Extracto
fisión mitocondrial es un proceso que implica la escisión de las mitocondrias en fragmentos más pequeños y está regulada por la proteína relacionada con el Dinamina GTPasa 1 (Drp1). Los niveles más altos de la fisión mitocondrial se asocian con la inducción de apoptosis en células de cáncer. Sin embargo, los métodos actuales para cuantificar con precisión la fisión mitocondrial con el fin de comparar los productos terapéuticos que se dirigen a este proceso a menudo son ambiguas o se basan en la evaluación subjetiva. Las mitocondrias también son propensos a la agregación, lo que hace difícil un análisis preciso. Aquí se describe un enfoque mejorado para la cuantificación de la fragmentación mitocondrial que implica varias diferencias con los métodos actualmente existentes. Las células se sometieron a centrifugación primera citológico, lo que reduce la altura del eje z celular y se dispersa mitocondrias individuales para la observación más fácil. Tres herramientas de análisis de fluorescencia comercialmente disponibles se aplican a continuación para eliminar la ambigüedad restantes grupos mitocondriales que requieren una inspección más detallada. Finalmente, se aplica de puntuación de corte, que puede ser adaptado a tipo de célula individual. El enfoque resultante permite la evaluación eficiente y objetivo de la fragmentación mitocondrial en respuesta al tratamiento. Hemos aplicado esta técnica a una pregunta experimental con células sensibles a la quimioterapia y chemoresistant cáncer de ovario (Ovča). Se encontraron cisplatino y la piperlongumine fitoquímico para inducir tanto la fisión mitocondrial y la apoptosis en las células sensibles a la quimioterapia, mientras que sólo piperlongumine era capaz de inducir estas respuestas celulares en las células quimiorresistentes. apoptosis inducida por Piperlongumine parecía estar mediada por la fisión mitocondrial Drp1 dependiente ya que la respuesta apoptótica fue atenuada por la presencia del inhibidor de Drp1 mDivi-1. Nuestro estudio proporciona bases para una visión más objetiva de la cuantificación de la fragmentación mitocondrial, y arroja más luz sobre un posible mecanismo de acción para piperlongumine en el tratamiento de quimioresistente OVCA
Visto:. Farrand L, Kim JY, Im Un -Aram, Suh JY, Lee HJ, Tsang BK (2013) Un enfoque cuantitativo mejorado para la Evaluación de la fragmentación mitocondrial en células chemoresistant cáncer de ovario. PLoS ONE 8 (9): e74008. doi: 10.1371 /journal.pone.0074008
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Mayo, 2013; Aceptado: July 29, 2013; Publicado: 9 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Farrand et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del programa de la Universidad de Clase Mundial (WCU) (R31-10056) a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea, financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología y los Institutos canadienses de Investigación en Salud (RP-119381). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las mitocondrias son orgánulos dinámicas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas que se someten a los procesos de fisión (dividiendo en estructuras separadas) y de fusión (fusión de dos o más adyacentes estructuras). La fisión se sabe que preceder a la apoptosis en varios tipos de células, y se cree que facilitar una liberación rápida más de factores pro-apoptóticos mitocondriales, incluyendo citocromo c y SMAC [1]. Sin embargo, la cuantificación exacta de la fisión mitocondrial es técnicamente difícil debido a la gran cantidad presente en muchos tipos de células, y sus características morfológicas. Las células suelen presentar diferentes grados de fisión en función del tipo de célula y el contexto del medio ambiente [2]
La mayoría de los enfoques actuales para la evaluación cuantitativa de la fisión mitocondrial son variaciones de dos estrategias generales [2] - [7]. . El primer enfoque requiere la medición de las longitudes de las mitocondrias individuales para determinar el grado de fisión [3] - [5]. Hemos encontrado que la agregación de las mitocondrias [6], [7], especialmente de bobinado y el anudado de las estructuras [8], así como el gran número de fragmentos mitocondriales dentro de cada célula hace este enfoque poco práctico para al menos algunos tipos de células. También no tiene en cuenta la estructura de 3 dimensiones de las mitocondrias dentro de las células, que no permite la medición a lo largo del eje z, si se utiliza una sola imagen de 2 dimensiones. Otro enfoque requiere la apreciación subjetiva de la morfología mitocondrial, y requiere el operador para mostrar imágenes que tengan la consideración de representante de las células con mitocondrias tubulares o fragmentados (otros términos utilizados para describir la morfología incluir alargada, fundido, intermedio, marcado y 'granulada') . La cuantificación utilizando este enfoque se basa fundamentalmente en las opiniones del observador, y cada célula se clasifica según el cual la imagen representativa que se asemeja más a [9] - [11]. Una preocupación importante en la aplicación de esta técnica es su dependencia de la decisión subjetiva que introduce variabilidad entre observadores individuales. inmunocitoquímica tradicional en vasos septadas también produce imágenes que normalmente contienen al menos algunas mitocondrias que están fuera de foco en imágenes de fluorescencia, y por lo tanto, la representación incompleta de todo el espécimen
.
