Vacunas contra el cáncer Resumen
están diseñados para expandir las células T específicas de antígeno tumorales con la función efectora. Sin embargo, también pueden ampliar inadvertidamente células T reguladoras (Treg), lo que podría obstaculizar seriamente la eficacia clínica. Para hacer frente a esta posibilidad, hemos desarrollado un nuevo ensayo para detectar antígeno-específica de Treg sobre la base de la baja regulación de CD3 superficie siguiendo TCR compromiso, y utilizó este enfoque para la detección de Treg específicas para el antígeno tumoral NY-ESO-1 en pacientes con melanoma tratados con la vacuna contra el cáncer TM NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
. Todos los pacientes tenían probados Treg (CD25
brillante FoxP3
+ CD127
neg) específico para al menos un NY-ESO-1 epítopo en la sangre. Sorprendentemente, la comparación con muestras de pre-tratamiento reveló que muchas de estas respuestas fueron inducidos o realzada por la vacunación. La respuesta más frecuentemente detectado fue hacia la restringidos por HLA-DP4 NY-ESO-1
157-170 epítopo, que también es reconocido por las células T efectoras. En particular, funcional específica de Treg para un epítopo restringido por HLA-DR en el NY-ESO-1
115-132 péptido también se identificaron a alta frecuencia en el tejido tumoral, lo que sugiere que NY-ESO-1 específica de Treg puede suprimir locales las respuestas inmunes anti-tumorales. En conjunto, nuestros datos proporcionan evidencia convincente para la capacidad de una vacuna contra el cáncer de ampliar Treg antígenos tumorales específicos en el cáncer avanzado, un hallazgo que se debe dar seria consideración en el diseño de los ensayos clínicos de vacunas contra el cáncer en el futuro.
Visto: Ebert LM, MacRaild SE, Zanker D, Davis ID, J Cebon, Chen W (2012) un cáncer de vacuna induce expansión de NY-ESO-1-específica las células T reguladoras en pacientes con melanoma avanzado. PLoS ONE 7 (10): e48424. doi: 10.1371 /journal.pone.0048424
Editor: Derya Unutmaz, Universidad de Nueva York, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Junio, 2012; Aceptado: September 25, 2012; Publicado: 26 Octubre 2012
Derechos de Autor © 2012 Ebert et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas Cancer Council Victoria en LE (603103, 433626), un Nacional de Salud y Consejo de Investigación médica (NHMRC) subvención del proyecto a WC (433.608) y el apoyo a la infraestructura operativa del Gobierno del Estado de Victoria. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
vacunas contra el cáncer son muy prometedores en el tratamiento de tumores sólidos tales como melanoma, y han sido el centro de pruebas pre-clínica y clínica extensa en los últimos años. Debido a su excepcional inmunogenicidad, NY-ESO-1 se ha convertido en uno de los objetivos más prometedores de estos enfoques [1]. En los últimos años, hemos llevado a cabo una serie de ensayos clínicos en pacientes con melanoma utilizando una vacuna contra el cáncer que consiste en la proteína recombinante de longitud completa NY-ESO-1 formulado con ISCOMATRIX
TM adyuvante (CSL Limited, Australia). A pesar de que esta vacuna tiene efectos antitumorales potentes en estudios preclínicos con animales [2] y mostró resultados prometedores en la fase inicial que estudio [3], que no logró mejorar significativamente el resultado clínico en pacientes con melanoma en ensayos posteriores [4] y manuscrito en la preparación de). Por otra parte, mientras que los pacientes con completamente resecado (principio de su carrera) enfermedad desarrollaron fuertes respuestas de células T efectoras (teff) a NY-ESO-1 después de la vacunación [3], [5], los pacientes con melanoma avanzado tenían respuestas mucho menos robustos [4] .
al igual que en nuestra experiencia con el NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
TM vacuna, muchas otras vacunas contra el cáncer también han fallado para inducir un beneficio clínico significativo, a menudo a pesar de la inducción de tumor aparentemente potente antígeno-específica respuestas de teff [6], [7]. Hay muchas explicaciones posibles para esto, pero uno que ha sido objeto de especial atención en los últimos años se centra alrededor de la función de las células CD4
+ CD25
+ FoxP3
+ células T reguladoras (Treg). Treg son esenciales para la prevención de la autoinmunidad [8]. Sin embargo, un creciente cuerpo de evidencia apoya el concepto de que Treg también puede bloquear la generación de inmunidad antitumoral eficaz [9]. Por tanto, es imperativo que los enfoques de vacunas del cáncer de evitar la expansión de estas células
.
