Extracto
Los glioblastomas (GBM) puede contener una proporción variable de células madre del cáncer activos (CSC), capaces de auto-renovación, de la agregación en CD133
+ neuroesferas, y para desarrollar tumores intracraneales que phenocopy los originales. La hipótesis de que nucleostemin puede contribuir a la biología de células madre del cáncer ya que estas células comparten características con las células madre normales. Aquí mostramos que nucleostemin se expresa en células madre cancerosas GBM-aisladas a partir de muestras de los pacientes, y que su expresión, a la inversa de lo que se ha descrito para las células madre normales, no desaparece cuando se diferencian las células. El significado de la expresión en células madre cancerosas nucleostemin fue dirigida por la orientación correspondiente ARNm utilizando lentivirally transducidas corto horquilla RNA (shRNA). De este modo, nos encontramos con un desviado nucleostemin RNAi (shRNA22) que suprime la proliferación e induce la apoptosis en células madre cancerosas GBM-. Por otra parte, en presencia de shRNA22, GBM-células madre cancerosas no pudo formar neuroesferas
in vitro
o crecer en agar blando. Cuando estas células se xenotransplantado en los cerebros de ratas desnudas, el desarrollo del tumor se retrasa significativamente. Se hicieron intentos para identificar el principal objetivo /s de shRNA22, lo que sugiere un factor de transcripción implicado en una de las MAP-quinasas o múltiples objetivos-vías de señalización. El uso de este shRNA puede contribuir a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para este tipo de tumor cerebral incurable
Visto:. Gil-Ranedo J, Mendiburu Eliçabe-M, García-Villanueva M, Medina D, M del Álamo, Izquierdo M (2011) Un fuera de objetivo Nucleostemin RNAi inhibe el crecimiento humana en células madre del cáncer glioblastoma derivado. PLoS ONE 6 (12): e28753. doi: 10.1371 /journal.pone.0028753
Editor: Keith L. Negro, el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Junio, 2011; Aceptado: 14 Noviembre 2011; Publicado: December 12, 2011
Derechos de Autor © 2011 Gil-Ranedo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos de: Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF 2.009 a 07259) España, y la Fundación Eugenio Rodríguez Pascual (Madrid). El Centro de Biología Molecular S. O. es también el destinatario de un subsidio institucional de la Fundación Ramón Areces. JG-R fue el beneficiario de una beca predoctoral del Gobierno Vasco, España. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
glioblastoma multiforme es uno de los más maligno y común de todos los tumores astrocíticos [1]. El patrón de crecimiento de GBM es altamente infiltrante, haciendo una cura quirúrgica muy difícil y que resulta en los resultados de supervivencia muy pobres que han mejorado sólo marginalmente en las últimas décadas [2]. La hipótesis de las células madre de cáncer sugiere que los tumores se organizan en una jerarquía con una subpoblación de células madre cancerosas responsables de la progresión tumoral, el mantenimiento, y la recurrencia [3]. Las células con propiedades madre-como fueron inicialmente identificados en la leucemia mieloide aguda [4], y en la actualidad su existencia ha sido confirmada en el cáncer de mama [5], el meduloblastoma y el glioblastoma [6], el cáncer de próstata [7], el melanoma [8], cáncer de ovario [9], de cabeza y cuello carcinomas escamosos [10], cáncer de colon [11], cáncer de páncreas [12] y el cáncer de pulmón [13], entre otros. En el glioblastoma, recaídas, normalmente sigue el tratamiento, probablemente debido a que los CAC son altamente infiltrante, resistentes selectivamente a radioterapias, quimioterapias [14], [15], [16], las inmunoterapias [17], y promover la actividad angiogénica. Por otra parte, las terapias de quimioterapia e radiactivas pueden células madre cancerosas de tumores cerebrales primarios para mejorar sus características de células troncales-como [18]. Esta población de células madre cancerosas es altamente tumorigénicas y phenocopy el tumor original en modelos de roedores de xenoinjertos [19], [20]. Enfoques para obligar a los CAC para diferenciar a las células con o sin los atributos de la división celular limitados, al exponerlos a las proteínas morfogenéticas óseas, por ejemplo, se utilizan para hacerlos más vulnerables a las terapias convencionales, y mostraron una eficacia considerable en modelos de ratón [21]. La comprensión de la biología básica de las células madre del cáncer es una característica clave antes de pasar a tratamientos putativos para eliminarlas.
