Extracto
El ácido micofenólico múltiple (MPA) es el producto metabolizado y el elemento activo del micofenolato mofetil (MMF) que se ha utilizado ampliamente para la prevención del rechazo agudo del injerto. MPA inhibe de forma potente la inosina monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) que está regulado en muchos tumores y MPA es conocida para inhibir la proliferación de células de cáncer, así como de fibroblastos y la migración de células endoteliales. En este estudio, hemos demostrado por primera antimigratorio habilidades y anti-invasión de la MPA MPA de AGS-sensibles células (cáncer gástrico) tiempo. la expresión de todo el genoma análisis utilizando microarrays de todo el genoma Illumina identificado 50 genes con ≥ 2 veces los cambios y 15 genes con & gt; 4 alteraciones de plegado y vías moleculares múltiples implicados en la migración celular. Análisis en tiempo real de RT-PCR de los genes seleccionados también confirmó las diferencias de expresión. Por otra parte, proteómica dirigida analiza identificado varias proteínas alteradas por SM el tratamiento. Nuestros resultados indican que el MPA modula la migración de células de cáncer gástrico a través de la baja regulación de un gran número de genes (
PRKCA
,
DOCK1
,
INF2, HSPA5, LRP8
y
PDGFRA
) y proteínas (PRKCA, AKT, SRC, CD147 y MMP1) con funciones promigratory, así como la regulación de una serie de genes con funciones antimigratorio (
ATF3
,
SMAD3
,
CITED2
y
CEAMCAM1
). Sin embargo, unos pocos genes que pueden promover la migración (
CYR61
y
NOS en 3
) fueron reguladas. Por lo tanto, el papel antimigratorio general del MPA en las células cancerosas refleja un equilibrio entre promigratory y señales antimigratorio influenciados por SM el tratamiento
Visto:. Dun B, Sharma A, Teng Y, Liu H, Purohit S, Xu H, et al . (2013) inhibe el ácido micofenólico migración y la invasión de células de cáncer gástrico a través de múltiples vías moleculares. PLoS ONE 8 (11): e81702. doi: 10.1371 /journal.pone.0081702
Editor: Ying Xu, de la Universidad de Georgia, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Julio, 2013; Aceptado 15 de octubre de 2013; Publicado: 15 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Dun et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio recibió el apoyo de los fondos de la Universidad de Georgia Regents. JXS es parcialmente apoyado por la Alianza de Investigación de Georgia como un eminente. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la mayoría de los tumores sólidos son en gran medida curables si se diagnostican y se tratan antes de su difusión más allá del sitio primario inicial. Sin embargo, una vez que los tumores se extendió a otros lugares, por lo general se vuelven altamente probable morboso y fetal. Por lo tanto, es esencial limitar la difusión inicial y evitar la propagación secundaria. La invasión y la metástasis son dos de los principales modos de diseminación del tumor, cada uno impulsado por mecanismos diferentes y que conducen a retos terapéuticos distintos [1]. Sin embargo, las dos formas de difusión requieren el movimiento de células a partir de los sitios primarios a la ubicación secundaria, así como el restablecimiento y la supervivencia de las células tumorales en las ubicaciones secundarias. Estos procesos se llevan a cabo a través de una cascada de cambios moleculares en las células cancerosas. Aunque la migración celular subyacente mecanismo molecular se ha estudiado extensamente, nuevos conocimientos sobre los eventos moleculares pueden proporcionar nuevos enfoques terapéuticos. De hecho, la inhibición de las moléculas que promueven la migración celular y la regulación de las moléculas que inhiben la migración celular a través de las intervenciones farmacológicas se han convertido en una parte importante de los weaponries para combatir el cáncer. Desarrollo o el uso indebido de drogas adicionales que inhiben la migración y la invasión es un esfuerzo en curso importante para la terapéutica del cáncer.
