Extracto
El ácido ascórbico (AA) muestra una actividad anticancerígena significativa a dosis farmacológicas alcanzables mediante administración parenteral que tienen efectos mínimos sobre las células normales. Por lo tanto, AA tiene usos potenciales como un agente quimioterapéutico solo o en combinación con otros agentes terapéuticos que se dirigen específicamente el metabolismo de las células de cáncer. Se compararon los efectos de AA y combinaciones de AA con el inhibidor de la glucólisis 3- (3-piridinil) -1- (4-piridinil) -2-propen-1-ona (3-PO) en la viabilidad de tres no pequeñas líneas celulares de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) a los efectos de una línea de células epiteliales de pulmón inmortalizado. las concentraciones de AA de 0,5 a 5 mM causó una pérdida completa de viabilidad en todas las líneas de NSCLC en comparación con a & lt; 10% de pérdida de viabilidad en la línea celular epitelial de pulmón. Las combinaciones de AA y 3-PO sinérgicamente reforzada en la muerte celular en todas las líneas celulares de cáncer en concentraciones muy por debajo de los IC
50 concentraciones para cada compuesto solo. Una interacción sinérgica no se observó en los tratamientos de combinación de las células epiteliales del pulmón y tratamientos de combinación que causó una pérdida completa de viabilidad en células de NSCLC tenido efectos modestos sobre la viabilidad celular de pulmón normal y los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). tratamientos de combinación indujo niveles de ROS drásticamente más alta en comparación con el tratamiento con AA y 3-PO solo en células de NSCLC y la muerte celular combinación inducida se inhibió mediante la adición de catalasa al medio. Los análisis de la fragmentación del ADN, poli (ADP-ribosa) polimerasa de escisión, la actividad de caspasa V vinculante, y anexina demostraron que la muerte celular AA inducida es causado a través de la activación de la apoptosis y que los tratamientos de combinación provocó una inducción sinérgica de la apoptosis. Estos resultados demuestran la eficacia de AA frente a células de NSCLC y que las combinaciones de AA con 3-PO sinérgicamente inducen la apoptosis a través de un mecanismo de ROS-dependiente. Estos resultados apoyan aún más la evaluación de las concentraciones farmacológicas de AA como un tratamiento adyuvante para el NSCLC y esa combinación de AA con inhibidores de la glicólisis puede ser una terapia prometedora para el tratamiento del NSCLC
Visto:. Vuyyuri SB, Rinkinen J, Worden e, H cuña, Lee S, Davis KR (2013) ácido ascórbico y un inhibidor de la glucólisis citostático sinérgicamente inducir la apoptosis en células de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (6): e67081. doi: 10.1371 /journal.pone.0067081
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Noviembre 2012; Aceptado: 15-may de 2013; Publicado: 11 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Vuyyuri et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Algunas partes de este proyecto se hizo posible gracias a un contrato que fue adjudicado y administrado por el Ejército de los EE.UU. de Investigación médica & amp; Comando de Material (USAMRMC) y la telemedicina & amp; Centro de Tecnología Avanzada de Investigación (TATRC), bajo el Número de Contrato: W81XWH-09-2-0022. Los puntos de vista, opiniones y /o conclusiones contenidas en esta investigación son las de los autores y no reflejan necesariamente las opiniones del Departamento de Defensa y no deben interpretarse como una posición oficial del Departamento de Defensa /Ejército, la política o la decisión a menos que estén designados por otra documentación. Sin reconocimiento oficial debe hacerse. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Una característica única de muchas células tumorales es aumento de la captación de glucosa y la glucólisis aeróbica elevada con una reducción concomitante en la fosforilación oxidativa a través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). Esta notable reprogramación metabólica, conocido como el efecto Warburg [1], representa un objetivo potencial para la inhibición de la proliferación celular incontrolada que es una característica del cáncer. explicaciones iniciales de la dependencia de las células cancerosas de la glucólisis aeróbica sugirieron que las células cancerosas contienen mitocondrias defectuosas y por lo tanto, se requiere una mayor glucólisis para generar ATP para impulsar la proliferación celular. Sin embargo, ahora se sabe que la mayoría de las células cancerosas tienen mitocondrias funcionales, y que los cambios metabólicos asociados con el efecto Warburg están dirigidos a proporcionar precursores biosintéticos de aminoácidos, nucleótidos y lípidos [1], [2]. Además de la conducción aumento de la glicolisis, la absorción mejorada de glucosa característica de muchas células cancerosas es compatible con el aumento de flujo a través de la derivación de las pentosas fosfato y la producción de ribosa-5-fosfato para la biosíntesis de nucleótidos. Quizás lo más importante, el aumento de flujo a través de la derivación de las pentosas fosfato puede aumentar la cantidad de NADPH disponible para apoyar la actividad metabólica y proporcionar protección contra el estrés oxidativo. NADPH adicional y precursores biosintéticos se producen por el catabolismo de la glutamina [3]. Por lo tanto, el efecto Warburg requiere el control altamente coordinada de la glucólisis, la derivación de las pentosas fosfato, glutaminolysis y el ciclo TCA mitocondrial.
La dependencia única de células de cáncer de la glucólisis los hace vulnerables a la intervención terapéutica con inhibidores de la glicólisis específicos. Varias enzimas glucolíticas, incluyendo hexoquinasa II, lactato deshidrogenasa A, y la isomerasa de glucosa-6-fosfato, se expresa en más células tumorales y sirven tanto facilitadores como reguladores de la progresión del cáncer [4], [5]. Varios componentes de la vía glucolítica se han apuntado para el desarrollo de terapias, aunque muy pocos han sido evaluados en ensayos clínicos. 2-desoxi-D-glucosa (2-DG), 3-bromopiruvato y lonidamina se ha informado que son inhibidores útiles de orientación glicolíticas hexoquinasa, la enzima de punto de entrada para la glucólisis [5], [6]. 3-bromopiruvato también inhibe la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) [6] y un estudio reciente indicó que propil éster 3-bromopiruvato fue un inhibidor más eficiente de GAPDH en comparación con hexoquinasa en células de carcinoma colorrectal [7]. Otra enzima glicolítica clave altamente expresado en las células tumorales es 6-fosfofructo-2-quinasa /fructosa-2,6-bisfosfatasa isoenzima 3 (PFKFB3), que genera la fructosa-2,6-bifosfato (Fru-2,6-BP). Fru-2,6-BP alivia la represión de la tasa clave enzima limitante de 6-fosfofructo-1-quinasa por ATP, lo que permite altas tasas de glucólisis en presencia de los niveles de ATP altos [8]. inhibidores de moléculas pequeñas de PFKFB3 han sido identificados y se muestra para inhibir el crecimiento de células tumorales [9], [10]. Estos nuevos inhibidores representan una nueva clase de inhibidores de la glicólisis y más validan los inhibidores de la glicolisis como potenciales terapéutica del cáncer, [4], [11].