Nucleostemin es una proteína de unión a GTP, llamado así debido a su localización nucleolar y expresión preferencial en las células madre [22 ]. Aunque la proteína es predominantemente presente en las células madre embrionarias y adultas, sino que también se expresa en varias líneas celulares transformadas y tumores [23], [24]. Nucleostemin, por otra parte, es bruscamente hacia abajo-regulada durante la diferenciación antes de la división celular terminal. Esta proteína se identificó primero en las células madre neurales de rata adulta, y se ha implicado en la progresión del ciclo celular [22]. Varias proteínas de unión nucleostemin-han sido identificados, incluyendo p53, MDM2 y la unión del factor 1 (TRF1) repetición telomérica [22], [25], [26]. Las alteraciones en los niveles de expresión nucleostemin causan una disminución en la tasa de proliferación de células, en ambas formas dependientes e independientes de p53, [22], [26] - [28]. La proteína es indispensable para la embriogénesis temprana [29], pero también es importante en las células madre neurales de adultos [30]. Algunos estudios han demostrado que el agotamiento de nucleostemin se asocia con una capacidad limitada tumorigénico tanto en HeLa y células PC-3 [31], [24]. Además de su implicación en la regulación de la proliferación celular, varias funciones adicionales han sido asignados a nucleostemin tales como la regulación de la longitud del telómero, promoviendo la degradación de TRF1 [25], el procesamiento de pre-ARNr [32] y el mantenimiento de la arquitectura nucleolar [33].
Nuestra intención era explorar el papel de nucleostemin en humanos GBM-células madre cancerosas transducidas usando lentivirally ARN corto horquilla (shRNAs) para reducir en gran medida su presencia en las células. Las células madre cancerosas agotados de expresión nucleostemin (shRNA18) no dio lugar a la profunda reducción de la proliferación celular y el aumento de la apoptosis que habíamos esperado. En su lugar, la proliferación suprimido un lentivirus fuera del objetivo (shRNA22), auto-renovación y supervivencia de las células madre cancerosas. Además, la presencia de este shRNA retrasó significativamente la capacidad de los CAC tumorigénico cuando xenoinjertado en los cerebros de ratas desnudas.
Resultados
Expresión de nucleostemin en dos líneas de células madre de cáncer derivadas de humano glioblastoma
Dos cultivos enriquecidos de células madre del cáncer se obtuvieron a partir de muestras de tumores cerebrales humanos (muestras de células madre cancerosas y células madre cancerosas-5-7). Ambas líneas celulares crecieron exponencialmente y formaron neuroesferas incluso cuando se sembraron a baja densidad, lo que indica una fuerte capacidad de auto-renovación. Las neuroesferas fueron positivos para CD133 (Fig 1A;. Verde), nestina (Fig 1A;. Rojo), Sox2 (Fig 1B;. Verde) vimentina (Fig. 1B; rojo), y nucleostemin (Fig 1B;. Rosa) neural marcadores de células madre. Nucleostemin estaba presente en el núcleo de 88% de los CAC-5 y CSC-7 células, como se determina por ensayos de inmunofluorescencia (Fig. 1C). Un gran porcentaje de las células (76%) también fueron positivos para CD133, y se obtuvieron porcentajes incluso más altos para nestina, vimentina y Sox2 (más del 95%), este último que participan en la auto-renovación y la proliferación de las células madre. CD15 es un marcador para el 54% de los CAC-5 y el 69% para los CAC-7. El multipotencia de estos dos cultivos se demostró como las neuroesferas cultivadas en medio inductor de la diferenciación muestra típica diferenciación morfológica hacia todos los tres linajes neuronales - astrocytic, neuronal y oligodendrocíticos, según lo evaluado por la positividad para β-III-tubulina [34] y MAP2 ( neuronal) (Fig. 1D rojo, y S1 rojo), GFAP (astrocitos) (Fig. 1D verde), y NG2 (precursor oligodendrocíticos) (Fig. S1 verde) antígenos respectivamente. Sin embargo, las células diferenciadas no lo hicieron expresión suelto de nucleostemin (Fig. 1E), a pesar de que no expresan ninguno de los otros genes relacionados stemness (datos no mostrados). Los análisis de cariotipo mostró varias alteraciones que reflejan la actividad de transformación, y los ensayos de clonogenicidad en agar blando indicó desarrollo de muchas colonias.
