Extracto
Aplicaciones
silenciamiento inducido por metilación de
PRSS3
se ha demostrado que se asocia significativamente con el cáncer de vejiga invasivo, y la expresión de la
C16orf74
locus del gen se ha demostrado que se correlaciona positivamente con el
PRSS3.
el objetivo del presente estudio fue evaluar la relación entre el
C16orf74
nivel de expresión y la progresión de no músculo cáncer de vejiga invasivo ( CVNMI).
Materiales y Métodos
C16orf74
niveles de mRNA fueron examinados por tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR), análisis de 193 muestras de tumores de pacientes inversa con CVNMI primaria. Expresión datos fueron analizados en cuanto a los parámetros clínicos y experimentales. curvas y modelos de regresión de Cox multivariado de Kaplan-Meier, respectivamente, se utilizaron para determinar la supervivencia libre de progresión y para identificar parámetros predictivos independientes de evolución.
Resultados
Análisis mediante curvas de Kaplan-Meier reveló prolongada La supervivencia libre de progresión de alto
C16orf74
-expressors en comparación con bajas expressors (p & lt; 0,001). El análisis de regresión multivariante de Cox reveló que bajo
C16orf74
los niveles de expresión de ARNm son un importante factor de riesgo para la progresión de la enfermedad en pacientes con hipercolesterolemia primaria CVNMI (HR: 10.042; IC: 2,699 a 37,360, p = 0,001)
Conclusiones
disminución de la expresión de
C16orf74
se correlaciona significativamente con la progresión en CVNMI primaria.
C16orf74
nivel de expresión representa un marcador potencialmente útil para predecir la progresión en pacientes CVNMI primarias
Visto:. Kim WT, Yun SJ, Parque C, Kim IY, Luna SK, Kwon TG, et al . (2010) Identificación de
C16orf74
como un marcador de progresión en la Primaria no músculo invasivo del cáncer de vejiga. PLoS ONE 5 (12): e15260. doi: 10.1371 /journal.pone.0015260
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Agosto, 2010; Aceptado: 2 de noviembre de 2010; Publicado: December 21, 2010
Derechos de Autor © 2010 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el Programa básico de Investigación de la Ciencia a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2.010 a 0.001.730). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Más del 90% de los cánceres de vejiga son carcinomas de células de transición, y la mayoría son papilar, bien, o no músculo cáncer de vejiga invasivo moderadamente diferenciado-(CVNMI) [1] - [2]. Después de la resección endoscópica, la recurrencia del cáncer ocurre en la mayoría (50-70%) de los pacientes con CVNMI [3]. Aproximadamente el 20% de estos pacientes posteriormente experimentan progresión de la enfermedad en el músculo del cáncer de vejiga invasivo (MIBC) después de un tratamiento adecuado, incluyendo la resección transuretral (RTU) y la terapia intravesical con epirubicina, mitomicina-C, o bacilo de Calmette-Guerin (BCG) [1] - [2]. Por lo tanto, la recurrencia frecuente después de la RTU y la progresión del cáncer subsecuente son problemáticos para los pacientes y urólogos por igual. Casi el 25% de los pacientes con cáncer de vejiga recién diagnosticados tienen MIBC, y la gran mayoría de estos casos son de alto grado histológico. Casi el 50% de los pacientes con MIBC ya se oculta en las metástasis a distancia en el momento del diagnóstico [1] - [2]
Un número de posibles marcadores tumorales se han identificado para el cáncer de vejiga, pero pocos han demostrado eficacia en. términos de predicción de recurrencia de la enfermedad y la progresión. Sin embargo, varios estudios recientes han sugerido que los genes supresores de
p53
,
RUNX3
,
RASSF1A
, y
PRSS3
están estrechamente relacionados con el desarrollo y progresión del cáncer de vejiga [4] - [7]. En concreto,
RASSF1A
y
PRSS3
metilación del promotor se asocia con estadio tumoral avanzado [7], lo que sugiere que estos genes podrían estar asociados con la progresión del cáncer de vejiga.
PRSS3
a su vez, se ha demostrado que se asocia positivamente con el
C16orf74
expresión [8].
El
C16orf74 gratis (MGC17624) locus del gen está en 16q24.1 cromosoma, y su función aún no se ha caracterizado. Los resultados de varios estudios de genoma completo han indicado que
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está implicado en procesos inflamatorios. factor de necrosis tumoral (TNF) -α es un regulador clave de la cascada inflamatoria en las enfermedades inflamatorias crónicas, y en pacientes con enfermedad inflamatoria,
C16orf74
está fuertemente asociada con una respuesta anti-TNF [9].
C16orf74
es un gen regulado por hipoxia [10] - [11]. Winter et al. [10] informó de que
C16orf74
nivel de expresión de ARN mediana es un factor pronóstico independiente de supervivencia libre de recurrencia en el cáncer de cabeza y cuello.