El objetivo del presente estudio fue desarrollar una mejor método para cuantificar el grado de fragmentación mitocondrial en las células, y para aplicar este enfoque en la comparación de la influencia de la piperlongumine fitoquímico en la fisión mitocondrial en células de cáncer de ovario sensibles a la quimioterapia y chemoresistant
in vitro
. Mientras que la cuantificación de la fragmentación mitocondrial podría concebiblemente dar cuenta de pequeños fragmentos mitocondriales que aparecen debido a la síntesis de nuevas mitocondrias y la fragmentación causada por mitofagia, cuando se combina con una validación adicional utilizando marcadores apropiados, una mejor evaluación de la extensión de la fisión mitocondrial se pueden hacer. Nuestro método implica centrifugación citológico que captura las células apoptóticas y sanos, utilizando imágenes en 3 dimensiones (mediante microscopia láser confocal z-apilamiento), y produce células aplanadas con mitocondrias dispersas que son más fáciles de distinguir cuando se toman imágenes. En los casos de agregación mitocondrial, tres herramientas de software disponibles en el mercado (Intensidad de fluorescencia de perfiles, ortogonal Seccionado, y cartografía de calor) se utilizan para eliminar la ambigüedad de los grupos e identificar los números de las mitocondrias individuales. Además, se aplica una técnica de puntuación de corte para evaluar de manera más eficiente las células como siendo fragmentada o tubular.
Hemos tratado de demostrar la aplicación práctica de nuestro nuevo enfoque, al usarla para investigar el papel de la mitocondria fisión en el cáncer de ovario quimioresistente (OVCA). La resistencia a CDDP (cisplatino: cis-diaminodicloroplatino (II)) en el cáncer de ovario es un obstáculo importante para el éxito del tratamiento [12]. Mientras que la participación de las mitocondrias en la apoptosis mediada por caspasa se ha investigado extensivamente, el papel de la morfología mitocondrial en quimiorresistencia queda por entendido completamente. Piperlongumine es un componente natural de la pimienta larga (
Piper longum L.
) y se ha informado que exhiben una serie de efectos bioactivos incluyendo la inhibición de la agregación plaquetaria [13], la regulación por disminución de los receptores de andrógenos [14] y amplios efectos contra una gama de tipos celulares de cáncer quimiorresistentes a través de la inducción de especies reactivas de oxígeno [15]. Hemos aplicado el enfoque cuantitativo descrito anteriormente para comparar los efectos de CDDP y piperlongumine sobre la fisión mitocondrial y la apoptosis en líneas celulares sensibles a la quimioterapia y Ovča chemoresistant.
Materiales y Métodos
Reactivos
CDDP se adquirió de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.). Piperlongumine se adquirió de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido). Anti-GAPDH, anti-Drp1 y (Ser637)-anticuerpos anti-fosfo Drp1 eran de Señalización Celular Tecnología (Beverly, CA, EE.UU.). anticuerpo anti-Tom20 era de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EE.UU.). Alexa Fluor ® 488 anticuerpo secundario, TEMED, RPMI 1640 los medios de cultivo, suero bovino fetal y Reactivo Antifade Oro a prolongar con DAPI eran de Life Technologies (Carlsbad, CA, EE.UU.). Todos los anticuerpos se diluyeron en Dako Antibody Diluent (Dako#s0809) de Agilent Technologies (Glostrup, Dinamarca). Completos comprimidos de cóctel inhibidor de la proteasa y los mini PhosStop inhibidores de la fosfatasa cóctel comprimidos se obtuvieron de Roche Applied Sciences (Penzberg, Alemania).