El micofenolato mofetilo (MMF) ha sido aprobado para la prevención del rechazo agudo del injerto en el riñón, el corazón, y el trasplante de hígado [ ,,,0],2,3]. MMF es el profármaco éster morfolinoetílico del ácido micofenólico (MPA), que es un potente inhibidor no competitivo de la inosina monofosfato deshidrogenasa (IMPDH), la enzima limitante de la velocidad para la
de novo
síntesis de nucleótidos de guanosina [4,5 ], que desempeñan papeles cruciales en la proliferación celular y otras funciones celulares, incluyendo la replicación del ADN, la síntesis de ARN y de la proteína y la señalización celular [6]. En consecuencia, el MPA bloquea T y B la proliferación de linfocitos y la expansión clonal, y evita la generación de células T citotóxicas y otras células T efectoras. Otros mecanismos pueden también contribuir a la eficacia de MPA en la prevención de rechazo del aloinjerto. A través de agotamiento de los nucleótidos de guanosina, MPA puede suprimir la glicosilación y la expresión de varias moléculas de adhesión, disminuyendo de este modo el reclutamiento de linfocitos y monocitos en los sitios de inflamación y rechazo del injerto [5].
Dado que la expresión IMPDH es significativamente hasta reguladas en muchas células tumorales [7,8], es, por lo tanto, potencialmente un objetivo para la terapia del cáncer, además de inmunosupresor quimioterapia. MPA /MMF se ha informado que inhiben la proliferación de células cancerosas e induce la apoptosis en muchas células de cáncer [9-14]. MPA /MMF También se ha informado para inhibir la migración de células de fibroblastos [15] y las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) [16]. Sin embargo, se desconoce si MPA puede alterar la capacidad de migración y la invasión de las células cancerosas. Por otra parte, las vías de señalización de migración precisas y moléculas efectoras que subyacen a las actividades de la MPA siendo difícil de alcanzar.
En este estudio, hemos demostrado que el MPA primera cambia de manera significativa la capacidad de migración e invasión de células AGS y que luego se usa la expresión génica y tecnologías proteómicas para identificar los genes y las proteínas que subyacen a estas funciones.
Materiales y Métodos
las líneas celulares, reactivos y anticuerpos
dos líneas celulares de cáncer gástrico (AGS y Hs746T) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Ambas líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 suero bovino medio que contiene 10% fetal, 100 unidades /ml de penicilina y 100μg /ml de estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO2. MPA fue adquirido de VWR. El CD147, el anticuerpo de integrina beta5 fue adquirido de Abcam, la GAPDH y ICAM-1antibodies de Santa Cruz; Src, Akt, y p-Akt (Ser473) anticuerpos de señalización celular.
In vitro migración y la invasión ensayos de trans-así
La migración celular se llevó a cabo con el sistema Transwell (Costar), que permite que las células migran a través de 8-micras de tamaño de poro de membrana de policarbonato. En resumen, se añadieron los AGS privadas de suero o células HS746T a la cámara superior (5 x 104 células por inserto) y medio DMEM con diferentes concentraciones de MPA se utilizó (1μg /ml, 1.5μg /ml y 2μg /ml) como una quimioatrayente en la cámara inferior. Después de incubación a 37 ° C durante 8 horas, las células en la cámara inferior se fijaron en metanol y se tiñeron con 0,2% de cristal violeta. Números de las células que migran en nueve campos seleccionados al azar de las cámaras por triplicado se contaron en cada experimento con un microscopio de contraste de fase. El potencial invasivo de las células se analizó usando una cámara recubierta con Matrigel Boyden modificada (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) como se describe anteriormente [17]. DMEM que contenía MPA fue introducido en la cámara inferior. Después de incubación a 37 ° C durante 24 horas, se contó el número de células que invadieron a la parte inferior de la cámara superior.
micorarray experimentos
ARN total fue extraído a partir de células AGS utilizando una kit de extracción de ARN perlas magnatic (Jinfiniti Biosciences, Augusta, GA). perfiles de expresión génica se realizó utilizando el ser humano Illumina HumanHT-12 v4 BeadChip (Illumina, San Diego, CA). Una parte alícuota de 200 ng de ARN total se convirtió en cDNA de doble cadena (ds-cDNA) utilizando el kit de marcaje de Illumina TargetAmp-Nano con un cebador oligo-dT que contiene un promotor T7 RNA polimerasa (Genset, St. Louis, MO).