A. CSC-5 y CSC-7 neuroesferas que expresan CD133 (verde) y nestina (rojo). Barra de escala: 50 micras. B. Los CCC-5 y CSC-7 células que muestran la expresión y localización celular de Sox2 (verde), vimentina (rojo) y nucleostemin (púrpura). Barra de escala: 10 m, y la trama cuantitativa (C) de los marcadores de células madre CD133, nestina, vimentina, Sox2, nucleostemin y CD15 en células madre cancerosas-5 (gris) y los CAC-7 (verde). D. neurona (β-III-tubulina, rosa-rojo) (GFAP, verde) y la capacidad de diferenciación de las células madre cancerosas de astrocito-5 y los CAC-7. Barra de escala: 50 micras. expresión de E. Nucleolares nucleostemin en troncales o células madre cancerosas differentiatiated-5 (gris) y las células CSC-7 (verde). F. La resonancia magnética de
in vivo
tumores desarrollados a partir de células madre cancerosas y células madre cancerosas-5-7 (puntas de flecha de color amarillo apuntan a que el tumor), y el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (G) de las ratas immunodeficent, después de las CSC-5 (rojo) o CSC-7 (verde) xenoinjertos ortotópico.
a continuación, exploramos el potencial de las células madre cancerosas tanto-5 y los CAC-7 para formar tumores después xenogratf ortotópico en los cerebros de ratas immunodeficent. Después de la inyección de 5 × 10
5 células intra-craneal, ambas líneas celulares formaron grandes tumores en el 100% de los casos (n = 12 para los CAC-5 y 11 para los CAC-7), seguido por formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) (Fig. 1F). Los tumores fueron altamente infiltrante (Fig. S2). Explantes de estos gliomas fueron trasplantadas en serie en los cerebros de ratas desnudas y otros tumores letales que fueron generadas por igual enriquecidas en células madre cancerosas, lo que demuestra una alta capacidad de auto-renovación. Los tiempos de supervivencia medios de los anfitriones fueron 60 ± 4 días con las CSC-5 y 81 ± 11 días en los CSC-7 células (Fig. 1G). análisis histopatológicos de xenoinjertos mostraron los rasgos característicos generales de GBM, como pseudopalisade y necrosis focal, alta celularidad, la alta expresión de EGFR y el índice proliferativo alto (MIB-1). Pacientes y muestras de xenoinjertos muestran niveles de expresión similares para todos los marcadores, incluido el medio de baja expresión (paciente /xenoinjerto 7) para p53 (paciente /xenoinjerto 5) y, y muy bajo, en su caso, por p16 (Fig. S3). Los resultados muestran que los tumores trasplantados en las ratas fueron phenocopies de los tumores originales de los pacientes.
Caracterización de los shRNAs diseñados para apuntar nucleostemin humano
El gen nucleostemin tiene 15 exones, y como se somete corte y empalme alternativo produce tres transcritos de ARNm diferentes. Excepto por el exón 1, estas variantes tienen secuencias similares. Por lo tanto, para el diseño de cebadores específicos para golpear hacia abajo las tres variantes, hemos elegido cebadores en los sitios comunes de los exones 4, 10, 13 y 15 (Fig. 2A). Nos centramos en nucleostemin por la infección por lentivirus expresar una shRNA contra la proteína nucleolar. ShRNAs cinco diferentes con secuencias complementarias perfecto en el ARNm nucleostemin humanos fueron introducidos en células madre cancerosas y las células 5-CSC-7. Tres de los cinco shRNAs fueron escogidos para una caracterización adicional: shRNA18, shRNA20 y shRNA22. El análisis de transferencia de RT-PCR y Western reveló que mientras shRNA18 causó una reducción significativa en el ARNm nucleostemin (78%) y los niveles de proteína (51%), tanto shRNA20 y shRNA22 no parecen afectar a los niveles de ARNm y de la proteína, cuando se normaliza a la GAPDH respectivo correspondiente (ARNm) y los controles de actina (proteína) (Fig. 2B). Los resultados sugieren fuera de la diana de unión de ambos shRNA20 y shRNA22. Alternativamente, las reducciones relativamente menores de los niveles de mensajero nucleostemin vía efecto objetivo podrían tener efectos dominantes en un ensayo si la salida es muy dosis-sensible a los niveles de esta proteína particular. Diseñamos un ensayo, basado en la formación de colonias en agar blando, de distinguir entre las dos posibilidades. La expresión de shRNA18 en CSC-5 o CSC-7 no inhibe la formación de colonias en agar blando, mientras que la expresión de shRNA22, y en menor medida shRNA20, reducido drásticamente