Hasta hace poco, la evidencia para el reconocimiento de antígenos tumorales por Treg habían sido escasos, y no estaba claro si o no Treg se activaría y expandirse en respuesta a la vacunación contra antígenos tumorales. En los últimos años, sin embargo, un número de informes han identificado Treg específicas para una variedad de antígenos tumorales en el cáncer humano, incluyendo NY-ESO-1, survivin, TRP-1, gp100, MAGE-A3, Melan-A, carcinoembrionario Ag ( CEA), la telomerasa, HER2 /neu, WT-1, MUC-1 y virus del papiloma antígenos E6 y E7 [10] - [16]. La presencia de estas células en los pacientes con cáncer plantea serias preocupaciones sobre el potencial de las vacunas contra el cáncer para expandir no sólo teff sino también Treg. La medida en que esto ocurre en realidad, sin embargo, es poco conocida.
En el presente estudio, hemos evaluado el efecto de la vacunación con NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
TM de la frecuencia de NY- -ESO-1 específica de Treg en pacientes con melanoma en etapa tardía. Como la mayoría de Treg no producen citoquinas tras la activación [17] - [19], no existe actualmente ningún ensayo adecuado disponible para detectar la Treg específicas de antígenos. Por ello, hemos desarrollado un novedoso enfoque sistemático en el que el antígeno específico de Treg son detectados por la baja regulación de los receptores de células T superficie (TCR) /CD3 complejos siguiente
in vitro
estimulación con una biblioteca de péptidos antigénicos cortos. La optimización de este método ha sido descrito recientemente [20]. En este caso, hemos utilizado este método para la detección de NY-ESO-1 específica de Treg en pacientes con melanoma, antes y después de la vacunación con la vacuna TM NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
. Este estudio nos ha permitido obtener una comprensión sin precedentes de antígenos tumorales específicos de Treg en el cáncer avanzado, incluyendo su función, la ubicación, la gama de epítopos reconocidos y cómo su frecuencia se ve afectada por la vacunación.
Resultados
un nuevo enfoque basado en la baja regulación de CD3 de superficie detecta teff y Treg específicas para NY-ESO-1 péptidos
con el fin de detectar NY-ESO-1 específica de Treg en una de manera imparcial, hemos desarrollado un ensayo basado en el principio de que las células T hacia abajo-modulan el número de complejos de CD3 /TCR en la superficie celular después de la unión de antígeno afín [21], [22]. Esto se puede detectar como un nivel reducido de la tinción de CD3 de superficie celular por citometría de flujo. Debido a su escasez, NY-ESO-1 específica de teff casi nunca se puede detectar directamente
ex vivo en muestras de sangre utilizando la metodología estándar (IFN-γ intracelular tinción de citoquinas) sino que requieren la expansión previa
In
vitro. Los estudios preliminares revelaron que este fue también el caso de NY-ESO-1 específica de Treg detectó usando el método de CD3 baja regulación (observaciones no publicadas). En consecuencia, el paciente se cultivaron PBMC con un panel de 28 péptidos de 18 aminoácidos que se superponen parcialmente que abarcan colectivamente toda la secuencia de NY-ESO-1 [23], para permitir la expansión de NY-ESO-1-específica Teff y Treg a las frecuencias detectables . Condiciones, incluyendo tiempo de cultivo, la concentración de IL-2 y la fuente de suero, se optimizaron para Treg expansión [20]. Después 21d expansión, los cultivos se volvieron a estimular con péptidos individuales 18mer y el nivel de superficie CD3 determinada por citometría de flujo, en relación con la tinción para los marcadores de Treg.