in vitro
la transcripción se realizó en las anteriores ds-cDNA utilizando el kit de marcaje de transcrito de ARN Enzo. se purificó marcado con biotina cRNA mediante el uso de una columna de afinidad RNeasy (Qiagen), y fragmentado al azar a tamaños que van desde 35-200 bases mediante incubación a 94 ° C durante 35 min. Las soluciones de hibridación contenían 100 mM de MES, 1 M Na
+, EDTA 20 mM, y 0,01% de Tween 20. La concentración final de cRNA fragmentado fue de 0,05 g /l en solución de hibridación. Target para la hibridación se preparó combinando 40 l de transcripción fragmentada con ADN de esperma de arenque agitado cuando (0,1 mg /ml), BSA y 5 nM de oligonucleótido de control en un tampón que contiene 1,0 M NaCl, mM Tris.HCl 10 (pH 7,6), y 0,005 % de Triton X-100. Target se hibridó durante 16 horas a 45 ° C en un horno de hibridación Illumina. a continuación, las virutas se lavaron a 50 ° C con una solución rigurosa, luego de nuevo a 30 ° C con lavados no estrictas. Las matrices fueron teñidas con estreptavidina-Cy3. Los datos de microarrays MIAME son compatibles y se han depositado en el NCBI la Expresión Génica Omnibus y son accesibles a través de GEO serie número de acceso GSE46671.
Real-time RT-PCR análisis
Una alícuota de ARN total ( 2μg por muestra) fueron dispuestos en placas de 96 pocillos y se convierte después en ADNc utilizando una alta capacidad de cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) y un controlador térmico programable PTC-100 ™ (MJ Research, Inc). Los productos de ADNc se utilizaron para cuantitativa en tiempo real PCR usando genes de expresión TaqMan ensayos listas para usar de la Applied Biosystems. Cinco genes de referencia con la expresión relativamente constante (GAPDH, ESD, GUSB, IPO8 y MRPL19) se utilizaron para la normalización de la concentración de ARN. PCR en tiempo real se realizó con 96x96 chips de expresión Fluidigm. se utilizó la condición de ciclos térmicos estándar (10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C, 1 min a 60 ° C) para todos los genes. Todas las muestras se analizaron en la misma placa y cada muestra se analizó por duplicado.
Western Blot
Las células se recogieron y se resuspendieron en PBS. Después de centrifugación a 2000 rpm durante 5 min, el sedimento se lisaron en hielo frío M-PER proteína de mamífero reactivo de extracción que contiene 1% de proteasa Halt y cóctel inhibidor de fosfatasa (Thermo Scientific) durante 30 min. El sobrenadante se recogió después de 10 min de centrifugación a 12000rpm, igualado por espectrofotometría, se desnaturalizaron con tampón de carga de la muestra durante 10 min a 95ᵒC y se almacena a 4 ° C para uso futuro. Las proteínas fueron separadas por 10% en geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio-Rad), y se incubaron con anticuerpos primarios de interés a 4 ° C durante la noche. Se añadió 10.000 en tampón de bloqueo (3% BSA-TBST) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente: El anticuerpo secundario de rábano picante conjugado apropiado en una dilución de 1. Todos los anticuerpos se diluyeron en BSA al 3%-TBST. Las inmunotransferencias se desarrollaron usando el reactivo de quimioluminiscencia ECL (Thermo Scientific).
citometría de flujo
Las células se trataron con tripsina y se lavaron dos veces en PBS. Aproximadamente 1x10
6 células se incubaron con 1 g de anti-CD147, anti-ICAM-1 y beta 5 anticuerpos anti-integrina durante 30 minutos, se lavó con PBST dos veces, después se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con TRITC o APC durante 30 minutos, y se lavó dos veces con PBST. Los análisis de citometría de flujo se realizaron en un citómetro de flujo FACScaliburTM con el software CELLQuestTM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.).
