-descongelación, y los liposomas se extruyeron a un diámetro de aproximadamente 100 nm. No encapsulado CuSO
4 se separó a través de cromatografía usando una columna Sephadex G-50, equilibrada con tampón SHE (sacarosa 300 mM, HEPES 20 mM, EDTA mM 15; pH = 7.5). Los liposomas se incubaron con 0,5 g A23187 /lípido total mg durante 30 minutos a 60 ° C. IRI se añadió a los liposomas en una relación molar de fármaco a lípido de 0.2:1, y la mezcla se incubó a 50 ° C durante 1 h. El fármaco no encapsulado se eliminó mediante cromatografía en una columna de Sephadex G-50, equilibrada con PBS (pH = 7,4), y se determinó la eficiencia de la carga de fármaco después de medir IRI absorbancia a 370 nm. Cuando sea necesario, IRC ™ se concentró a 3.000 ×
g
utilizando tubos de filtro centrífugo (corte de peso molecular de 100 kDa).
Animales y Ética Declaración
Todo
In se llevaron a cabo experimentos in vivo utilizando
129S6 /SvEvTac-
Rag2 ratones
tm1Fwa gratis (Rag2-M) obtenidos a partir de animales del Centro de recursos de la BC Cancer Agency en el Centro de Investigación de Vancouver (Vancouver, British Columbia, CA). Los estudios se realizaron de acuerdo con el Consejo Canadiense para el Cuidado de Animales Directrices con la supervisión de la Universidad de Cuidado de Animales de la Columbia Británica (A10-0171 protocolos y A10-0206). Los animales fueron alojados en condiciones estándar con el enriquecimiento, con acceso a comida y agua
ad libitum
.
farmacocinética y biodistribución
Los experimentos se completaron para determinar si la administración simultánea de IRC ™ /5-FU, a través de inyección intravenosa (IV) o intraperitoneal (ip), altera las propiedades de PK /BD de cualquiera de los agentes. Los ratones macho Rag2-M (8-10 semanas de edad; 4 ratones por punto de tiempo) recibieron i.v. inyecciones, a través de la vena lateral de la cola, de [
3H] CHE-etiquetados IRC ™ (40 mg IRI /kg), [
14C] 5-FU (40 mg /kg), o coadministrado [
marcado con CHE 3H] IRC ™ y [
14C] 5-FU (40 mg IRI /kg y 40 mg /kg, respectivamente), en un volumen total de inyección de 0,2 mL. La dosis de 5-FU seleccionado para estos estudios se basó en experimentos previos que demuestran que esta dosis fue bien tolerado cuando se administra en un (q7d) programa de dosificación una vez por semana, comparable al utilizado para la IRC ™ (resultados no mostrados). En varios puntos de tiempo después de la inyección, los ratones fueron sacrificados por medio de CO
2 asfixia. La sangre se recogió de inmediato a través de punción cardíaca, y se centrifugó para separar el plasma. Los órganos se recogieron y se dividen en 2 piezas; media del plasma u órgano se preparó para el recuento de centelleo líquido (LSC) para determinar el nivel de radiactividad asociada (lípidos y 5-FU), mientras que la otra mitad se procesó para el análisis por HPLC para determinar los niveles de IRI y SN-38. Para limitar la conversión entre la lactona y carboxilato formas, las muestras de plasma y órganos se mantuvieron en hielo y se transfirieron a -70 ° C en 1 hora de la recogida.