Líneas celulares y Cultura y
CDDP-sensibles línea celular humana OVCA (OV2008) [16] y su homólogo resistentes (C13 *) [17] fueron regalos de los Dres Rakesh Goel y Barbara Vanderhyden (hospital de Ottawa Centro del cáncer, Ottawa, ON, Canadá), y se cultivaron como se informó anteriormente [18]. Ellos son de origen adenocarcinoma endometrioide del ovario con diferenciación escamosa.
Anexina V Apoptosis ensayo
Ovča células fueron teñidas con FITC-conjugado de Anexina V (Bioline, Londres, Reino Unido) y yoduro de propidio para determinar la proporción de las células que estaban en las fases tempranas y tardías de la apoptosis [19]. Las células teñidas se analizaron a continuación utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur BD (BD Biosciences) y el software CellQuest /ModFit.
Immunoblotting y microscopía de inmunofluorescencia
La inmunotransferencia se realizó como se describió anteriormente [18]. banda densidades se analizaron y cuantificaron usando un BioRad XRS ChemiDoc + y V3.0 Image Lab (Hercules, CA, EE.UU.). células OV2008 se fijaron con 4% de paraformaldehído en portaobjetos de cámara de 8 pocillos, se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia apropiados y se tiñeron con prolongar Reactivo Antifade oro con DAPI (azul, mancha nuclear). Ellos fueron imágenes inmediatamente con un microscopio confocal Zeiss LSM700 de barrido equipado con una cámara digital Zeiss T-PMT (Zeiss, Oberkochen, Alemania).
citológico La centrifugación y la fijación de las células
Las células fueron sembradas para 12 h en medio RPMI suplementado con 10% de SFB en placas de 6 pocillos. Después del tratamiento con agentes de ensayo apropiados, que se recogieron después de 2 minutos de incubación con 0,025% de tripsina (200 l) a 37 ° C. La tripsinización se realizó rápidamente para minimizar el daño mitocondrial y la reacción se detuvo con la adición de 10% de SFB en medio RPMI 1640. Las células se lavaron suavemente con 1 ml de PBS (900 ×
g
, 1 min; todos PBS se filtró con un filtro de 0,45 micrómetros jeringa; Sartorius Biotecnología, Goettingen, Alemania) y el sedimento celular se resuspendió con cuidado en 500 l de PBS fresco. Cincuenta microlitros de la suspensión se centrifugó (900 ×
g
, 4 min) usando citológico embudos junto con silano revestido con diapositivas de vidrio y papel de filtro Whatman (Hanil Ciencia Cytospin centrífuga citológica; Daejeon, Corea). Las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante 24 h. Posteriormente fueron lavadas (3 × 5 min) en PBS con agitación suave, se permeabilizaron con 0,02% de Triton-X diluido en PBS (se incubaron durante 10 min a 4 ° C) y se someten a otro ciclo de lavado PBS (3 × 5 min). Las células se incubaron con Tom20 (mitocondrial subunidad del receptor de importación) anticuerpo (1:250, 24 h, 4 ° C), se lavaron con PBS y se incubaron con Alexa Fluor® 488 anticuerpo secundario (temperatura ambiente, 1 h). Las células fueron lavadas en PBS antes de la fijación con una hoja de la cubierta usando el reactivo prolongar la Antifade Oro con DAPI, y la imagen confocal comenzaron inmediatamente.