Luminex ensayo
MMP proteínas en el medio de cultivo se midieron usando kits de Luminex Millipore Company (Billerica, MA, EE.UU.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Medio de cultivo celular (dilución 1:10) se incubó con las microesferas de anticuerpos acoplados y luego con anticuerpo de detección biotinilado antes de la adición de estreptavidina-ficoeritrina. El cordón de complejos capturados se midieron con el sistema FLEXMAP 3D (Luminex, Austin, TX). Se recogió la intensidad media de fluorescencia (MFI) y se utiliza para el cálculo de las concentraciones de proteína.
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el lenguaje R y el medio ambiente para el cálculo estadístico (www.r-proyecto. org). Las comparaciones entre las medias de los grupos se realizaron mediante ANOVA (durante ≥ 3 grupos), seguido de comparaciones por pares utilizando la prueba de Bonferroni post hoc. La significación estadística de las diferencias se estableció en P & lt; 0.05.
El paquete lumi se utilizó para procesar previamente los datos de microarrays. Expresión diferencial análisis se realizaron utilizando el paquete limma del proyecto Bioconductor [18]. Se utilizó la tasa de falso descubrimiento (FDR) para ajustar para múltiples ensayos [19]. Una combinación de p-valor ajustado y el valor absoluto del factor de cambio (FC) fueron utilizados para la selección de los genes expresados diferencialmente. El análisis de conglomerados
se realizó para agrupar los genes expresados diferencialmente que exhiben patrones de expresión similares utilizando el programa HPCluster [20]. Se utilizó el paquete Bioconductor "GOstats" para probar la asociación de términos de ontología de genes (procesos biológicos) de los genes expresados diferencialmente [21] Un valor de p basado en el test hipergeométrica se calculó para evaluar si el número de genes asociados con el término es mayor de lo esperado. El p-valores obtenidos fueron ajustados para múltiples pruebas utilizando el FDR. La lista de genes también se analizó utilizando KEGG vías pre compilados. Se utilizó el "SPIA" (señalización vía de análisis de impacto) paquete para identificar las vías afectadas por los cambios observados en la expresión de genes [22]. Se realizó el análisis de redes para construir redes de interacción molecular utilizando la base de datos STRING [23]. Las redes fueron importados en formato simple interacción de Cytoscape para la visualización [24].
Resultados
AMP inhibe la migración celular y la invasión AGS
La capacidad migratoria de las dos líneas celulares de cáncer gástrico (AGS) y Hs746T con y sin SM el tratamiento se evaluó a través de los poros 8μm transwell cámaras sin matrigel. Como se muestra en la Figura 1A, los porcentajes de migración de las células AGS disminuyeron de una manera dependiente de la dosis MPA, reducir a menos del 50% de las células AGS de control a concentraciones de & gt; 1.5μg /ml. Sin embargo, la capacidad migratoria de las células Hs746T no fue afectada por MPA a concentraciones similares. Del mismo modo, la invasión de células se ensayó usando 8μm poro Biocoat Matrigel cámaras de 8 micrones de invasión (Figura 1B). SM el tratamiento también disminuyó significativamente la capacidad invasora de las células AGS pero no las células Hs746T
A:. Imágenes de la migración de las células después del tratamiento con vehículo (DMSO) o diferente concentración de MPA durante 24 h. Las células que migran relativas medias se muestran en la parte inferior. B: Las imágenes de la invasión de las células después del tratamiento con vehículo (DMSO) o diferente concentración de MPA durante 24 h. Las células invasoras relativas medias se muestran en la parte inferior. * P & lt; 0,05 comparado con el control de DMSO.
inducidos por MPA expresión génica cambios relacionados con la migración de células de cáncer
Para identificar los genes alterados por SM el tratamiento, se realizó un experimento global de perfil transcriptónicos con AGS Las células tratadas con MPA. El uso de todo el conjunto de datos de expresión génica, hemos identificado KEGG vías que son alterados significativamente por la AMP. Ocho de los diez mejores vías de señalización cambiado significativamente (p53, ciclo celular, vías en el cáncer, la señalización de PPAR, cáncer de vejiga, de procesamiento de la proteína en el ER, cáncer de pulmón de células pequeñas y de señalización MAPK) son bien conocidos por estar relacionada con el cáncer. Los genes expresados diferencialmente también fueron asignadas a los procesos biológicos de ontología de genes y se realizó una prueba hipergeométrica para evaluar la significación de enriquecimiento para cada categoría. Nuestro análisis indicó que los genes enriquecido significativamente están implicados en el ciclo celular (1,6 enriquecimiento veces, p & lt; 10
-5), la muerte celular (1,7 veces el enriquecimiento, p & lt; 10
-7), la proliferación celular (1,8 veces el enriquecimiento, p & lt; 10
-7), y la migración celular (1,5 enriquecimiento veces, p & lt; 0,005). Los datos globales de expresión génica son consistentes con la actividad del MPA en la inhibición de proliferación de células cancerosas, la inducción de apoptosis y la inhibición de la migración.