el número de colonias que crecen en este tipo de medio (Fig. 2C y 2D). Si shRNA22 estaba causando una pequeña reducción en el mensaje nucleostemin, y esto provocó una importante inhibición del crecimiento debido a que la vía involucrada era muy sensible a las reducciones del nivel de menor importancia del mensajero o proteína, habrá que esperar un efecto similar cuando las células son o bien infectadas con shRNA18 solo, o cuando las células son infectadas con simultánea tanto shRNA18 y shRNA22. Es decir, un gran número de colonias en crecimiento. Por el contrario, si un verdadero efecto fuera del objetivo estuviera operando aquí, el resultado de esta combinación sería lo opuesto, ya que el objetivo real sería diferente de nucleostemin, y se podría observar el menor número de colonias que crecen en agar blando como los observados cuando shRNA22 se utiliza solo. La infección de las células con un lentivirus que no lleva un shRNA se utilizó como control. La medición del número de CSC-5 colonias formadas en agar blando después de diferentes tratamientos combinados dio los siguientes resultados (Fig 2E.): Un alto número de colonias para el control shRNA (shRNACo) y para la combinación shRNACo + shRNA18, como se esperaba y un bajo número de colonias, tanto para shRNACo + shRNA22, y shRNA18 + shRNA22. La realización de este experimento, hemos sido capaces de discriminar entre las posibilidades de todos los shRNAs dirigidos nucleostemin a diferentes grados o, al shRNA22 que tiene un objetivo diferente. Si el efecto era debido al bajo nivel de la inhibición, la co-expresión de la shRNA18 y shRNA22 debe enmascarar el efecto de este último, ya que shRNA18 inhibiría más fuerte de la expresión del gen nucleostemin. Por otro lado, si el efecto fue desviado, apreciaríamos las consecuencias de shRNA22 independientemente de la expresión de shRNA18. Los resultados muestran claramente que shRNA22 induce su efecto independiente de la expresión de shRNA18, lo que indica que se debe a un efecto desviado. Por lo tanto, se descartó la hipótesis de una reducción muy pequeña de nucleostemin por shRNA22 tener un efecto negativo dominante en el crecimiento celular. Creemos que el efecto de inhibición del crecimiento de shRNA22 en agar blando se debe a un
de buena fe
de efecto objetivo.
A. Representación esquemática de las 3 variantes de transcripción nucleostemin y exones. Las puntas de flecha apuntan a cada una diseñada shRNA. B. Nucleostemin ARNm (rojo) y la proteína de cuantificación (azul) en los CAC-5 tratada con shRNACo, shRNA18, shRNA20 y shRNA22. C. efecto shRNAs en CSC-5 y CSC-7 capacidad de formación de colonias en agar blando, y su análisis cuantitativo (D). E. Soft recuentos de colonias de agar-dobles en infecciones para determinar la especificidad de nucleostemin-shRNA22. ** P = 0.05; *** P≤0.001.
El agotamiento de nucleostemin por shRNA18, no redujo significativamente la población de células en fase S, como se indica por el nivel de la absorción de BrdU después de un pulso min-15 (Fig. 3A) o de la población total de células en ciclo capturado por un 20 h de tratamiento BrdU (Fig. 3B). Los otros dos shRNAs: shRNA20 y shRNA22, que tienen una inhibición muy baja, si la hay, de expresión, muestran un porcentaje consistentemente más bajos de células en fase S y en bicicleta. Como se ha demostrado mediante ensayos de curva de crecimiento, el número total de células infectadas con el lentivirus de control que carece de inserción shRNA-expresando (shRNACo) aumentado varias veces más de seis días. Las células infectadas shRNA20 o shRNA22 no aumentaron en número, o incluso disminuir considerablemente (Fig. 3C y 3D), mientras que las CSC infectadas con shRNA18 comportaron mucho más cerca de las células de control que a shRNA20 y shRNA22. Los resultados sugieren una implicación del objetivo primordial de shRNA22, ya un poco menor medida al shRNA20 golpean, para sostener el crecimiento y la supervivencia de las células madre cancerosas humanas GBM-. No estamos seguros sobre shRNA20 y shRNA22 compartir un objetivo principal, a pesar de la cercanía física de las secuencias originales y shRNA20 shRNA22 en el gen nucleostemin. Aunque sólo 66 nucleótidos separan estas dos secuencias, una búsqueda de alineación de secuencias humana teniendo en cuenta los 66 nucleótidos entre ellos no reveló ningún partido además nucleostemin.