Otro estudio se realizó para determinar si las propiedades PK /BD de 5-FU, QD × 2 se administra a través de IP inyección, se vieron afectados por la coadministración con IRC ™ a una dosis de 60 mg IRI /kg. Esta dosificación fue comparable a la utilizada en los estudios de eficacia descritos a continuación. El experimento se terminó usando ratones macho Rag2-M (7-10 semanas de edad; 3 ratones por punto de tiempo). Los ratones fueron inyectados i.p. con 16 mg /kg 5-FU en los días 1 y 2, con o sin co-administración de IRC ™ (60 mg IRI /kg) a través de la administración i.v. inyección en el día 1 a las 2 horas después de la inyección de 5-FU. Cuando se administraron dosis repetidas de 5-FU, la dosis final contenía [
14C] 5-FU como una etiqueta para rastrear los niveles de 5-FU. En varios puntos de tiempo después de la inyección, los ratones fueron sacrificados por medio de CO
2 asfixia. La sangre se recogió de inmediato a través de punción cardíaca, y se centrifugó para separar el plasma. Los órganos se recogieron y se almacenaron en hielo, y se transfirieron a -70 ° C dentro de 1 h de colección. Las muestras se prepararon para LSC para la medición de la radiactividad asociada
En la preparación de LSC, homogeneizados de tejido (10% peso /volumen) se prepararon en solución salina usando un homogeneizador Polytron (Brinkmann Instruments; Rexdale, Ontario, CA). y 0,5 ml de cada homogeneizado se digiere a continuación en 0,5 ml de Soluble (DuPont Canadá; Mississauga, Ontario, CA) durante 1 hora a 50 ° C. Después de enfriar a temperatura ambiente, las muestras se decoloran por la adición de 0,2 ml de 30% H
2O
2. Estas muestras se incubaron a continuación durante la noche a 4 ° C para evitar la excesiva formación de espuma. cóctel de centelleo fue añadido a las muestras, y después de oscuro-equilibrio la radioactividad ([
3H] CHE y [
14C] 5-FU) asociados con el plasma y los órganos se cuantificó a través de LSC.
en preparación para el análisis de HPLC, el segundo medio de cada órgano se homogeneizó en agua enfriada con hielo. Drogas y los metabolitos se extrajeron del homogeneizado usando enfriada con hielo de acetonitrilo /metanol (01:01 v /v) de solución, y centrifugación a 14.000 ×
g
por 15 min para precipitar las proteínas. Se recogió el sobrenadante, y las concentraciones de IRI (lactona y formas carboxilato) y SN-38 (lactona y formas carboxilato) en las muestras de sobrenadante de órganos y en plasma se determinaron mediante HPLC. separación por HPLC de IRI y SN-38 lactona y formas de carboxilato se realizó usando una columna C18 SymmetryShield 250 × 4,6 mm y columna de seguridad C18 SymmetryShield (Waters; Mississauga, Ontario, CA). La elución en gradiente se utilizó con fase móvil A, compuesto por acetato de amonio 75 mM y 7,5 mM bromuro de tetrabutilamonio, se ajustó a pH 6,4 con ácido acético glacial (Fisher Scientific; Nepean, Ontario, CA), y la fase móvil B, compuesto de acetonitrilo. perfil de gradiente fue el siguiente: tiempo = 0 min: 78% A: 22% de B, tiempo = 10 min: 64% A: 36% de B, tiempo = 12 min: 78% A: 22% de B, tiempo = 20 min: 78% a: 22% de B. a 0,01 ml de la muestra se inyectó en la (temperatura de columna de 35 ° C) y se eluyó la columna a un caudal de 1 ml /min. Las formas lactona y carboxilato de ambos IRI y SN-38 fueron detectados utilizando un Waters 2475 Detector de fluorescencia con múltiples longitudes de onda (Waters, Mississauga, Ontario, CA), de conjunto con los eventos del programa de tiempo de? Ex = 370 nm, λem = 425 nm entre 0 y 12,5 min para la lactona IRI y carboxilato de IRI, y? ex = 370 nm, λem = 535 nm entre 12,5 y 20 min para la lactona SN-38 y SN-38 carboxilato de metilo. Antes de la inyección, todas las muestras se mantuvieron a 4 ° C para reducir la conversión entre las formas lactona y carboxilato de IRI o SN-38. Las curvas de calibración de la lactona IRI y SN-38 de lactona se prepararon mediante diluciones en serie en un 02:01: acetato de sodio 1 (100 mM): metanol: acetonitrilo (4,0 pH) buffer. Para el carboxilato de IRI y SN-38 carboxilato, diluciones en serie se prepararon en un 02:01: borato de sodio 1 (100 mM): metanol: acetonitrilo (9,0 pH) buffer. El límite de cuantificación para IRI y SN-38 de lactona y las formas carboxilato de 10 ng /mL. Plasmáticas y tisulares valores de AUC fueron calculados a partir de concentración frente a curvas de tiempo (media +/- desviación estándar) usando el software 5.00 (GraphPad Software; La Jolla, California, US) GraphPad Prism. La significación estadística para el estudio PK /BD se calculó mediante análisis de dos vías de la varianza con Bonferroni post-test utilizando el software GraphPad Prism 5.00.