Dado que el objetivo principal de este estudio es dilucidar el mecanismo molecular subyacente impacto de MPA en la migración de las células del cáncer, se analizaron en detalle los 50 genes relacionados con la migración con 2-4 veces las diferencias y los 15 genes relacionados con la migración con & gt; diferencias 4 veces entre células AGS tratados y no tratados (Figura 2). Se reconocen cuatro grupos distintos de genes. Los genes del grupo 1 son rápidamente hasta reguladas en el punto de tiempo de 12 horas y alcanzó su punto máximo en el punto de tiempo de 24 horas, pero un poco más tarde las reguladas. El cluster 2 genes se incrementaron ligeramente en el punto de tiempo de 24 horas, pero luego se vuelven más hasta reguladas en los puntos temporales 48h y 72h. El Cluster 3 genes son rápidamente las reguladas en los puntos temporales 12h y 24h, pero baja regulación se convierte en mucho menos en momentos posteriores, aunque el grupo de 4 genes están regulados hacia abajo en el 24h y los puntos más adelante. Las relaciones funcionales entre estos genes se representan en una red de regulación de genes (Figura 3). Posteriormente, también se evaluó la validez de los datos de expresión mediante el análisis de un subconjunto de genes candidatos utilizando en tiempo real de RT-PCR (Figura 4). Se obtuvieron un conjunto diferente de las muestras de ARN en diferentes puntos de tiempo de tratamiento (0, 12, 24 y 48 horas después del tratamiento) de las células AGS MPA-sensibles y las células Hs746T MPA-insensibles.
Zona de juego para los genes expresados diferencialmente después del tratamiento con MPA durante 0h, 12h, 24h, 48h y 72h. Cada muestra se representa en una columna y cada gen está representado en una fila. El aumento de expresión se indica como rojo y disminución de la expresión se indica como verde. genes representativos se muestran a la derecha del panel y grupos genéticos se indican a la izquierda.
Las transferencias de caja se muestran para cada gen. los niveles relativos de expresión se muestran en la escala log 2. FC (doble cambio) para cada punto de tiempo (12h, 24h y 48h) se compara con los controles no tratados (0h) con valores p respectivos.
MPA tratamiento severamente reguladas por los dos genes de los receptores de la superficie celular (
PDGFRA
y
LRP8
), un gen de la proteína quinasa (
PRKCA
), y otros cinco genes (
INF2
,
DOCK1
,
HSPA5
,
ARRB1
, y
IGFBP5
) (Figura 2). Seis de estos genes fueron seleccionados para la confirmación RT-PCR y los seis genes fueron confirmados a ser significativamente baja regulado por AMP en células AGS que son sensibles a MPA (Figura 4). Curiosamente, la mayoría de estos genes no fueron significativamente las reguladas por SM el tratamiento de las células Hs746T que son insensibles al tratamiento con MPA (Figura 4).
Por otra parte, SM el tratamiento de las células AGS significativamente hasta regulada la expresión de un gran número de genes implicados en la migración celular. Siete genes (
ATF3
,
SMAD3
,
CITED2
,
CEAMCAM1
,
CYR61
,
NOS en 3
y
CDH10
) tienen diferencia de más de cuatro veces y se destacan en el mapa de calor de microarrays (Figura 2). Real-time RT-PCR confirmó que
ATF3
se incrementa en un 10-20 pliegues en las células AGS después del tratamiento MPA, mientras que sólo se incrementa en 2-3 pliegues en las células Hs746T (Figura 4). Del mismo modo, el tratamiento MPA aumentó significativamente
CDH10
expresión en células AGS pero no en células Hs746T (Figura 4).