Un ejemplo de los resultados obtenidos se muestra en la Figura 1. estos datos demuestran que una población clara de putativo Treg se pudo detectar en el CD4
+ población de células T por la co-tinción para CD25 y FoxP3 (Fig 1A, izquierda). Dentro de este subconjunto de Treg, una clara subpoblación de células CD3-baja (específicas de antígeno) fue evidente después de la re-estimulación con péptido NY-ESO-1
157 a 174, pero no NY-ESO-1
127 -144 o en ausencia de re-estimulación (Fig 1A, paneles superiores). Por el contrario, una subpoblación CD3-baja podría ser detectado dentro del subconjunto de teff tras la re-estimulación con péptido NY-ESO-1
127 a 144, pero no NY-ESO-1
157 a 174 (figura 1A, paneles inferiores). Un resumen de los resultados de este paciente utilizando los 28 péptidos demuestra dos respuestas distintas Treg, dentro de las regiones NY-ESO-1
37-60 y NY-ESO-1
157-180 (figura 1B), y uno de los principales teff respuesta, dentro de la región de NY-ESO-1
127-144 (figura 1C).
CD3
. PBMC de paciente 113 se cultivaron con agrupados NY-ESO-1 péptidos 18mer como se describe en
Métodos
, seguida por la re-estimulación con los péptidos individuales indicados durante el cultivo durante la noche para permitir CD3 baja regulación. Las células se tiñeron con anticuerpos contra CD4, CD25, CD3 y FoxP3 y se analizaron por citometría de flujo. (
Un
): un ejemplo de los patrones de tinción observado, que ilustra la compuerta de Treg y teff (en las células T CD4 cerradas viables
) y la baja regulación de CD3 dentro de cada población. (
B Opiniones -
C
): Un resumen de las respuestas detectadas dentro del Treg (B) y las poblaciones de teff (C). Las líneas de puntos indican el nivel basal de células CD3-baja (nula condición péptido).
Otro objetivo fue analizar el perfil de producción de citocinas de NY-ESO-1-Treg específicas de cada cuatro pacientes cuyos Treg abajo -regulated CD3 en respuesta a NY-ESO-1 péptidos, utilizando tinción intracelular de citoquinas. CD3-baja Treg produce niveles bajos o indetectables de IL-4, IL-10 e IL-17 en todos los pacientes. Sin embargo, la producción de IFN-γ y TNF-α fue variable, con dos pacientes que muestra la producción insignificante por el Treg CD3-baja, y dos pacientes que presentaban altos niveles de producción (Figura S1). La secreción de citoquinas pro-inflamatorias tales como IFN-γ por Treg se ha descrito anteriormente [16], [24] - [26], y parece ser una característica única de Treg identificado en pacientes con cáncer. Sin embargo, nuestros resultados muestran que esta característica es esporádica, y no puede ser invocado por la identificación de Treg.
Las células identificadas por el CD25
+ FoxP3
+ fenotipo tener fenotípicas y funcionales características de Treg
Tanto CD25 y FoxP3 son conocidos por ser inducido transitoriamente en teff después de la activación, lo que significa que activa teff potencialmente puede ser confundido con Treg [27] - [30]. Dado el periodo de cultivo extendido utilizada (21d), es poco probable que las células identificadas como CD4
+ CD25
+ FoxP3
+ en nuestro sistema de cultivo representan activan Teff, ya que la expresión de FoxP3, y en menor medida CD25, vuelve a la línea base después de ~ 10 días [12], [27], [28], [30]. Sin embargo, para demostrar, además, que estas células son de hecho Treg, los cultivos se co-tiñeron con un anticuerpo para CD127, que se expresa en niveles muy reducidos en comparación con Treg Teff [31], [32]. La figura 2A demuestra que las células identificadas como Treg (CD4
+ CD25
+ FoxP3
+) expresaron niveles apenas detectables de CD127, mientras que las células identificadas como teff (CD4
+ FoxP3
-) expresó uniformemente altos niveles. Por otra parte, cuando mayor Treg eran FACS-ordenados desde 21d culturas (de acuerdo con un CD4
+ CD25
+ CD127
- /baja fenotipo), estas células inducidas una disminución dependiente de la dosis en la proliferación de las células CD8
+ células T (figura 2B)
paciente PBMC se cultivaron durante 21d con NY-ESO-1 péptido (s) 18mer conocido a partir de estudios preliminares para inducir una respuesta Treg y luego:. (
a
) analizaron para la expresión de CD127 mediante citometría de flujo, se active en Treg (CD4
+ CD25
+ FoxP3
+) o teff (CD4
+ FoxP3
-) como se indica. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos con resultados similares; o (
B Opiniones): Treg se purificaron mediante la clasificación de CD4
+ CD25
+ CD127
células de baja y la prueba de su capacidad para suprimir la proliferación de las células CD8 marcado con CFSE
+ Las células T pre-estimuladas durante 16 horas con placa determinada anti-CD3. La gráfica muestra el% de supresión en relación con cultivos llevados a cabo en ausencia de células T reguladoras, mientras que la citometría de flujo histogramas a continuación ilustran los perfiles de CFSE obtenidos para las células T de respuesta solo (izquierda) o en relación 1:02 con Treg (derecha). Los datos son representativos de tres experimentos independientes usando muestras de tres individuos diferentes. En (C), se cultivaron PBMC se re-estimularon con el péptido y la expresión de LAP relevante en la superficie de células T reguladoras o Teffs se determinó por citometría de flujo dentro de la población (péptido-sensible) CD3-bajo para tres pacientes.