Eficacia Terapéutica
Se utilizó el modelo de tumor HT-29 para determinar la eficacia terapéutica. 29-HT células (5 x 10
6 células en 0,05 ml de medio) se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) en las partes posteriores inferiores centrales de ratones hembra Rag2-M (6-9 semanas de edad). Los tumores aparecieron dentro de 2 semanas después de la inoculación de células, y, en este momento, los ratones fueron separados al azar en grupos de tratamiento de 6 ratones por grupo, a menos que se indique lo contrario. Los tratamientos se iniciaron cuando los tumores habían alcanzado un volumen promedio de ~150 mm
3 (0,5-0,7 cm de diámetro), que se produjo alrededor del día 14 después de la inoculación de células. Los tratamientos se administraron a los ratones como sigue: solución salina + D5W, 5-FU (16 mg /kg), IRI (60 mg /kg), IRC ™ (40 o 60 mg IRI /kg), IRI + 5-FU (60 mg /kg 16 mg /kg), o IRC ™ + 5-FU (40 o 60 mg IRI /kg 16 mg /kg). D5W y 5-FU se administraron diariamente durante 5 días (QD x 5) cada semana durante 3 semanas vía i.p. inyección; todos los otros tratamientos se administraron una vez por semana durante 3 semanas (q7d x 3) a través de la administración i.v. inyección en la vena lateral de la cola. Cuando los ratones recibieron dos agentes diferentes, ya sea IRI y 5-FU o IRC ™ y 5-FU, en el mismo día, 5-FU se inyectó a las 2 h antes de la administración del IRI o IRC ™. Con el fin de aumentar el tiempo total de exposición al 5-FU, se empleó una dosis diaria de 5-FU [39], basado en el régimen descrito por Saltz
et al
. [40], [41], y la dosis 16 mg /kg fue seleccionado después de un estudio de escalado de dosis determinó que era la MTD en ratones Rag2-M (resultados no publicados). La dosis más alta de IRC ™ (60 mg IRI /kg) utilizado en este estudio se tolera bien y es de aproximadamente 66% de la MTD determinado por nuestro grupo de ratones Rag2-M. La intersección de dimensiones del tumor se midieron 3 veces por semana; el volumen del tumor se calculó utilizando (ab
2) /2 (a, dimensión mayor; b, la dimensión más pequeña). Los ratones fueron sacrificados si la pérdida de peso corporal (BWL) superó el 20%, si el volumen del tumor superó los 1000 mm
3, si se observó ulceración del tumor, o si se observaron deterioros significativos en la salud del ratón (puntuación clínica como se define por una operación estándar aprobado procedimiento). Al evaluar pliegue aumento del volumen del tumor, el tamaño del tumor en el día 0 (día de inicio del tratamiento) se definió como 1.