También realiza análisis de vías de enriquecimiento en los genes de migración celular 65 expresados diferencialmente después del tratamiento MPA. Los cinco primeros KEGG vías que son alterados significativamente por la MPA se presentan en la Tabla 1. Las vías de orientación de adhesión focal, citoesqueleto de actina y los axones están altamente relacionados con la migración celular y se inhiben significativamente por el tratamiento MPA, en consonancia con la reducción observada en la capacidad de migración del MPA tratados con células AGS. Además, la vía en el cáncer también se inhibe de manera significativa ya que varios genes juegan un papel importante en la proliferación celular y la apoptosis. La vía de TGF-beta se activa significativamente por el tratamiento MPA y este hallazgo es consistente con la función de supresión de TGF-beta y la actividad de MPA en la inhibición de la migración celular y la proliferación.
Camino Nombre
ID
pFDR
Estado
focal adhesion45101.46E-06InhibitedRegulation de actina-cytoskeleton48101.22E 05InhibitedPathways en la señalización pathway43500.00021ActivatedTable 1 cancer52002.21E-05InhibitedAxon guidance43600.00016InhibitedTGF-beta. los cinco mejores KEGG-vías de los genes de migración celular 65 alterados significativamente por el tratamiento MPA.
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inducidos por MPA cambios de señalización relacionadas con la migración
AKT
es una clave gen que se conecta con un gran número de genes expresados diferencialmente de migración en los datos de microarrays. Sin embargo, la expresión de la
AKT
genes no fue alterada por el tratamiento MPA. Por otra parte, la proteína Akt total sólo mostró ligero cambio en puntos de tiempo posteriores (Figura 5A). Curiosamente, fosfo-Akt (Ser473) fue severamente disminuyó por tratamiento MPA (Figura 5A). Estos resultados sugieren que el MPA también puede alterar la capacidad de migración de células AGS a través de influencia en el estado de activación de las proteínas de señalización clave como AKT, además de regular la expresión de genes
A:. Transferencias de Western de las proteínas seleccionadas . B:. FACS análisis
La expresión de los genes que codifican la tirosina quinasa Src es sólo marginalmente reducido regulado en los datos de microarrays. Desde Src está funcionalmente relacionado con un gran número de genes expresados diferencialmente de migración de los datos de microarrays (Figura 3), se determinó el nivel de expresión de la proteína de Src y encontramos que la proteína es drásticamente reducido regulado por SM el tratamiento (Figura 5A). Sin embargo, la razón precisa de los genes y la expresión de proteínas discrepancias observadas no está clara y que queda por investigar aún más.
inducida por MPA CD147 reducción
La tirosina quinasa Src también transmite señales de integrinas dependientes de centrales para el movimiento celular y la proliferación. Varios genes expresados diferenciales (
CEACAM1
y
CYR61
) están también implicados en la vía de señalización de la integrina. Por lo tanto, analizamos la expresión de varias integrinas en la superficie de células AGS y Hs746T utilizando el análisis FACS. Aunque la expresión de la
CD147
gen no fue alterada por el tratamiento MPA (Figura 4), la expresión de la proteína de superficie CD147 fue drásticamente reducido regulado después del tratamiento MPA (Figura 5B). Además, el análisis de Western blot confirmó además que el total de proteínas CD147 fue significativamente las reguladas por el tratamiento MPA (Figura 5A). Curiosamente, SM el tratamiento de las células Hs746T no alteró significativamente la expresión de superficie CD147. La expresión de ICAM-1 y la integrina beta 5 no se ha modificado por tratamiento MPA (Figura 5B).
MPA reduce la metaloproteinasa de matriz 1 (MMP-1)
tres proteínas MMP se midieron de la medio de cultivo de las células AGS y Hs746T después del tratamiento MPA utilizando ensayos de Luminex (Figura 6). Los niveles de proteína de MMP2 y MMP9 eran muy bajos en medio de cultivo de células AGS (datos no mostrados). MMP1 se redujo significativamente por el tratamiento MPA en una forma dependiente de la dosis en medio de cultivo celular AGS (Figura 6A), mientras que ningún cambio significativo se observó en células Hs746T (Figura 6B).