A pesar de la dependencia de las células cancerosas de la glucólisis para la generación de ATP, inhibiendo la glucólisis utilizando glicolítica inhibidores a menudo no prueba para ser eficaz en matar las células tumorales como se ejemplifica en una serie de
in vivo
experimentos [4], [5], [12] - [18]. Esto sugiere que las estrategias dirigidas a la inhibición de la glicólisis pueden requerir múltiples agentes que agotan la ATP con diferentes mecanismos de acción [16] o que los inhibidores de la glucólisis debe ser emparejado con otros inhibidores del metabolismo específicos de tumores. Este enfoque ha demostrado su eficacia en varios casos [12] -. [15], [17], [18], lo que sugiere que los tratamientos de combinación usando inhibidores glucolíticas se combina con otros agentes contra el cáncer podría ser muy potente en la clínica
El ácido ascórbico (AA) se ha demostrado que tienen cáncer potencial terapéutico; Sin embargo, hasta la fecha su valor terapéutico sigue siendo controvertida [19] - [23]. A concentraciones más bajas, principalmente funciones de AA como un antioxidante y puede proteger las células del estrés oxidativo, mientras que a altas concentraciones de AA actúa como un pro-oxidante que impone el estrés oxidativo e induce la muerte celular [20], [23] - [27]. Es probable que esta naturaleza dual dependiente de la concentración de AA es la base para la eficacia inconsistente de AA en la terapia del cáncer, ya que sólo las concentraciones farmacológicas de AA más altos que los que se puede obtener por la administración oral probablemente ejercen efectos contra el cáncer [28]. AA ha demostrado ser selectivamente más tóxico para las células de cáncer en comparación con correspondientes células normales [29] - [32]. Un componente importante de esta citotoxicidad selectiva es la capacidad de las concentraciones farmacológicas de AA para imponer estrés oxidativo en las células cancerosas a través de la generación de ROS y peróxido de hidrógeno [33] - [35]. Dado que las células de cáncer en general tienen mayores niveles de especies reactivas de oxígeno, parece que el estrés oxidativo adicional impuesta por AA no se puede mejorar por respuestas antioxidantes de las células y la muerte celular se activa [36]. Varios estudios han demostrado que las combinaciones de AA con otros agentes contra el cáncer a menudo presentan una mayor citotoxicidad [34], [37] - [40]
En este estudio, se determinó que AA es selectivamente tóxico para varios no pequeñas. cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) líneas de células y que la combinación de AA y 3- (3-piridinil) -1- (4-piridinil) -2-propen-1-ona (3-PO), un nuevo inhibidor de PFKFB3 con significativa actividad contra el cáncer [9], sinérgicamente induce la apoptosis en las células NSCLC.
resultados
AA y 3-PO sinérgica inhibir el crecimiento de líneas celulares de NSCLC pero no las células epiteliales bronquiales
Anterior estudios demostraron que AA disminuye selectivamente la proliferación celular en algunas líneas celulares de cáncer sin afectar a las células normales [29] - [32]. Hemos iniciado estudios para determinar si este es el caso para las células de NSCLC y para determinar si las combinaciones de AA con el inhibidor glicolítico 3-PO fueron más efectivos que AA solo. Se completaron los estudios iniciales para determinar el CI
50 para AA y 3-PO en tres líneas celulares de NSCLC (H1299, H661 y A549) y una línea inmortalizada de células epiteliales de pulmón (BEAS-2B) utilizando una viabilidad celular de exclusión con azul de tripano ensayo. El 24 h IC concentraciones
50 para AA en las tres líneas de NSCLC varió de 0,57 to1.71 mM, con H1299 es el más sensible (Fig. 1A). Las células BEAS-2B eran mucho más tolerantes al tratamiento AA, con una CI
50 concentración & gt; (Fig. 1C) 20 mM. Estos resultados demostraron que las células de NSCLC son considerablemente más sensibles a AA en comparación con las células epiteliales de pulmón BEAS-2B. El 24 h IC
50 concentraciones para 3-PO en las tres líneas de NSCLC varió desde 25 hasta 67 mM, con H1299 ser otra vez el más sensible (Fig. 1B). El IC
50 de concentración para las células BEAS-2B era 105 mu M, lo que demuestra que las células epiteliales del pulmón inmortalizadas fueron de 1,5 a 4,2 veces más resistente a la 3-PO en comparación con las células de NSCLC.