Resultados
5-FU y el IRI Mostrar Tiempo de Exposición Dependencia de agentes individuales y en combinación
efectos de la combinación de medicamentos dependen de una serie de factores, incluyendo relaciones entre fármacos, las órdenes y las secuencias de tiempo de administración, y los tiempos de exposición. Estudios anteriores han demostrado una relación de dependencia de drogas para IRI combinaciones /Floxuridina [42]; una dependencia de drogas relación similar se muestra en los estudios actuales con combinaciones de IRI /5-FU (datos no mostrados). Sin embargo, los estudios aquí descritos, además, considera el papel de los tiempos de exposición de drogas en los efectos de combinación de fármacos. Esto podría lograrse, por ejemplo, con el uso de infusiones de drogas, un calendario de administración del fármaco optimizada, o mediante el uso de formulaciones de fármacos contra el cáncer de nanopartículas diseñadas para velocidades de liberación de fármacos optimizados y los tiempos de exposición de medicamentos mejorada. Se determinó el efecto del tiempo de exposición sobre la citotoxicidad /citostasis para combinaciones de IRI /5-FU, y estos datos se resumen en la Fig. 1. Los efectos terapéuticos de 5-FU y IRI, cuando se utiliza solo, eran dependientes de tiempo de exposición (Fig. 1A-D) altamente. Para la línea celular LS174T, el IC
50 para IRI (0,3 M; la figura 1A.) Y 5-FU (3,0 M; Fig. 1B) fueron más de 100 veces menor cuando el tiempo de exposición al fármaco fue de 72 h, relativa a un tiempo de exposición de 1 h (44 mM y 330 mM, respectivamente). Para las células HT-29, el IC
50 para el 5-FU fue 9 M durante un tiempo de exposición al fármaco de 72 h, en comparación con 4,000 M durante un tiempo de exposición de 1 h (Fig. 1D). Además, el IC
50 para IRI no fue medible en las células HT-29 cuando el tiempo de exposición fue 1, 4, o 8 h (Fig. 1C). Debe tenerse en cuenta (ver Métodos) que en estos estudios, las evaluaciones de toxicidad se determinó a las 72 h, y por lo tanto solamente se varió el tiempo de exposición de drogas aquí.
A-D) Un único agente tiempo de exposición dependencia. Las células LS174T (A y B) y HT-29 (C y D) fueron expuestos a IRI (A y C) o 5-FU (B y D) por 1 (•, línea punteada), 4 (□, línea continua) , 8 (▾, línea punteada) 24 (⋄, línea continua), 48 (X, línea punteada), o 72 h (○, línea continua). E) la exposición de combinación dependencia del tiempo. células HT-29 se expusieron a IRI /5-FU (relación molar 01:01) durante 1 h (•), 8 h (▾), o 48 h (X). F) Los valores de IC se calculan en FA = 0,9 para las células HT-29 expuestas a IRI /5-FU (relación molar 01:01) para 1-72 h. A-D) Cada punto representa la media +/- la desviación estándar (n = 3-9) a partir de 2-3 experimentos, cada uno realizado por triplicado. E, F) Cada punto o barra representa un valor del índice de combinación calculada a partir de los datos de citotoxicidad compilados a partir de 2-4 experimentos separados, cada uno completaron por triplicado. CI de 0,8 a 1,2 sugiere interacciones aditivas; CI & lt; 0,8 sugiere interacciones sinérgicas; y CI & gt; 1,2 sugiere interacciones antagónicas
Los efectos citotóxicos de combinaciones de IRI /5-FU se determinaron para las células HT-29 para los diferentes tiempos de exposición.. tiempos cortos de exposición (1 h) produjeron fuerte antagonismo, con valores de CI de más de 5 en valores de FA de más de 0,1 (Fig. 1E). En contraste, la sinergia (CI valores de menos de 0,8) se observó en un amplio intervalo de valores de FA cuando el tiempo de exposición se aumentó a 48 h. En un valor de FA de 0,9 (es decir, el ensayo de alamarBlue indica un valor que era 90% menor que la detectada para los controles libres de drogas), los valores de CI eran & gt; 10, 0,8, 0,9, y 0,4 cuando los tiempos de exposición fueron 1, 8, 48, y 72 h, respectivamente (Fig. 1F). Estos resultados sugieren que el tiempo de exposición es una variable importante a considerar cuando se trata de medir las interacciones fármaco-fármaco en ensayos de cribado basados en células.