C16orf74
también se ha demostrado ser upregulated en las metástasis de ganglios linfáticos positivos en pacientes con carcinoma de células escamosas oral de la lengua [12], y que se correlaciona positivamente con el
PRSS3
expresión en el cáncer de mama [8 ].
Recientemente, se informó de la identificación de un gen relacionado con la progresión del clasificador, que tenía un fuerte valor predictivo en cuanto a las enfermedades de la CVNMI [13]. En ese estudio,
C16orf74
fue uno de los ocho genes candidatos identificados para predecir la progresión de la enfermedad en CVNMI, lo que sugiere una posible relación entre el cáncer de vejiga y
C16orf74
. En el presente estudio, se evaluó la relación entre el
C16orf74
y los resultados CVNMI utilizando los datos de un estudio previo de la población, así como nuevos casos, todos con seguimiento a largo plazo de seguimiento.
Resultados
1. Las características basales
La edad media de los 193 sujetos con CVNMI primario fue de 64,1 ± 14,0 años, y el período de seguimiento medio fue de 44,9 meses. Setenta y un pacientes (36,8%) experimentaron recurrencia y 20 (10,4%) experimentaron progresión. Otras características basales de los pacientes se presentan en la Tabla 1.
2. El valor de
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nivel de expresión de ARNm como marcador pronóstico para la progresión
La relación entre el
se analizó C16orf74
nivel de expresión de ARNm y el tiempo de progresión. Uso de una curva ROC, se determinó un valor de corte (11,7784) para la progresión de la más alta sensibilidad combinada (53,2%) y especificidad (85%). Tiempo hasta la progresión fue significativamente diferente entre las altas y bajas
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grupos de expresión de ARNm, en ese tiempo hasta la progresión de la alta
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grupo expresión fue significativamente mayor que el grupo de baja expresión (p & lt; 0,001) (Fig. 1). En el análisis de regresión de Cox de diversas variables clinicopatológicas (edad, sexo, tamaño del tumor, número, grado, estadio, terapia intravesical, y
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los niveles de expresión de ARNm), la edad, la terapia intravesical y
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los niveles de expresión de mRNA fueron factores de riesgo significativos para la progresión (p = 0,031, p = 0,034 y p & lt; 0,001, respectivamente). En el análisis de regresión de Cox multivariable, la edad y la baja
C16orf74
los niveles de expresión de mRNA fueron factores de riesgo significativos para la supervivencia libre de progresión en pacientes con hipercolesterolemia primaria CVNMI (HR: 1,049; IC: 1,005 a 1,094, p = 0,030; y HR : 10.042, CI: 2,699 a 37,360, p = 0,001, respectivamente) (Tabla 2). En el análisis multivariado de regresión de Cox en pacientes con terapia intravesical, la edad y bajos niveles de expresión de ARNm C16orf74 fueron factores de riesgo significativos para la supervivencia libre de progresión en pacientes con CVNMI primaria con la terapia intravesical (HR1.055; IC: 1,005 a 1,108, p = 0,031; y HR: 14.170; IC:. 2,719 a 73,837, p = 0,002, respectivamente)
Discusión
la tripsina es un miembro de la familia de serina proteasa codificada por tres tripsinógeno genes, incluyendo
PRSS1
,
PRSS2
y
PRSS3
codifican tripsinógeno I, II trypsionogen, y tripsinógeno IV (también conocido como mesotrypsinogen), respectivamente [14] - [16] . Esta enzima ha sido conocida como una enzima proteolítica potente que puede destruir el tejido [17] - [18]. Hay informes contradictorios en la literatura sobre el papel de tripsina o PRSS3 en la progresión tumoral, con algunos estudios que asignan un papel positivo [19] - [23], mientras que otros han informado de que la tripsina o PRSS3 juega un papel supresor tumoral. La expresión de PRSS3 se reduce en la vejiga, esófago y cánceres gástricos, y la pérdida de expresión PRSS3 es debido a silenciamiento epigenético a través de la hipermetilación del promotor [7], [24] - [25]. En particular, el silenciamiento de
PRSS3 fotos: por la metilación del promotor se ha asociado de forma significativa con el estadio del tumor invasivo en el cáncer de vejiga [7].
La expresión de
C16orf74
se ha demostrado que correlaciona positivamente con
PRSS3
. Hockla et al. [8] informó de que
C16orf74
se redujo reguladas por desmontables de
PRSS3 Opiniones y upregulated de mesotripsina tratamiento. Hasta la fecha, no ha habido informes de una asociación de
C16orf74
con cáncer de vejiga, excepto lo indicado en un trabajo anterior de los autores [13]. A continuación, analizamos la relación entre los niveles de mRNA de expresión de
C16orf74
y la progresión en CVNMI primaria. Reducción de la expresión de
C16orf74
se asoció significativamente con la progresión de la enfermedad en pacientes CVNMI, lo que sugiere que
C16orf74
tiene un papel supresor tumoral, similar al
p53, RUNX3
y
PRSS3
, en la progresión de la enfermedad. Hasta la fecha, la función de
C16orf74
se desconoce, y se necesitan estudios adicionales para definir la vía preciso por el que
C16orf74
influencias progresión en CVNMI primaria.