por último, hemos tratado de determinar si la activación específica de antígeno de Treg condujo a la expresión inducida del TGF-β péptido asociado a la latencia (LAP) en la superficie celular. La inducción de la expresión después de la activación LAP es una característica única de Treg, y esta molécula no se expresa en células de teff, incluso después de la activación [18], [33]. Con el fin de comparar directamente la expresión de LAP inducida por activación en Treg y Teff, identificamos tres pacientes en los que las poblaciones Treg y Teff tanto CD3 en respuesta a la misma péptido regulados hacia abajo. CMSP de estos pacientes se cultivaron durante 21d con el péptido, re-estimuladas durante la noche y evaluado para CD3 baja regulación y LAP superficie expresión. Como se muestra en la Figura 2C, LAP se indujo claramente en una subpoblación de Treg responder a NY-ESO-1 péptido, como se identifica por el fenotipo CD3-baja. Por el contrario, CD3-baja teff responder al mismo péptido no logró un máximo de regular LAP.
En conjunto, la expresión de una célula CD4
+ CD25
+ FoxP3
+ CD127
-. fenotipo junto con
in vitro
capacidad supresora y la capacidad de inducir la expresión de LAP sugieren fuertemente que las células analizadas aquí son Treg funcionales en lugar de teff activado que tiene temporalmente hasta reguladas expresión de FoxP3
down-regulación de CD3 por Treg es dependiente de la concentración de péptido
en este estudio, la regulación por disminución de CD3 de superficie se utiliza como un marcador de la activación específica de antígeno de células t reguladoras a través del TCR. Por lo tanto, se esperaría que la medida de CD3 baja regulación a ser estrictamente dependiente de la concentración de péptido. Para confirmar esto, se realizaron estudios de titulación de péptidos usando PBMC de 4 pacientes diferentes. Para cada paciente, dos péptidos fueron probados, los cuales fueron seleccionados sobre la base de experimentos de selección preliminares como ser capaz de inducir una respuesta de regulación a la baja CD3 a 1 × 10
-4m. Como se muestra en la Figura 3, había una relación dependiente de la dosis clara entre la proporción de CD3-bajo Treg y la concentración de péptido utilizado para la re-estimulación. Un número de estas respuestas podría ajustarse a 1 × 10
-7M péptido, que es comparable con varios CD4 previamente descrito
+ respuestas de teff de NY-ESO-1 péptidos [5], [34]. También es importante tener en cuenta que los péptidos 18mer utilizados aquí probablemente no constituyen el epítopo óptimo para el reconocimiento de células T, en cuyo caso la respuesta detectan cuando la concentración de péptido se convierte en limitante puede ser una subestimación considerable.
PBMC de cuatro los pacientes fueron cultivadas durante 21d con NY-ESO-1 péptidos 18mer y luego re-estimularon durante la noche con péptidos individuales en las concentraciones indicadas. La proporción de Treg abajo de la regulación de CD3 en respuesta al péptido se determinó mediante citometría de flujo.