PK /Estudios BD después de la administración de 5-FU y IRC ™ solos y en combinación
en
in vivo
estudios que evalúan los efectos de la combinación de IRC ™ con 5-FU, es importante determinar primero si una de las drogas altera la farmacocinética o la biodistribución comportamiento de la otra droga cuando que se administran conjuntamente (Fig. 2-4). Las curvas de eliminación plasmática de 5-FU administrado solo o en combinación con IRC ™ se resumen en la Fig. 2A. Cuando se administra solo, 5-FU se elimina rápidamente y los niveles plasmáticos de 5-FU eran menos del 3% de la dosis inyectada dentro de los 15 min de la inyección. El AUC
0-24h plasma de 5-FU, co-administrado con IRC ™, era casi 10 veces mayor que la observada para 5-FU se administra solo, un resultado que es más evidente en los puntos de tiempo más allá de 1 h ( Fig. 3A). Los niveles en plasma de 5-FU más altas también se asociaron con mayores niveles de 5-FU en el hígado, el bazo y los pulmones, pero no los riñones (Fig. 3A). Los resultados sugieren que la eliminación de 5-FU se redujo cuando el fármaco se administró (i.v.) con IRC ™.
Los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con radiomarcado 5-FU (40 mg /kg) o IRC ™ (40 mg IRI /kg), o ambos agentes simultáneamente. En varios puntos de tiempo después de la inyección, se determinaron las concentraciones plasmáticas de 5-FU y IRI (lactona). A) La concentración plasmática media de 5-FU +/- desviación estándar (n = 4) después de la administración solo (línea gris sólida) o después de la coadministración con IRC ™ (sólida línea de negro). B) La media de la concentración plasmática de IRI lactona +/- desviación estándar (n = 4) después de la administración de IRC ™ solo (línea gris discontinua) o después de la coadministración de IRC ™ con 5-FU (sólida línea de negro).
Los ratones fueron inyectados iv con radiomarcado 5-FU (40 mg /kg; barras rayadas) o IRC ™ (40 mg IRI /kg; barras negras), o ambos agentes simultáneamente (barras blancas). En varios puntos de tiempo después de la inyección, se determinaron las concentraciones en plasma y de órganos de las especies de lípidos y de drogas, y el AUC
valores 0-24h se calcularon a partir de las curvas de concentración-tiempo resultantes. Los datos se presentan como media en plasma y el área bajo la curva de órganos (0-24 h) (n = 4) para 5-FU (A), lípido total (B), IRI lactona (C), IRI carboxilato de metilo (D), y SN-38 lactona (E).
Los ratones fueron inyectados ip con 5-FU (16 mg /kg) en los días 1 y 2 (línea gris /bar); 5-FU, se añadieron con radiomarcado 5-FU en día también se inyectaron 2. La mitad de los ratones i.v. con IRC ™ (60 mg IRI /kg) en el día 1 (negro línea /bar), a las 2 horas después de la inyección de 5-FU. En varios puntos de tiempo después de la inyección, se determinaron las concentraciones plasmáticas y tisulares de 5-FU, y AUC
valores 0-8h se calcularon a partir de las curvas de concentración-tiempo resultantes. Los datos se presentan como la media de concentración de 5-FU en el hígado (A), bazo (B), pulmón (C), riñón (D), plasma (E) +/- desviación estándar (n = 3), o la media de plasma y área bajo la curva de órganos (0-8 h) (n = 3) de 5-FU (F).