La cuantificación de la fisión mitocondrial
Después de la centrifugación citológico, la fijación y la inmunotinción de las células, imágenes 3-dimensionales de las células individuales se obtuvieron usando microscopía confocal mediante la superposición de al menos 12 imágenes en sección transversal tomadas en incrementos a lo largo del eje Z y que abarca todo el volumen de la celda. ajustes de exposición estándar implicaron una permanencia de píxel de & gt; 50 microsegundos y las dimensiones del campo de 300 × 300 micrómetros. Un mínimo de 100 células por grupo de tratamiento se evaluaron para la fisión mitocondrial en cada réplica, con estadísticas derivadas de tres repeticiones independientes. Cada célula individual analizada se clasifica como fragmentada o no fragmentada, de acuerdo con el hecho de que se reunió con el punto de corte de 8. Las células que cumple la definición de 'fragmentado' por lo tanto, contenía 8 o más fragmentos mitocondriales individuales que eran cada & lt; 3 micrómetros de longitud a través del eje más largo. En caso de ambigüedad debido a la agregación de las mitocondrias, tres herramientas de software disponibles en el mercado incluyen en el paquete de software Zeiss LSM (Intensidad de fluorescencia de perfiles, ortogonal y Secciones Mapeo de calor) se utilizaron para resolver las incertidumbres. Profiling Intensidad de fluorescencia permite la detección de límites mitocondriales marcados con fluorescencia (marcado con Tom20), como se refleja en los aumentos agudos o disminuciones en la intensidad de fluorescencia [20]. El operador traza una línea recta a través de cualquier región de la imagen, y un gráfico automatizado de la intensidad de la fluorescencia se construye. Seccionamiento ortogonal permite a cualquier región en la imagen para ser inspeccionado desde un x- o eje y punto de vista en el punto de (POV). Esto crea una perspectiva transversal virtual y proporciona información sobre los límites mitocondriales que normalmente se oscurecían si se ve desde el Punto de vista de arriba hacia abajo tradicional. Asignación de calor códigos de color de todos los objetos fluorescentes dentro de una imagen de 3 dimensiones de acuerdo con la posición del objeto a lo largo del eje z. En las mitocondrias visualizar, la herramienta es más útil para distinguir las mitocondrias separadas que se encuentran en lados opuestos del núcleo (y de otro modo aparecerían mitocondrias como singular). En la mayoría de los casos, no se necesitan estas herramientas para reconocer las mitocondrias fragmentado, como centrifugación citológico dispersa los orgánulos para facilitar la visualización. Se determinó la morfología mitocondrial de al menos 80 células por grupo de tratamiento, con el observador ciego a la identidad de los grupos de tratamiento. Cuantificaciones se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. El análisis estadístico se llevó a cabo por una sola vía, de dos vías o de tres vías de análisis de varianza, utilizando el software Sigma Plot (Versiones 12; Systat Software, Chicago, IL, EE.UU.). Las diferencias entre los múltiples grupos experimentales se determinaron por la prueba post-hoc de Bonferroni. La significación estadística se infiere a
p
. & lt; 0,05
Resultados
citológico centrifugación Mejora de imagen mitocondrial al aumentar la separación entre individuo Distancias Las mitocondrias
En primer lugar, compararon los efectos de la centrifugación citológico en la calidad de imagen confocal de las mitocondrias. Optimización reveló que la configuración del rotor ideales de la centrífuga citológica para imágenes de células OV2008 incluyen un g giro 900 × durante 4 minutos. Todos los experimentos posteriores se realizaron utilizando estos ajustes. En ausencia de la etapa de centrifugación, se observaron mitocondrias a agregarse estrechamente al núcleo y a curvarse hacia el ángulo de la lente de visión (Figura 1, Figura S1A). perfilado lateral de las células sin centrifugación reveló una altura grande del eje Z de al menos 8 micrómetros, haciendo distinción individual de mitocondrias separadas difícil. Con la inclusión de una etapa de centrifugación, las mitocondrias se separaron más del núcleo, y el aumento de las distancias entre las mitocondrias surgieron individuales. células centrifugadas exhibieron una altura del eje z reducida de aproximadamente 3 micrómetros, lo que resulta en una observación más fácil de las estructuras mitocondriales individuales (Figura 1B, las Figuras S1B-C). Una comparación de la calidad de la imagen con y sin centrifugación, utilizando la configuración de imágenes idénticas, reveló que centrifugación mejoró la claridad general de las funciones mitocondriales (Figura 1C). Esto era debido, en parte, al hecho de que sin centrifugación, las imágenes fluorescentes incluyen un mayor grado de fluorescencia de fondo "fuera de foco" (es decir. De la mitocondria que no eran claramente visibles dentro del plano del eje z en la que el imagen fue tomada). Centrifugación mejora enfoque de la imagen mediante el aplanamiento de las funciones celulares en el mismo plano focal.