NY-ESO-1 específica de Treg se detectan con frecuencia en la sangre de pacientes con melanoma en etapa tardía y puede haber expandido por el NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
TM vacuna
Una cohorte de nueve pacientes con melanoma avanzado se proyectó para NY-ESO-1 específica de Treg, antes y 42 días después de la vacunación con NY -ESO-1 /ISCOMATRIX
TM. Los resultados se resumen en la Figura 4A. Después de la vacunación, todos los pacientes tenían respuestas Treg específicas para al menos una región de la proteína NY-ESO-1; varios tenían respuestas a dos o tres regiones distintas. Sorprendentemente, una comparación con las muestras antes de la vacunación reveló que muchas de estas respuestas fueron inducidos por la vacuna, ya que fueron indetectables antes de la vacunación. Un ejemplo de una respuesta de este tipo se muestra en la Figura 4B. Además, algunas de las respuestas que fueron detectable antes de la vacunación parecían estar impulsado por la vacuna (definido como un & gt; aumento de 2 veces en las células de respuesta después de la vacunación, cuando las dos muestras se compararon en paralelo en condiciones idénticas). Por ejemplo, en paciente 120, la frecuencia de Treg específicas para el péptido NY-ESO-1
37 a 54 fue de 4,4% antes de la vacunación, pero 18,3% después de la vacunación, y la frecuencia de Treg específicas para el péptido NY-ESO-1
79-96 fue de 3,3% antes de la vacunación y el 16,3% después de la vacunación
(
un
):. para cada paciente dentro de la cohorte, cada respuesta Treg validado se resume con una caja. Las respuestas se consideran valer, si se observaron en al menos dos cultivos independientes, utilizando dos lotes sintetizados independientemente de péptido. La posición de la caja indica dónde en la secuencia del péptido NY-ESO-1 se localizó la respuesta. En el caso de que las respuestas se detectaron a dos péptidos adyacentes en la secuencia, esto se muestra como una única respuesta que abarca los dos péptidos. Las casillas sombreadas indican que la magnitud de la respuesta se aumentó al menos 2 veces en las muestras después de la vacunación en comparación con las muestras antes de la vacunación cuando ambas muestras se ensayaron en paralelo en condiciones idénticas. cuadros sólidos indican que la respuesta fue sólo detectable en las muestras recogidas después de la vacunación. Las cajas abiertas indican que la magnitud de la respuesta fue pre similar y después de la vacunación. (
B Opiniones): Un ejemplo de una respuesta que fue inducida por la vacunación (paciente 124) se muestra. Treg fueron cerrada sobre la base de la expresión de CD25 y FoxP3, y CD3 baja regulación se evaluó después de re-estimulación con el péptido de control o el mismo péptido utilizado para la expansión (NY-ESO-1
85 a 102).
Treg y teff responden a un epítopo idéntico en la región de NY-eSO-1
157-170
Figura 4A demuestra que las respuestas Treg se observan con mayor frecuencia hacia el péptido NY- ESO-1
157 a 174, con células T reguladoras específicas para este péptido 18mer detectable en 5/9 pacientes analizados. Esta región contiene un epítopo (NY-ESO-1
157-170) que previamente se ha caracterizado por teff [35], aumentando la posibilidad de que Treg podría estar respondiendo al mismo epítopo. Para hacer frente a esta posibilidad, dos pacientes (102 y 103) fueron identificados que tenía respuestas a la NY-ESO-1
157-174 péptido tanto en los subconjuntos Treg y de teff, y la capacidad de estas células para responder a la publicada epítopo (NY-ESO-1
157-170) o diversas variantes de truncación o de extensión, se evaluó. Como se muestra en la Figura 5, tanto Treg (paneles de la izquierda) y de teff (paneles de la derecha) respondieron a la NY-ESO-1
157-170 péptido. Truncamiento de 1 o 2 aa de la N-terminal, o 1 aa del extremo C-terminal, tuvo poco efecto en estas respuestas. Sin embargo, las dos poblaciones presentan la capacidad de respuesta reducido en gran medida después de truncamiento de 2 aa de la C-terminal (péptido NY-ESO-1
157-168). Del mismo modo, la extensión de la secuencia central de al menos 1, ya sea en el extremo C o N terminal también redujo la capacidad de respuesta dentro de ambas poblaciones.