las curvas de eliminación plasmática de IRI lactona tras la administración de IRC ™ por sí solos, o en combinación con 5-FU, se muestran en la Fig. 2B. En los puntos de los primeros tiempos hasta 4 h después de la inyección, había una pequeña, pero significativa, disminución de los niveles plasmáticos de IRI lactona para los animales inyectados con IRC ™ en combinación con 5-FU, en comparación con IRC ™ solo; a los 8 y 24 puntos de tiempo h, se observó una disminución más pronunciada en los niveles de lactona IRI plasma de ratones que eran co-administrado IRC ™ /5-FU, en comparación con un solo agente de IRC ™. Sin embargo, al evaluar el plasma AUC
0-24h datos calculados para lipídica liposómica (Fig. 3B), el IRI en forma lactona (Fig. 3C) o en forma de carboxilato (Fig. 3D), y SN-38 en la lactona forma (Fig. 3E), los valores eran esencialmente equivalente a la del plasma AUC
0-24h determinó tras la administración de IRC ™ solo. Esto también se refleja en el tejido AUC
Datos de 0-24h (Fig. 3B-E), con la excepción del bazo, donde los niveles elevados de IRI lactona y carboxilato IRI se observaron tras la coadministración de (iv) del IRC ™ /5-FU, en relación con IRC ™ solo. El análisis por HPLC del IRI y SN-38 en el hígado no pudo realizarse en los animales que recibieron IRC ™ o IRC ™ /5-FU, debido a la interferencia espectral de una molécula desconocida que fue co-extrajo con IRI y SN-38 desde el hígado homogeneizado. Aunque el ensayo utilizado en estos estudios fue capaz de detectar SN-38 en la forma carboxilato, no se detectó en ninguna de las muestras de plasma o de tejido por encima del límite de detección de HPLC de 10 ng /mL.
Los estudios de eficacia se describe a continuación evaluó la actividad de 5-FU (solo y en combinación) utilizando una intensa programación (todos los días) dosis, un horario que hizo necesario para administrar el fármaco por vía intraperitoneal. El cambio en el PK /BD se ha indicado anteriormente, cuando los fármacos se administran por vía intravenosa tanto, también se espera que sea una preocupación menor cuando IRC ™ fue dada por vía i.v. y 5-FU se dio i.p. Los resultados presentados en la Fig. 4 frente a este diseño del estudio. Consistente con los resultados en la Fig. 3, los datos sugieren, por lo menos en los puntos de tiempo tempranos, que las concentraciones plasmáticas y de órganos de 5-FU son mayores cuando IRC ™ se administra en combinación con 5-FU. Este efecto fue menos evidente que cuando se dosifica tanto drogas por vía intravenosa, ya que las concentraciones de 5-FU no fueron estadísticamente diferentes en la mayoría de los puntos de tiempo más allá de 2 h. Sin embargo, a 0,5 h después de la inyección, las concentraciones de 5-FU fueron más altos en el hígado (P & lt; 0,001; Fig. 4A), pulmón (P & lt; 0.05; Fig. 4C), riñón (P & lt; 0,001; Fig. 4D) y el plasma (P & lt; 0,05; Fig. 4E) de ratones que recibieron IRC ™ /5-FU, en relación con aquellos animales que recibieron 5-FU solo. En comparación con los animales inyectados con 5-FU como agente único, cuando los ratones recibieron la combinación de IRC ™ /5-FU, 2 veces se detectaron altas concentraciones de 5-FU en el hígado en 0.5 h (P & lt; 0,001) y 1 h (P & lt; 0,01) después de la inyección, y un aumento correspondiente en el hígado AUC 0-8h de 5-FU (Fig. 4F) también se observó
. Las AUC
0-8h de 5-FU en plasma (Fig. 4F) fue ~ 1,5 veces más alta después de la administración de IRC ™ /5-FU, en comparación con los animales que recibieron 5-FU solo.