(A) 3-dimensionales vista superior y lateral de los perfiles de las células OV2008 no tratados, con y sin centrifugación citológico antes de la fijación. Las flechas amarillas indican las zonas típicas de la separación entre las mitocondrias que aparecen después de la centrifugación. (B) una sección ortogonal de las mismas imágenes que se ven en (A) tomadas con los ajustes de exposición de la cámara idénticos. Las células fueron fijadas en paraformaldehído al 3,7% y se tiñeron para nuclear (DAPI, azul) y la señal (Tom20, verde) mitocondrial. (C) Comparación de la calidad de la imagen mitocondrial entre inmunocitoquímica convencional y los enfoques de centrifugación citológicas. Imágenes de tubular clásica y la morfología mitocondrial fragmentada se vuelve visiblemente más agudo después de la centrifugación debido a la reducción al mínimo de la fluorescencia procedente de fuentes fondo más allá del plano focal. La ampliación del núcleo después de la centrifugación se debe a aplanamiento de las células por la fuerza centrípeta. Las barras de escala = 5 micras.
Intensidad de fluorescencia de perfiles, ortogonal sección y mapas de calor en Herramientas Permiten una distinción rápida de fragmentos individuales mitocondrial dentro de los agregados
Hemos tomado nota de que, aunque la etapa de centrifugación mejorado nuestra capacidad de distinguir las mitocondrias, en algunos casos, la agregación de las mitocondrias apareció inevitables a pesar de los esfuerzos para resolver el problema. Adoptamos tres herramientas de análisis de fluorescencia (Intensidad de fluorescencia de perfiles, ortogonal y Secciones de mapeo de calor) como complemento a la cuantificación de las mitocondrias presentes dentro de los agregados. Estas herramientas proporcionan una mayor información sobre la orientación espacial de las membranas mitocondriales, lo que permite desambiguación de señal fluorescente que de otro modo puede parecer confuso. La intensidad de fluorescencia de perfiles (Zeiss LSM paquete de software) es una herramienta que normalmente se utiliza para determinar las relaciones de señal a fondo en todas las regiones fluorescentes de una imagen [20]. Esta herramienta se puede utilizar alternativamente para determinar el número de mitocondrias individuales dentro de un agregado, como la intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional al número de las membranas mitocondriales. Uso de superposiciones transparentes, el número de mitocondrias se puede extrapolar en grandes grupos por simple división de la señal de pico de la intensidad de la fluorescencia obtenida a partir de una sola mitocondria (Figura 2A). Mapeo de calor proporciona información sobre eje z ubicaciones mitocondriales utilizando un espectro de un código de colores (Figura 2B, las Figuras S2A-C) [21]. Las mitocondrias que se superponen o aplanada detrás o delante del núcleo se pueden identificar fácilmente en función de su asignación de color. Finalmente, ortogonal Seccionamiento (Zeiss LSM) proporciona vistas en sección transversal de cualquier ubicación-x y desde una perspectiva perpendicular al eje z, lo que permite la inspección cercana de los límites mitocondriales que de otro modo quedar ocultas desde un punto de vista tradicional de arriba hacia abajo (Figura 2C). En resolución suficientemente alta, y con la expansión óptima del citoplasma a través de la etapa de centrifugación, se encontró que estas herramientas de fluorescencia solamente se requieren en & gt; 10% de los casos, en los que no podría lograrse una decisión debido a la agregación mitocondrial irregular. El uso efectivo de estas herramientas dependen de varios supuestos, por ejemplo, que todas las mitocondrias en un agregado son igualmente manchadas, que la señal fluorescente tiene una señal suficiente a ruido y que las membranas mitocondriales son distinguibles por los cambios en la señal fluorescente correspondiente.