A: células AGS. células Hs746T: B.
Discusión
El MPA se sabe que inhibe específicamente la IMPDH, la enzima limitante de la velocidad para el
de novo síntesis de nucleótidos de guanosina, que son esenciales para la replicación del ADN así como ARN y síntesis de proteínas. MPA es también bien conocido para inhibir la proliferación de células cancerosas e inducir la apoptosis. En este estudio, hemos demostrado por primera vez que el MPA puede reducir significativamente las capacidades de migración e invasión de células AGS. Desde la metástasis es un problema importante frente a los pacientes de cáncer, la capacidad de MPA para inhibir la migración de células de cáncer y la invasión, además de su capacidad para inhibir la proliferación celular e inducir la apoptosis, hace MPA un excelente candidato a fármaco anti-cáncer.
En este estudio también utiliza una variedad de técnicas moleculares para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la función de MPA para inhibir la migración de células de cáncer. Hemos utilizado por primera transcriptómica mundial analiza para identificar genes candidatos migración alteradas por SM el tratamiento. Estos estudios sugirieron 50 genes con 2-4 veces las diferencias y los 15 genes con & gt; 4 veces las diferencias (Figura 2). Estos genes incluyen los receptores celulares de superficie, proteínas quinasas, y otros genes implicados en la regulación de la migración. La validez de los datos de microarrays ha sido confirmada por tiempo real de RT-PCR para los genes seleccionados con & gt; diferencias 4 veces (Figura 4). Además del análisis de transcriptómica, que también se utiliza varias tecnologías proteómicas y funcionales para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la actividad anti-migración de AMP. perfil transcriptónicos es una poderosa tecnología para evaluar los cambios moleculares globales. La principal ventaja de microarray de la expresión génica es su capacidad para evaluar con rapidez y económicamente el patrón de expresión de casi todos los genes expresados en las células de interés. A pesar del poder de esta clase de tecnologías, hay una serie de problemas que limitan microarrays principalmente como una herramienta de generación de hipótesis. La limitación más grave es la correlación imperfecta o la falta de correlación entre la expresión de genes y proteínas de expresión /función. Esta deficiencia se ilustra muy bien en este estudio como grandes diferencias en la expresión de proteínas de estado de activación fueron alterados por MPA, mientras que los niveles de expresión génica se mantuvieron sin cambios. Por lo tanto, es esencial combinar las tecnologías de transcriptómica y proteómica para la caracterización global de las funciones biológicas
.
Al menos tres genes que se sabe que promueven la migración celular (
INF2
,
DOCK1
y
HSPA5
) están reguladas por severamente (& gt; 4 veces) por el tratamiento MPA (Figura 2).
INF2
codifica la proteína formin 2 invertida, que promueve la formación de microtúbulos detyrosinated necesarias para la reorientación centrómero en células que migran [25]. El Dedicante de proteína citocinesis 1 (DOCK1) interactúa con HER2 y promueve la activación de Rac HER2 inducida y la migración celular [26]. HSPA5 es una proteína de respuesta al estrés inducido por agentes o condiciones que afectan negativamente a la función del retículo endoplásmico. Regula de forma activa múltiples fenotipos malignos incluyendo el crecimiento celular, la migración y la invasión. Baja regulación de estos genes por AMP es consistente con la capacidad migratoria de las células AGS reducida después del tratamiento MPA. Por el contrario, la sobreexpresión de β-arrestina-1 (
ARRB1
) reduce la propensión migratoria de líneas de células de cáncer de mama, mientras que el silenciamiento aumento de la migración [27]. En un estudio más reciente [28],
fue encontrado ARRB1
para promover la capacidad migratoria de la migración del cáncer de pulmón. Por lo tanto, no está claro en este momento si
ARRB1
inhibe o potencia la migración de células AGS. Otro gen drásticamente las reguladas,
IGFBP5
, induce la adhesión celular y aumenta la supervivencia celular en células MCF-7 de cáncer de mama humano [29]. IGFBP5 parece inhibir la migración de las células MCF7 [29], pero promueve la migración de las células mononucleares de sangre periférica [30]. Por lo tanto, el papel de IGFBP5 en la migración de células AGS queda por determinar.