A. Número de fase-S-ciclismo o total de (B) los CAC-5 (gris) y las células CSC-7 (verdes) tratados con los distintos shRNA. C. Número de células viables en DIV 0, 3 y 6 en los CSC-5 y CSC-7 (D) tratados con las diferentes shRNAs. ** P = 0.05; *** P≤0.001.
El shRNA20 y shRNA22 fuera del objetivo, inducir la apoptosis en células madre cancerosas preferentemente CD133 + y perjudica la formación de neuroesferas
La presencia de estos shRNAs afectan no sólo la proliferación celular sino también la supervivencia celular. Se cuantificó el porcentaje de células apoptóticas en tanto los CAC-5 y 7 siguientes poblaciones shRNACo, shRNA18, shRNA20 y la infección lentiviral shRNA22. 7-AAD /anexina V-tinción reveló una apoptosis preferencial en CD133
+ células en ambos CSC-5 y 7 poblaciones (Fig 4A y 4B.); los valores relativos con respecto a los controles para los CAC-5 y CSC-7 se muestran en la Tabla 1. También el porcentaje de CD133
+ células se reduce tanto en los CSC-5 y CSC-7 poblaciones después de la infección lentiviral shRNA20 y shRNA22 (Fig. S4). Estos resultados sugieren que el objetivo principal de shRNA22 y shRNA20 es un factor de supervivencia para los CAC-GBM preferentemente expresado en CD133
+ células.
A. La apoptosis inducida por shRNAs en los CAC-5 y los CAC-7 (B) CD133
+ (rojo) o CD133
- poblaciones (azul). C. Neurosphere formando-capacidad de CSC-5 y 7-CSC células (D), tratada con los diferentes shRNAs. ** P = 0.05; *** P≤0.001.
El compartir ciertas características clave de las células madre normales, células madre cancerosas son capaces de auto-renovación, lo que permite un mantenimiento sostenido de esta subpoblación y la expansión del tumor correspondiente. Neurosphere capacidad de formación después del tratamiento con los diferentes shRNAs se midió (Fig. 4C y 4D). Prácticamente no hay esferas se formaron por las células tratadas con shRNA22 y muy pocos por ShRNA20 trataron células en ambos CSC-5 y 7 poblaciones. Neuroesferas desarrollan en 100% de los grupos de control. Estos resultados, junto con nuestras observaciones de que las CSC falló a proliferar y sufrió la apoptosis, sugieren que se requiere que el objetivo principal de shRNA22 y shRNA20 para la auto-renovación de las células madre del cáncer de glioblastoma.
El shRNA22 desviado reduce significativamente el potencial tumorigénico de CSC-5
Se examinó el efecto de infectar a las CSC-5 células con lentivirus de control o lentivirus que expresan shRNA22. Después de la selección de puromicina, se inyectaron 5 x 10
5 células en el cerebro de ratas desnudas. Todos los animales portadores de células de control, es decir células infectadas con lentivirus vacío, (n = 3) desarrollado tumores grandes, seguidos por resonancia magnética, y murió en 63 ± 1 día, no muy diferente de los CAC-5 no infectadas (61 ± 4 días, n = 12). En contraste, los animales inyectados con las células que expresan shRNA22 (n = 6), desarrollaron tumores significativamente más pequeños, siendo el volumen medio de 148 mm
3, mientras que el valor medio de los tumores que expresan shRNACo eran 358 mm
3 (Fig . 5A y 5B). La trama de supervivencia de Kaplan-Meier indica una diferencia significativa entre el shRNACo y shRNA22 tratada células tumorales, con una supervivencia media de este último de 71 ± 2 días (Fig. 5C). Por lo tanto, la presencia y expresión de shRNA22 en células madre cancerosas parece ser importante para la atenuación de la progresión tumoral.