CMSP de pacientes se cultivaron durante 21d con el péptido 18mer NY-ESO-1
157- 174 y luego volvieron a estimular con los péptidos purificados por HPLC cortos indicados ya sea agregando directamente a la cultura como de costumbre (
a-D
) o mediante un pulso en BCL seguido de lavado (
e-F
). Después de una noche de incubación, las células se tiñeron y se analizaron mediante citometría de flujo, se active en Treg (CD4
+ CD25
+ FoxP3
+;
A, C y E
) o teff (CD4
+ FoxP3
-;
B, D y F
). Los péptidos utilizados para la re-estimulación se basaron en el epítopo publicada NY-ESO-1
157-170, ya sea con el truncamiento (
A-B Opiniones) o extensión (
C-D
) en cada terminal. Los gráficos en
A-D
muestran los resultados obtenidos para el Paciente 102; También se obtuvieron resultados similares para el paciente 103. Los gráficos en
E-F
muestran la media ± SEM de pacientes 102 y 113; un asterisco indica un valor de p. & lt; 0,05 (prueba t) guía empresas
El anteriormente descrito NY-ESO-1
157-170 epítopo se ha demostrado que ser restringido por el HLA de clase-DP4 II alelo [35], y la tipificación molecular reveló que los pacientes evaluados en la Figura 5 expresaron la HLA-DPB1 * 0401 molécula. Para confirmar que Tregs también respondió a este epítopo cuando se presentó en HLA-DP4, un panel de líneas de células B transformadas con EBV (BCL) se pulsó con el NY-ESO-1
157-170 péptido, se lavó y se prueba de la capacidad de inducir CD3 regulación a la baja en las células Treg y de teff (figura 5E-F). Una expresión que carece de DP4 BCL (9902) no pudieron inducir CD3 baja regulación en cualquiera de la población, mientras que un BCL expresan HLA-DPB1 * 0401 (línea 9004) indujo una respuesta significativa en ambas poblaciones. Por lo tanto, la NY-ESO-1
157-170 péptido se presenta a ambos Treg y Teff en HLA-DP4.
En conjunto, estos resultados sugieren que la secuencia mínima de la anteriormente descrita NY-ESO- 1
157-170 epítopo [35] podría ser revisado a NY-ESO-1
159-170, o posiblemente incluso a NY-ESO-1
159-169, aunque este péptido exacto no se probó en nuestros ensayos. Más importante, sin embargo, los datos demuestran que Treg y teff responden exactamente al mismo epítopo, y en ambos casos, esta respuesta está restringida por HLA-DP4.
NY-ESO-1 específica de Treg son frecuentes dentro de tejido tumoral
Para determinar si NY-ESO-1-específica Treg puede ser detectado dentro del tumor, así como la sangre, el tejido tumoral fresco se obtuvo a partir de pacientes de 126 después de tres rondas de vacunación con NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
TM y una suspensión de células generado. La mezcla resultante de las células tumorales y las células del estroma, incluyendo TIL, se cultivó en presencia de altas dosis de IL-2, pero sin la adición de cualquier péptido exógeno, antígeno o mitógeno. Ampliado TIL se estimularon durante la noche con péptidos NY-ESO-1
85-102 y NY-ESO-1
115-132 (ambas respuestas inducidas en la sangre periférica de este paciente Treg) y evaluados para CD3 abajo regulación. Además, una muestra del tumor de digestión se analizó por citometría de flujo antes del cultivo, lo que reveló que 41,1% de CD4
+ T células dentro del tumor tenía un fenotipo Treg, lo que representa un enriquecimiento de 10 veces aproximadamente más de las frecuencias de la sangre (no mostrado).
péptido NY-ESO-1
85-102 fallaron en estimular las respuestas reproducibles por cualquiera de Treg o teff dentro de TIL. Por otro lado, el péptido NY-ESO-1
115-132 indujo una respuesta fácilmente detectable por las células de teff en el TIL expandido (Fig 6A). Sorprendentemente, la magnitud de la respuesta a la misma péptido fue ~ 4 veces mayor dentro de la población Treg, con & gt; 40% de Treg abajo de la regulación CD3 en respuesta a este péptido. Para demostrar la reproducibilidad de esta diferencia, tres líneas TIL independientes se generaron a partir de alícuotas congeladas de la misma muestra de tumor, y cada línea probaron 1-3 veces. En cada análisis, la proporción de células que responden a la NY-ESO-1
115-132 péptido fue siempre mayor dentro de la población Treg que la población de teff, con una diferencia media de 3,1 (Fig 6B) doblar. Pre-incubación con un anticuerpo de bloqueo de HLA-DR inhibió casi completamente tanto las respuestas Treg y Teff a este péptido, mientras que el bloqueo de anticuerpos para HLA-DP o HLA-DQ no tuvo ningún efecto, lo que indica que la respuesta dentro de ambas poblaciones fue restringido por HLA DR (figura 6C).