(a) intensidad de fluorescencia de perfiles de una sola célula con mitocondrias fragmentados. La intensidad de la señal mitocondrial a lo largo de un perfil lineal seleccionada por el operador (flecha azul claro) se representa cuantitativamente. pico (i) Emisión de una sola mitocondria se indica de forma gráfica (flecha amarilla). (Ii) las mitocondrias separados son evidentes como picos independientes. (Iii) los picos más altos (flecha amarilla) sugieren la presencia de mitocondrias múltiple, superpuesta durante la centrifugación. datos de imagen 3D se acoda de forma transparente, con número de mitocondrial individuo siendo directamente proporcional a la intensidad de fluorescencia. mapeo (B) de calor de una sola célula tratados con CDDP (10 M, 12 h). Las diferencias en los valores de ubicación del eje z de los fragmentos mitocondriales se representan como colores. (I) Ampliación (caja amarilla) que revela distinta mitocondrias a diferentes alturas de eje z (verde) vs naranja. (Ii) La vista reverso de la misma célula en (i), indicando además fragmentos individuales (cian vs flecha azul, amarillo). herramienta de la sección (C) ortogonal que muestra secciones transversales de una sola célula a lo largo del eje y (recuadro punteado cuadro amarillo, aumentan a medida que la caja verde) y el eje x (aumentan a medida que el cuadro rojo). Y. (i) Ampliación (caja verde) de la sección ortogonal del eje y. (Ii) Ampliación (cuadro rojo) de la sección ortogonal del eje x. Las flechas amarillas indican la separación de espacios mitocondrias individuales.
Aplicación de puntos de corte permite trazar una distinción entre las células que contienen diferentes grados de fisión mitocondrial
A pesar de que es posible determinar con precisión el número de mitocondrias en cualquier célula dada, es mucho tiempo y es poco práctico si la evaluación de un gran número de células. A continuación realizamos un método semi-cuantitativo para una evaluación intensiva en trabajo más eficiente y menos de las imágenes. Se procedió mediante la evaluación del fenotipo mitocondrial (tubular o fragmentada) en base a un punto de corte definido por un número mínimo de fragmentos mitocondriales de una longitud definida presente en cada célula. El rigor de la clasificación está determinada por el punto de corte elegido (Figura 3). Si se han encontrado 8 o más mitocondrias que eran cada uno de menos de 3 micrómetros de longitud en cualquier lugar en la célula, la célula entera calificaría como "fragmentado". Cumplimiento de los criterios hace una nueva evaluación de las mitocondrias restantes innecesarios (que se muestra en la Figura 3).
La figura muestra tres células con diferentes grados de fisión. (I) Un punto de corte de 2 (resultado es "sí", si 2 o más fragmentos mitocondriales que se detectan son & lt; 3 micrómetros de longitud a través del eje más largo) pone los 3 tipos de células en la misma categoría. (Ii) Un punto de corte elevado a 5 se distingue de la celda Una tan diferentes de las células B y C (un criterio de clasificación de la celda Una como "tubular") (c) Un punto de corte de 10 plazas de células A y B en la misma categoría, distinta de la célula C. el uso de más de un punto de corte permite la distinción de grados variables de la fisión mitocondrial.
quimiosensibilidad a CDDP y Piperlongumine se asocia con mitocondrial fisión
Se aplicaron próximo esta técnica para investigar la influencia de piperlongumine y CDDP (0 y 10 M, 12 h) en la fisión mitocondrial en sensible a la quimioterapia (OV2008) y células quimiorresistente (C13) Ovča (Figura 4). Ambos compuestos causaron aumentos en la fisión mitocondrial y la apoptosis de una manera dependiente de la concentración en OV2008. Sin embargo, sólo piperlongumine tuvo el mismo efecto en C13, lo que sugiere que este último no sólo promueve la apoptosis, sino también induce la fisión mitocondrial en células Ovča quimiorresistentes. Un mínimo de 100 células por grupo de tratamiento se evaluaron para la fisión mitocondrial en cada réplica, con estadísticas derivadas de tres repeticiones independientes
.