A. La cuantificación de los volúmenes de los tumores inducidos con CSC-5 células tratadas con shRNACo (negro) y shRNA22 (rojo). B. formación de imágenes por resonancia magnética de ejemplos representativos de los tumores después de xenoinjertos ortotópico en ratas desnudas-cerebros de células CSC-5 que llevan shRNACo o shRNA22, y la trama de supervivencia de Kaplan-Meier (C) de las ratas inoculadas con células madre cancerosas immunodeficent-5 (maqueta, gris ), las células que llevan shRNACo (negro) y shRNA22 (rojo).
El efecto de shRNA22 no parece *** p≤0.001. de ser exclusivo para los CAC
Hemos tratado de determinar el efecto de shRNA22 en las células de glioma sin CD133
+ inmuebles madre, tales como líneas celulares de glioma humano U87MG y U373MG. Se evaluó su potencial clonogénico mediante el ensayo de agar blando siguiente shRNACo y shRNA22 infección lentiviral. Se observó una reducción significativa en el número medio de colonias cuando shRNA22 se expresó en U373MG (hasta 1%), y en menor medida cuando en la línea celular U87MG glioma (hasta 41%) (Fig. 6A). También se midió la supervivencia celular mediante la estimación del porcentaje de células apoptóticas en ambas líneas celulares U373MG y U87MG siguientes shRNACo, y la infección lentiviral shRNA22. 7-AAD /anexina V-tinción reveló apoptosis preferencial en las células U373 en un comportamiento similar a los CAC. Por otro lado, las células U87MG aparecieron bastante resistentes a la apoptosis (Fig. 6B). Los resultados sugieren que aunque shRNA22 puede atenuar el crecimiento tumoral en las células de glioma en general, su impacto puede depender del tipo de célula. El hallazgo de que el efecto shRNA22 no se limita a los CAC es importante en el diseño de estrategias para eliminar todos los tipos de células de cáncer que se acumulan un tumor altamente heterogéneo tal como glioblastoma.
A. shRNAs efecto sobre U373MG (negro) y U87MG (gris) suave capacidad de formación de colonias en agar. B. apoptosis inducida por shRNAs en U373MG (negro) y U87MG (gris). ** P = 0.05; *** P≤0.001.
Los intentos de identificar el objetivo primordial de shRNA22
Hemos llevado a cabo una búsqueda genómica de secuencias, que no sea nucleostemin, con diferentes grados de homología con shRNA22 nucleótidos. Para ello se utilizó la herramienta de búsqueda de alineamiento local básico (BLAST) y seleccionamos cuatro candidatos: PCLO, que participan en la liberación de neurotransmisor; HSPA13, miembro de la familia HSP70 acompañante; SEC22C, que participan en el tráfico vesicular; y CNOT1 relacionadas con la transcripción y la degradación del ARNm. De los 21 nucleótidos, 14 eran una pareja perfecta en todos los casos excepto CNOT, con un partido de 13 nucleótidos. Sin embargo, ninguno de los cuatro candidatos era el objetivo principal de shRNA22 medida por QRT-PCR (datos no mostrados) que no se observaron diferencias en la concentración de Contenido de la presencia o ausencia de shRNA22 relacionada con shRNACo sus ARNm.
Para determinar los genes expresados diferencialmente amplia del genoma en los CAC-5 después de la infección shRNA22, se utilizó Affymetrix GeneChip Gen 1.0 Sistema de Arreglo ST que contiene aproximadamente 28.869 genes humanos, incluyendo la región no traducida 3 '(UTR) de los ARNm que podrían ser una objetivo para la unión de un ARN-como forma de micro (mi). Como resultado se identificaron 182 genes regulados en los CAC-5 tratados con shRNA22 en relación con shRNACo (Tabla S1). Como era de esperar, nucleostemin no estaba entre las reguladas por los genes. Los intentos para agrupar los genes con shRNA22 golpea por función (basados en ontología de genes y la vía de señalización de datos) sí revelaron la presencia de 26 genes implicados en la regulación de la transcripción entre los genes silenciados, y 56 proteínas de unión al ADN (Fig. 7A). La vía de transducción de señales con más genes regulados hacia abajo fue la MAPK quinasas vía (Fig. 7B). Aunque hasta ahora los resultados no son concluyentes, una indicación de que shRNA22 puede estar implicada en el silenciamiento de un factor de transcripción implicado en una de las MAP-quinasas-vías de señalización puede ser sugerido. Alternativamente, múltiples efectos de destino son también una fuerte posibilidad de que shRNA22, de una manera similar a los micro ARNs.