tejido
El tumor se obtuvo a partir del paciente 126 y líneas TIL generado como se describe en
Métodos
. (
A-B Opiniones): Las células fueron tratadas durante la noche con péptido NY-ESO-1
péptido 115-132 o control, y después se tiñeron y se analizaron por citometría de flujo, se active en Treg (CD4
CD25 +
+ FoxP3
+) o teff (CD4
+ FoxP3
-) como se indica. un resultado representativo citometría de gráficos de puntos (A) muestra la compuerta de Treg y teff, y la respuesta CD3 regulación a la baja observada en cada población después de la re-estimulación, mientras que (b) muestra un resumen de los resultados obtenidos en cinco experimentos, cada uno usando una de las tres líneas TIL diferentes generan. (
C
): El efecto de bloqueo de anticuerpos contra HLA-DR, HLA-DP o HLA-DQ en la respuesta al péptido NY-ESO-1
115-132 dentro de Treg (izquierda) y teff (derecha) poblaciones. Se obtuvieron resultados similares en un segundo experimento. (
C
): TIL se estimularon durante la noche con NY-ESO-1
115-132 péptido y luego péptido específico (CD3
LO) y no específicos (CD3
hi) Treg se purificaron (CD4
+ CD127
lo CD25
hi) por clasificación de células y se ensayaron para determinar su capacidad para suprimir la proliferación de CFSE marcado CD8
+ células T pre-estimuladas durante 4 horas con anti CD3 en el Treg se indica: proporciones de respuesta. Como comparación, también se Treg ordenadas a partir de PBMC previamente congelado obtenido de un donante sano. Se observaron resultados similares en un segundo experimento, aunque Treg superiores:. Se requieren proporciones de respuesta para ver la supresión
En la Figura 2, hemos demostrado que la mayor Treg aislado de cultivos de 21 días suprime la proliferación de las células CD8
+ células T. Sin embargo, también es de interés para confirmar que NY-ESO-1-específica Treg tenía una actividad similar. Ampliado TIL de paciente 126 se estimularon con NY-ESO-1
115-132 péptido durante la noche para inducir CD3 baja regulación y el Treg específicas de péptido se clasificaron posteriormente en función de un CD4
+ CD25
CD127 +
- CD3
baja fenotipo y probado en un ensayo de supresión. Estas células suprimen la proliferación de CD8 estimuladas con anti-CD3
+ células T de un donante sano en un grado similar como mayor Treg aisladas de un donante sano (Fig 6D). Curiosamente, CD3
hi células T reguladoras ordenadas desde la línea de TIL (es decir, Treg que había fallado en responder al péptido estimulación) CD8 proliferación
+ células T también suprimida, lo que sugiere que la estimulación antigénica reciente no era esencial para la adquisición de supresor función por estas células. Posiblemente, la presencia de células tumorales durante el establecimiento de la línea de TIL activado Tregs específica a una amplia variedad de epítopos antigénicos tumorales, y este estado activado se mantuvo durante la expansión, lo que permite Treg con una variedad de especificidades de antígeno de ejercer actividad supresora.
en conjunto, estos resultados demuestran que el tejido del tumor de paciente 126 contiene una población importante de Treg específicas para un epítopo-DR restringidos por HLA dentro de la NY-eSO-1
115-132 péptido. Por otra parte, Treg específicas para este epítopo puede suprimir CD8
+ T proliferación celular y por lo tanto son totalmente funcionales. Tinción inmunohistoquímica del tejido tumoral reveló que las células tumorales todavía expresaron altos niveles de NY-ESO-1 en este momento (datos no presentados), lo que sugiere que el tejido residente NY-ESO-1-específica Treg puede ser activada localmente.