SM el tratamiento de las células AGS también significativamente hasta regulada la expresión de varios genes implicados en la migración celular. Entre éstos, siete genes (
ATF3
,
SMAD3
,
CITED2
,
CEAMCAM1
,
CYR61
,
NOS3 Opiniones y
CDH10
) son de gran interés, ya que muestran diferencias más de cuatro veces en el mapa de calor de microarrays (Figura 2). Dos de los siete genes (
ATF3
y
CDH10
) fueron seleccionados y confirmada por tiempo real RT-PCR.
ATF3
expresión se incrementa en 11 veces 12 horas después del tratamiento y la MPA en un 19 veces mayor a las 48 horas.
CDH10
expresión está alterada en las células AGS pero no en células Hs746T (Figura 4). ATF3 Recientemente se ha demostrado para suprimir la metástasis de cáncer de vejiga a través de la regulación de la remodelación mediada por Gelson del citoesqueleto de actina. La sobreexpresión de
ATF3
en células de cáncer de vejiga altamente metastásicas disminuye la migración
in vitro
y
in vivo
[31]. El /vía de señalización Smad TGF-β juega un papel crítico en el crecimiento adenocarcinoma ductal pancreático, la migración y la metástasis. siRNA mediada por silenciamiento de SMAD3 aumenta la migración de células del cáncer de TGF-β inducida por [32]. En consonancia con la capacidad migratoria de las células AGS reducida después del tratamiento MPA, SMAD3 es significativamente hasta reguladas por SM el tratamiento (Figura 2).
CITED2
codifica la proteína transactivadora 2 Cbp /p300-que interactúan, que regula positivamente la señalización a través de su asociación con el /complejo coactivador transcripcional mediada por la CBP /p300 SMAD TGF-β y estimula varias otras actividades de la transcripción. Se ha demostrado que
Cited2
ratones knockout han aumentado la migración de células gonadal [33]. Por lo tanto, hasta reguladas
CITED2
la expresión del gen puede contribuir a la capacidad migratoria de las células AGS reducida tratados con MPA.
CEACAM1
codifica la molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario (CD66a), que afecta a la señalización dependiente de integrina y regula matriz de la morfología y la migración de las células endoteliales [34] extracelular específico de la proteína. Aunque la mayoría de los estudios han demostrado que solo CEACAM1 juega un papel promigratory, la interacción de CEACAM1 y filamina A la migración celular y la dispersión reducido drásticamente [35]. Por lo tanto, el papel de CEACAM1 en la migración celular puede depender del contexto celular.
Sin embargo, dos de los genes altamente regulados hasta por AMP (
CYR61
y
NOS en 3
) en realidad promover la migración.
CYR61
codifica la proteína rica en cisteína 61, que promueve la migración de células a través de la alteración de las funciones de la integrina [36]. La regulación de
CYR61 fotos: por SM el tratamiento puede reducir la función anti-migratoria de AMP. El óxido nítrico promueve la migración de células de tumor de mama a través de la activación secuencial de la sintasa de óxido nítrico, la guanilato ciclasa y activada por mitógenos proteína quinasa [37].
NOS en 3
codifica el óxido nítrico sintasa 3 y es altamente hasta reguladas por SM el tratamiento. Una vez más, sobre regulación de
NOS en 3
puede reducir la función antimigratorio del MPA. El
CDH10
gen codifica una de las proteínas cadherina que desempeñan papeles cruciales en la adhesión célula-célula. Se ha deducido que CDH10 puede jugar un papel crítico en la migración celular mesendodermal aunque esta relación inferido no se ha probado experimentalmente.
CDH10
se incrementa drásticamente por SM el tratamiento de las células AGS, pero no en las células Hs746T y su papel en la migración debe ser probado experimentalmente.
PDGFRA
codifica un miembro de tirosina quinasa del receptor de la superficie celular de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas y se sabe que está estrechamente relacionado con la migración de células [38].