En general, clínica y los parámetros patológicos tales como el grado del tumor, el estadio tumoral, invasión linfática, el tamaño del tumor, la CEI, la arquitectura papilar o tumor sólido, y multifocalidad se han considerado los parámetros pronósticos de utilidad en la progresión de la enfermedad en CVNMI. De estos factores, en general, el grado del tumor, estadio y la presencia de CIS se consideran los más importantes. En el estudio actual, la terapia intravesical fue un factor de riesgo para la progresión en el análisis univariado. Sin embargo, es posible que los pacientes que recibieron terapia intravesical estaban en un grupo clínicamente alto riesgo de recurrencia o progresión, en lugar de que el tratamiento afectado progresión [26]. Varios marcadores moleculares también se han evaluado para la progresión de la enfermedad. genes relacionados con la progresión putativo Recientemente, varios estudios han identificado en CVNMI mediante el análisis de la expresión de genes [27] - [29]. Wang et al. [27] propuso un panel de 57 genes para ayudar a predecir la progresión en CVNMI. Birkhahn et al. [28] informó de que
HRAS
,
VEGFR3
, y
VEGF
niveles de expresión estaban relacionados con la progresión con una sensibilidad del 81% y 94% de especificidad. Eguchi et al. [29] informaron de que la pérdida de 8p23.3 es un marcador para predecir la progresión y recurrencia en CVNMI. Anteriormente, hemos identificado un candidato relacionados con la progresión del clasificador gen que tenía un fuerte valor predictivo en cuanto a las enfermedades de la CVNMI [13]. Aunque
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es un único marcador molecular dentro de este candidato relacionados con la progresión del gen clasificador, que era suficiente para predecir el riesgo de progresión en CVNMI con una razón de riesgo fuerte de más de 10 en el análisis multivariante.
en el presente estudio, hemos investigado los niveles de expresión de ARNm de
C16orf74 Hoteles en tejidos humanos CVNMI primaria en una población relativamente grande, con un seguimiento a largo plazo período de seguimiento, junto con varios factores de riesgo clínicos conocidos, incluyendo la edad , el tamaño del tumor, el número de tumores, T-categoría, el grado del tumor, y la terapia intravesical [30] - [31]. Estos aspectos del diseño del estudio se prestan fuerza a los resultados, y fuertemente sugieren que
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puede ser un predictor de la progresión clínicamente útil en CVNMI primaria.
En conclusión, disminución de la expresión de
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se asoció significativamente con la progresión en CVNMI primaria, y el nivel de expresión de
C16orf74
era un determinante pronóstico independiente para la progresión tumoral.
C16orf74
podría desempeñar un papel clave en la progresión de CVNMI. Por lo tanto,
C16orf74
nivel de expresión representa un marcador útil para predecir la progresión en pacientes CVNMI primarias.
Materiales y Métodos
1. Declaración de Ética
El Comité de Ética de la Universidad Nacional de Chungbuk aprobado este protocolo, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada tema. Recogida y análisis de todas las muestras fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Nacional de Chungbuk.
2. Pacientes y muestras de tejidos
muestras Primaria CVNMI de pacientes con carcinoma de células transicionales histológicamente verificado obtenido en nuestro instituto se utilizaron para el estudio actual. Los pacientes con carcinoma concomitante
In situ gratis (CIS) o un período de seguimiento a corto plazo (menos de 6 meses), y los que se sometió a cistectomía radical o para los cuales no fue la recopilación de datos incompletos, fueron excluidos de hacer la población de estudio más homogénea. Se analizaron un total de 193 muestras primarias CVNMI.
Todos los tumores fueron macrodissected, por lo general dentro de los 15 minutos de la resección quirúrgica. Cada espécimen de cáncer de vejiga se confirmó mediante análisis patológico de una parte de la muestra de tejido en secciones congeladas frescas de especímenes TUR, y luego se congeló en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Una segunda RTU se llevó a cabo de 2-4 semanas después de la resección inicial cuando un espécimen de cáncer de vejiga no incluyó muscular adecuado o cuando se detectó tumor de alto grado [32]. Los pacientes que tenían un tumor T1, tumores múltiples, tumores grandes (≥ 3 cm de diámetro), o de alto grado Ta CVNMI recibieron un ciclo de tratamiento intravesical (BCG o mitomicina C) [26], [32]. Si un paciente rechazó la terapia intravesical, no se administró después de la RTU. La respuesta al tratamiento se evaluó por cistoscopia y citología urinaria. Los pacientes que estaban libres de la enfermedad dentro de los 3 meses después del tratamiento fueron evaluados cada 3 meses durante los 2 primeros años y luego cada 6 meses a partir de entonces [26], [32]. Los tumores se organizaron y se clasificaron según la clasificación TNM de 2002 y el sistema de clasificación de la OMS 1973, respectivamente [32] - [33]. La recurrencia se definió como la recurrencia de CVNMI primaria con un mismo estadio patológico o menor, y la progresión se definió como la enfermedad con un estadio TNM superior a la recaída.