Discusión
En el presente estudio, hemos utilizado un enfoque novedoso que permite la identificación imparcial de Treg específicas para cualquier epítopo de un antígeno tumoral dado. Demostramos que NY-ESO-1 específica de Treg son muy comunes en la sangre de pacientes con melanoma en etapa tardía, ya que eran detectables en 9/9 pacientes analizados. Por otra parte, en seis de estos nueve pacientes, el /ISCOMATRIX
TM vacuna NY-ESO-1, ya sea inducido al menos una nueva respuesta que no era detectable antes de la vacunación o realzada las respuestas preexistentes.
debido a la escasez de células tumorales específicas de antígeno T (incluyendo Treg) en la sangre, era necesario para expandir estas células in vitro con el antígeno. Esta etapa de cultivo puede haber inducido una regulación temporal de FoxP3 y CD25 en células de teff, como se ha informado anteriormente [27] - [30], y estas células en teoría podría haber sido confundido con Treg. Sin embargo, varias líneas de evidencia sugieren fuertemente que este no es el caso. En primer lugar, estas células suprimen la proliferación de CD8
+ células T, cuando se evaluó ya sea como una población mayor (Fig 2) o aislado de acuerdo con NY-ESO-1 especificidad (Fig 6). En segundo lugar, expresaron niveles bajos a indetectables de expresión de CD127. En tercer lugar, LAP hasta reguladas tras la activación con el péptido cognado. Por último, las poblaciones Treg y de teff en pacientes individuales a veces reconocen epítopos distintos (como en el ejemplo mostrado en la Figura 1), proporcionando evidencia de que estos son poblaciones discretas, y el Treg no eran simplemente obtenida por transformación de teff que reconoce el mismo epítopo. Nuestra conclusión de que las células CD4
+ CD25
+ FoxP3
+ células presentes en cultivos de 21 días son Treg y la no activación de teff es de acuerdo con estudios anteriores que muestran que la adquisición de estos marcadores por teff es temporal, y expresión se pierde en gran medida a los 10 días de la cultura [12], [27], [28], [30]. Es de destacar que dos estudios previos también han identificado Treg NY-ESO-1-específico en la sangre de pacientes con melanoma utilizando enfoques alternativos, más el apoyo a nuestros resultados [12], [24].
Las respuestas Treg detectados en nuestro estudio abarcan una gran parte de la proteína NY-ESO-1. Aunque la caracterización detallada de cada uno de estos epítopos está más allá del alcance de este estudio, pudimos confirmar que la respuesta frecuentemente detectado Treg al péptido 18mer NY-ESO-1
157-174 se debió al reconocimiento de la descrita anteriormente DP4- inmunodominante restringido NY-ESO-1
157-170 epítopo. Por lo tanto, hemos demostrado de manera concluyente que Treg y Teff pueden reconocer exactamente el mismo epítopo mínimo presentado en el mismo alelo HLA. Esto a su vez sugiere que Treg humana y Teff comparten repertorios de TCR, al menos parcialmente superpuestos, que está de acuerdo con estudios anteriores en los seres humanos [36] y ratones [37]. Por otra parte, una de las respuestas Treg detectados aquí (dentro de la región de NY-ESO-1
49-72) no contiene cualquiera de los descritos anteriormente epítopos de teff (véase http://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase) y esta respuesta no se detectó dentro de la población de teff en este paciente (datos no mostrados). Por lo tanto, esta especificidad puede ser única para la población Treg.
Todavía es una cuestión de debate si Treg median sus efectos supresores sobre todo en los órganos linfoides secundarios, en los sitios locales en la periferia (por ejemplo, tejido tumoral) o, más probablemente, una combinación de ambos. Por razones prácticas, hemos evaluado las respuestas NY-ESO-1-Treg específicas predominantemente en la sangre, que deben reflejar las células que circulan a través de los órganos linfoides secundarios. Sin embargo, para los pacientes 126, se podrían obtener, además, el tejido tumoral fresco y demostrar que Treg específico para un epítopo restringido por HLA-DR dentro de péptido NY-ESO-1
115-132 no sólo estaban presentes en la sangre, pero también estuvieron presentes a alta frecuencia dentro del tumor. Estos NY-ESO-1
115-132-Treg específicas eran completamente funcional, ya que suprimen CD8
+ proliferación de células T.