(A) Imágenes representativas de las mitocondrias tubulares y fragmentadas en las células sensibles a la quimioterapia (OV2008) y su resistente homólogos (C13). Las mitocondrias y los núcleos se tiñeron con Tom20 (verde) y DAPI (azul), respectivamente. (B) Efecto de piperlongumine y CDDP en la fisión mitocondrial en células OV2008 y C13, tal como se evaluó con un único punto de corte de 8 (células que contienen 8 o más fragmentos mitocondriales & lt; 3 micrómetros de longitud fueron clasificados como mitocondrias fragmentado). (C) Efecto de CDDP y piperlongumine sobre la apoptosis, tal como se evaluó mediante el ensayo de anexina V (*,
p Hotel & lt; 0,05; **,
p Hotel & lt; 0,01; ***,
p
. & lt; 0,001 frente al respectivo control sin tratar) guía empresas
CDDP y Piperlongumine inducida mitocondrial y apoptosis de fisión son Drp1-dependiente en quimiosensible OVCA
en respuesta a varios tipos de estrés celular, Drp1 se activa mediante la desfosforilación en Ser637. Esto es seguido por su reclutamiento a la mitocondria donde se oligomeriza para proporcionar la resistencia mecánica necesaria para la fisión que se produzca [22]. La hipótesis de que si la fisión mitocondrial Drp1 dependiente es un factor determinante de la respuesta sensible a la quimioterapia, tanto CDDP y piperlongumine tratamiento debe resultar en la desfosforilación de Drp1. Este fue de hecho el caso en las células OV2008 (Figura 5A). Más importante aún, el tratamiento de células OV2008 con un inhibidor farmacológico de Drp1, mDivi-1, atenuó significativamente tanto la fisión mitocondrial y la apoptosis inducida por los dos compuestos (Figura 5B). Estos datos apoyan un vínculo causal entre la fisión y la apoptosis. Un mínimo de 100 células por grupo de tratamiento se evaluaron para la fisión mitocondrial en cada réplica, con estadísticas derivadas de tres repeticiones independientes.
(A) CDDP (10 mM) y piperlongumine (10 M) las reguladas de fosfo -Drp1 (Ser637) contenido en las células OV2008
in vitro
. (B) (i) Efecto de la mDivi-1 (0-10 mM) en CDDP- y piperlongumine inducida por fisión mitocondrial y (ii) la apoptosis tal como se evaluó por el ensayo de Anexina V (**,
p
& lt; 0,01; ***,
p
& lt; 0,001 en comparación con el control respectivo DMSO tratados con idéntica concentración mDivi-1, #,
p
& lt; 0,05 frente a tratamiento respectivo PL o CDDP en ausencia de mDivi-1).
Drp1 dependiente de la fisión mitocondrial es un factor determinante de la apoptosis inducida por Piperlongumine en chemoresistant OVCA
Nuestros estudios anteriores han demostrado que la fisión mitocondrial está asociada con la quimiosensibilidad, mientras resistencia a CDDP está marcado por la falta de dicha actividad (Figura 4). A continuación trató de determinar si piperlongumine estaba causando la apoptosis en las células * C13 chemoresistant a través de la fisión mitocondrial Drp1-dependiente. el análisis de concentración-respuesta mostró que piperlongumine, pero no CDDP, desfosforilación inducida de Drp1 en Ser637 (Figura 6A). La adición del inhibidor de Drp1-mDivi-1 también parcialmente atenuada fisión piperlongumine inducida mitocondrial y la apoptosis (Figura 6B). Un mínimo de 100 células por grupo de tratamiento se evaluaron para la fisión mitocondrial en cada réplica, con estadísticas derivadas de tres repeticiones independientes.