A. Significativa abajo (verde), arriba (rojo) y todos los regulados por genes (azul) agrupados por función de los procesos biológicos, o por pertenecer a las vías de señalización (B) inducida por shRNA22 en células CSC-5.
Discusión
las similitudes y diferencias entre los SC y los CAC han sido la fuente de mucha contención [35], [36], [37]. Las CSC cerebrales se asemejan a las SC neuronales en términos de fenotipo, la señalización y el comportamiento in vitro [38], pero en este momento no está claro si las células madre cancerosas son, de hecho,
de buena fe
células madre. caracterizaciones experimentales de las poblaciones de células madre cancerosas pueden ayudar en estos asuntos. En ratas, nucleostemin es altamente expresado en los nucleolos de sistema nervioso central SCs, pero no en su progenie diferenciada, como el gen parece ser cerrado bruscamente durante la diferenciación antes de la fase terminal [22]. Nuestras observaciones de nucleostemin se expresan incluso después de los CAC se vieron obligados a diferenciarse en cultivo, implica una nueva firma de células madre cancerosas y una diferencia significativa con las SC, no se informó previamente.
Hemos utilizado un enfoque de ARNi para promover específicamente la degradación de nucleostemin mRNA. los datos anteriores han mostrado que la anulación-down nucleostemin expresión causó una disminución severa en la proliferación celular en células de cáncer de vejiga [39] y la reducción de la capacidad de formación de esferas en las células madre de cáncer de mama humanos [40]. También se informó de una reducción significativa en la progresión del ciclo celular en diferentes tipos de tumores cerebrales humanos y en líneas celulares de glioblastoma humanos derivados de [41]. Sin embargo, encontramos que la única shRNAi que reduce de manera eficiente la proteína, no suprime la progresión del ciclo celular, no disminuye el crecimiento de cultivos de CSC, y no disminuye el número de colonias formadas en agar blando, en comparación con los controles infectados con un vacío lentivirus. Las discrepancias podrían deberse a diferencias en los niveles golpeando abajo de nucleostemin obtenidos en los informes anteriores (superior al 75% y, a veces más de un 90%) y Estados Unidos (51%).
La tecnología de ARNi ha sido ampliamente utilizado en células de mamíferos para suprimir el nivel de expresión de genes individuales, lo que ayuda a definir el papel funcional de genes, en particular en enfermedades. Gran parte del trabajo se ha centrado en algoritmos de diseño shRNA, con especial atención a la especificidad de genes diana y la eficiencia [42], [43]. Sin embargo fuera de objetivo efectos están muy extendidas, y shRNAs individuales se han demostrado para regular a la baja de uno o varios otros genes "no deseados" [44], [45], a veces mediante la unión en un micro (mi) de manera ARN similar a la 3 'UTRs de mRNAs [46]. Encontramos que shRNA22 es vinculante para otros /s que el gen objetivo previsto. Fuera de objetivo efectos descritos en los estudios previos de ARNi se mediada por la complementariedad parcial entre shRNAs y los 3 'UTRs de los genes fuera de objetivo, que implica un heptámero o hexámero' 'partido de la hebra shRNA en el extremo 5' de semillas final en las posiciones 2 a 8 o 2-7, respectivamente [46], [47]. El mecanismo es similar a la de miRNAs. Aunque la biblioteca BLAST utilizado incluyó los 3'UTRs de los mensajeros, un parámetro de partido 7-nucleótidos no se incluyó en el análisis de la pantalla, ya que representaría una relajación grave de las condiciones y un gran aumento en los partidos putativos. Un objetivo principal común para shRNA20 y shRNA22 se presume, como las secuencias son sólo 66 nucleótidos en el exón aparte nucleostemin 10. Es posible que una secuencia nucleostemin incluyendo el shRNA22, la región entre los dos shRNAs y shRNA20 (quizás parcialmente), que también estar presente en otra región genómica, que codifica una proteína diferente cuyo mRNA estructura secundaria sería más accesible a shRNA22 y shRNA20 que el de la mRNA nucleostemin. Sin embargo, no se encontraron nuevos partidos al lado nucleostemin en una búsqueda en todo el genoma humano para las regiones complementarias a las secuencias de dos shRNA y los nucleótidos entre ellos, realizado utilizando la herramienta de búsqueda de alineamiento local básico (BLAST).