3. La extracción de ARN y la construcción de cDNA
RNA fue aislado de tejido usando 1 ml de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la homogeneización en un tubo de vidrio de 5 ml. El homogeneizado se transfiere a un tubo de 1,5 ml y luego se mezcla con 200 l de cloroformo. Después de la incubación durante 5 min a 4 ° C, el homogeneizado se centrifugó durante 13 minutos (min) a 13.000 ×
g
a 4 ° C. La fase acuosa superior se transfirió a un tubo limpio y después se añadieron 500 l de isopropanol. La mezcla se incubó durante 60 min a 4 ° C, y después el tubo se sometió a centrifugación durante 8 min a 13.000 ×
g
, 4 ° C. La fase acuosa superior se descartó y se mezcla con 500 l de 75% de etanol, y después se centrifugó durante 5 min a 13.000 ×
g
, 4 ° C. Después de desechar la capa acuosa superior, el sedimento se secó a temperatura ambiente, se disolvió en pirocarbonato de dietilo (DEPC) de agua tratada, y después se almacenó a -80 ° C. La calidad y la integridad del ARN se confirmaron por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio, seguido por inspección visual bajo luz ultravioleta. cDNA fue preparado a partir de 1 g de ARN total usando un kit primer capítulo de síntesis de cDNA (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. PCR en tiempo real
en tiempo real la amplificación por PCR se realizó con un instrumento Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Mortlake, Australia) para cuantificar la expresión de
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. Los ensayos de PCR en tiempo real se llevaron a cabo en tubos de micro-reacción (Corbett Research, Mortlake, Australia) utilizando SYBR Premix EX Taq (TAKARA BIO INC., Otsu, Japón). Los cebadores utilizados para la amplificación fueron
C16orf74 gratis (179 pares de bases) sentido (5'-AAT GTG TGT CAG CAG CAG CA-3 ') y anti-sentido (5'-TTT CTC CAT CAT CTG GGC AC-3 '). La reacción de PCR se realizó en un volumen final de 10 l que consta de 5 l de tampón de 2 X SYBR premezcla EX Taq, 0,5 l de cada uno de 5 'y 3' cebador (10 pmol /l), y 1 l de la muestra cDNA. El producto se purificó con un kit QIAquick Extracción (QIAGEN, Hilden, Alemania), cuantificado con un espectrofotómetro (Perkin Elmer MBA2000, Fremont, CA), y luego se secuenció con un secuenciador de fluorescencia láser automatizado (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Foster City, WISCONSIN). Diez veces diluciones en serie de una concentración conocida del producto (de 100 pg /l a 0,1 pg /l) se utilizaron para establecer la curva estándar para la PCR en tiempo real. El tiempo real de las condiciones de PCR fueron las siguientes: 1 ciclo durante 20 segundos (seg) a 96 ° C, seguido de 40 ciclos de 2 seg a 96 ° C para la desnaturalización, 15 segundos a 60 ° C para el recocido, y 15 seg a 72 ° C para la extensión. El programa de fusión se realizó a 72-95 ° C con una velocidad de calentamiento de 1 ° C por 45 seg. Los datos espectrales fueron capturados y analizados mediante el Rotor-Gene software de análisis en tiempo real 6.0 Build 14 (Corbett Research, Mortlake, Australia). Todas las muestras se realizaron por triplicado.
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)
se analizó como una expresión de genes de referencia de ARN y gen endógeno se normalizó a la expresión de
GAPDH
.
5. El análisis estadístico
Para normalizar la distribución altamente sesgada de los niveles de mRNA de expresión de
C16orf74
, los datos fueron transformados log natural y luego volver a transformar para la interpretación de los resultados [34]. características de funcionamiento del receptor se utilizaron (ROC) para determinar el punto de corte óptimo del nivel de ARNm que produjo la más alta sensibilidad y especificidad combinada para la progresión. Utilizando estos valores, los pacientes se clasificaron en
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grupos altos o bajos de expresión. El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar el tiempo de progresión, y se evaluaron las diferencias estadísticas utilizando log-rank. El valor pronóstico de
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en términos de progresión fue analizado mediante modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox multivariado. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL), y un valor de p & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
.