(A) Piperlongumine pero no CDDP (0-10 mM) regula a la baja fosfo-Drp1 (Ser637) contenido. (B) (i) Efecto de la mDivi-1 (0-10 mM) en la fisión mitocondrial piperlongumine inducida y (ii) la apoptosis, como se evaluó por el ensayo de Anexina V (**, p & lt; 0,01; ***, p & lt; 0,001 frente al respectivo control de DMSO tratados con idéntica concentración mDivi-1, #,
p Hotel & lt; 0,05; ##,
p Hotel & lt; 0,01; ###,
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& lt; 0,001 frente al tratamiento respectivo PL o CDDP en ausencia de mDivi-1)) guía empresas
Discusión
bien diseñado Mientras que la cuantificación de la fisión mitocondrial se ha llevado a cabo en varios.. estudios, las descripciones de los enfoques publicados son algo ambiguo y subjetivo [2] - [7]. Observamos dos importantes dificultades para cuantificar con precisión la fisión. La primera es la agregación de las mitocondrias, en particular alrededor del núcleo, lo que hace distinción de orgánulos separados difícil. El segundo es el tiempo necesario para cuantificar la mitocondria, incluso si todos los fragmentos individuales pueden distinguirse utilizando técnicas de mapeo de 3 dimensiones avanzadas.
Reconocemos la existencia de varios métodos automatizados publicados que hemos investigado y encontrado para ser interesante. Sin embargo, creemos que estos métodos requieren un amplio conocimiento de fondo en algoritmos computacionales con el fin de ser utilizados con eficacia. Un método utiliza automatizado pulsante fluorescente a 30 Hz y el empleo de análisis asistido por ordenador [23]. En nuestro intento de seguir los pasos proporcionados por los investigadores, se encontró una considerable dificultad en la interpretación de una serie de instrucciones que requieren un conocimiento considerable de fondo, y fueron incapaces de tener éxito en la producción de datos significativos. La generación de una imagen binaria sintético como un modelo de prueba también requiere una amplia familiaridad con las dimensiones apropiadas de las mitocondrias en cada tipo de célula, un requisito no necesario para nuestro enfoque.
Otro enfoque computacional intrigante [24] implica subtipificación automatizado de la morfología mitocondrial. También hemos tratado de emplear el software microP escrita por los autores para nuestras necesidades experimentales, sin embargo, fue igualmente muy difícil para nosotros de aprender debido a la (conocimiento) técnico necesario. MicroP requiere al usuario calibrar correctamente el software antes de su uso.
En el presente estudio, hemos abordado la cuestión de la agregación mediante la aplicación de un paso citológico centrifugación, que se aplana el citoplasma lo largo del plano de la corredera y hace distinción mitocondrias de las individuales significativamente más fácil. La cuestión de la limitación de tiempo se abordó mediante la aplicación de la puntuación de corte para permitir la categorización de menos mano de obra intensiva de fenotipos mitocondriales. Si bien el método más preciso para la cuantificación de la fisión sería un recuento absoluto del número total de fragmentos individuales, el tiempo requerido hace que este enfoque poco práctico, sobre todo para los estudios con una muestra de gran tamaño. Nuestro enfoque propuesto permite la adquisición de datos de fisión mitocondrial comparable a la exigida en el diseño de los estudios anteriores [2] - [7], pero con directrices más específicas para la reproducibilidad independiente. Una visión general del nuevo enfoque se muestra en la Figura 7.
Si bien nuestro enfoque ofrece ventajas evidentes, también observamos varios peligros potenciales. La diversidad en la morfología mitocondrial a través de tipos de células es importante y puede requerir un ajuste fino y validación del protocolo. Por ejemplo, algunos tipos de células pueden tener un gran número de mitocondrias y un volumen relativamente bajo de citoplasma. En tales casos, puede ser necesaria la optimización cuidadosa de la etapa de centrífuga y un mayor número de imágenes del eje Z por célula. velocidades de centrifugación más altas mejoran la dispersión mitocondrial, pero también pueden promover la rotura del núcleo (que se muestra en la figura S3). También hemos intentado utilizar nuestro enfoque con
en Destinia.com muestras de tumores in vivo Ovča teñidas con Tom20, y se encontró que la incapacidad para centrifugar tumores sólidos combinados con la señal de fondo no específica excesiva hizo inviable.