La perfiles de expresión génica de células madre cancerosas-5 en presencia o ausencia de shRNA22 no lo hizo de manera inequívoca indicar su objetivo principal. Por el contrario, efectos múltiples destinatarios son una posibilidad razonable para este shRNA. El mayor número de genes silenciados estaba relacionado con la regulación de la transcripción cuando éxitos fueron agrupados por función, y el exceso de representación de los genes implicados en la vía de señalización MAPK se redujeron regulado por la expresión shRNA22. La sobreexpresión de uno o más genes de la vía de señalización MAPK es común en glioblastomas, y varias moléculas pequeñas que inhiben la vía de señalización de la quinasa PI3-Akt están en desarrollo clínico. Aunque muchas de estas moléculas han sido eficaces en modelos preclínicos, no queda claro si esta estrategia solamente será suficiente para interrumpir los eventos moleculares iniciado y mantenido por la señalización a lo largo de las vías debido a la activación de otras vías que compensar la inhibición de la específica quinasa. Recientemente se han hecho intentos para identificar genes o vías cuya inactivación, en combinación con los inhibidores de PI3K PX-866 y NVPBEZ-235, podría resultar en un fenotipo letal en las células de glioblastoma multiforme [48]. El shRNA22 identificados, cuando se expresa en células madre cancerosas de pacientes con glioblastoma, inhibe la proliferación celular y la auto-renovación, induce la apoptosis y reduce significativamente su potencial tumorigénico cuando xenotransplantado en los cerebros de ratas desnudas. El hecho de que el objetivo principal de shRNA22 no se limita a los CAC es importante, porque cuando se trata de eliminar un tumor también hay que dirigirse a las células del estroma del tumor y microglia ya que estas células contribuyen al mantenimiento y progresión tumoral. El uso de este shRNA solo o en combinación con otros fármacos puede representar una estrategia terapéutica potencial clínico.
Materiales y Métodos
Declaración de cuidado de los animales
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con la legislación y las directrices para el cuidado de los animales y gastos de envío en España (español Real Decreto 1201/2005 BOE publicado 21 de octubre de 2005), y los de la Unión Europea (2003/65 /CE del Parlamento Europeo y del Consejo julio de 2003) . El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad Autónoma de Madrid (permiso asociado para proyectar SAF 2009 a 07.259 expedida en Madrid 11
de marzo de 2009) y por el Comité Institucional de Bioseguridad CBMSO. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con gas isofluorano, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Declaración de
consentimiento del paciente
Se obtuvieron dos nuevas líneas de células madre del cáncer (CSC-5 y los CAC-7 ) a partir de glioblastoma primario especímenes quirúrgicos de pacientes sometidos a resección para el glioma recién diagnosticada de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de ética Institucional del hospital Ramón y Cajal. El consentimiento informado por escrito para utilizar el exceso de tejido para la investigación se obtuvo de cada paciente, y los tejidos sin identificación, para proteger el anonimato, se utilizaron (permiso asociado para proyectar SAF 2.009 a 07.259, expedida en Madrid el 26
de febrero de 2009, España .)
Declaración de datos de microarrays
Todos los datos presentados aquí es compatible con MIAME y los datos en bruto ha sido depositado en la base de datos compatible GEO (número de acceso: GSE30448)
. el aislamiento celular y la Cultura y
las nuevas culturas, las CSC-5 y los CAC-7, se establecieron a partir de muestras quirúrgicas recientes recogidas directamente de la sala de operaciones en PBS más 0,6% de glucosa e inmediatamente transportados en hielo a la célula sala de cultivo y se procesó como sigue: las piezas de tumor se lavaron y se desmenuzaron finamente con unas tijeras pequeñas, a continuación, se incubaron en 0,1% de tripsina y 0,04% de DNasa (tipo II, Sigma) en PBS durante 1 h a 37 ° C . tejido digerido se lavó dos veces y mecánicamente disociarse al pasar a través pippetes Pasteur pulida al fuego.