(A) la viabilidad celular de NSCLC H1299, H661 y células A549 como una función de la concentración de AA. (B) La viabilidad celular de NSCLC H1299, H661 y células A549 como una función de concentración de 3-PO. (C) La viabilidad celular de las células NSCLC H1299 y células epiteliales de pulmón BEAS-2B después del tratamiento con AA solos y combinaciones de AA con 10 mM 3-PO. Las células fueron tratadas durante 24 h y luego se evaluaron usando el ensayo de exclusión de viabilidad con azul de tripano y se normalizaron con el control tratado con el vehículo apropiado. Los datos representan la media ± SEM determina a partir de tres experimentos individuales. IC
50 Los valores indicados se calcularon utilizando el software GraphPad Prism.
A continuación se investigó los efectos de las combinaciones de AA y 3-PO sobre la viabilidad de la línea celular H1299 más sensible en comparación con BEAS- 2B. Para estos experimentos, las células se trataron con 10 mM 3-PO, y concentraciones de AA que van desde 0,1 a 20 mM. Los tratamientos de combinación con AA y 3-PO no tuvo un marcado efecto sobre la viabilidad de las células BEAS-2B durante los intervalos de concentración ensayados con la máxima disminución de la viabilidad de 18% ± 1,3 observado en el AA 20 mM /10 mM 3- PO tratamiento (Fig. 1C). Los valores Drewinko Index (DI) para todas las combinaciones de AA y 3-PO probados en BEAS-2B variaron de 1.0 a 1.1, lo que indica que los cambios de viabilidad modestos observados se deben a los efectos aditivos de 3-PO y AA. Por el contrario, los tratamientos de combinación fueron significativamente más eficaz para matar las células H1299 en comparación con AA solo (Fig. 1C). El tratamiento con 300 mM o 500 mM AA solo disminuyó la viabilidad celular en 15,3% y 26,3%, respectivamente, mientras que en presencia de 10 mM 3-PO, 300 M y 500 M AA reducción de la viabilidad de 84% y 96%, respectivamente. El tratamiento de combinación IC
50 fue 3 veces menor que el CI
50 de AA solo en H1299. El DI valores para los tratamientos de combinación que contiene 300 mM y 500 mM de AA fueron 4,9 y 18,7, respectivamente, y demuestran una fuerte interacción sinérgica entre AA y 3-PO.
Para determinar si una interacción sinérgica similar entre AA y 3-PO se produjo en otras líneas de NSCLC, la viabilidad celular se comparó en BEAS-2B, H1299, H661 y A549 células tratadas con 300 mM de AA, 10 M (BEAS-2B, H1299) o 30 mM 3-PO (H661, A549) , o una combinación de AA con 3-PO durante un periodo de 72 h después del tratamiento. Como se observó anteriormente, estos tratamientos tenían efectos modestos sobre la viabilidad de células BEAS-2B (Fig. 2A). La máxima pérdida de la viabilidad en BEAS-2B se produjo a las 72 h, y fue del 30% con el tratamiento combinado. Los valores de DI para el tratamiento de combinación en el período de tratamiento varió desde 1,0 hasta 1,1, lo que confirma que no hay una interacción sinérgica entre AA y 3-PO en células BEAS-2B. Por el contrario, las combinaciones de AA y 3-PO sinérgicamente mataron a las tres líneas de NSCLC, con significativa (
P
& lt; 0,05) sinérgica (DI & gt; 1) efectos claramente evidente durante el período de tratamiento de 72 h (Fig. 2B-D). Los efectos del tratamiento de combinación en H1299 y H661 fueron similares, con una pérdida casi completa de la viabilidad a las 72 h. las células A549 fueron más sensibles al tratamiento de combinación, con una pérdida casi completa de la viabilidad a las 48 h. Los valores de DI para el tratamiento de combinación a las 72 h oscilaron desde 22,2 hasta 62,6 para las tres líneas de NSCLC, lo que indica una fuerte interacción sinérgica. Estos resultados demuestran que una combinación de AA y 3-PO induce sinérgicamente la muerte celular en varias líneas de NSCLC y confirma que una interacción similar no se produce en el pulmón línea de células epiteliales BEAS-2B.
Células epiteliales
pulmonares BEAS- 2B (A) y de NSCLC células H1299 (B), H661 (C), y A549 (D) fueron tratadas con 300 mM AA solo, 10 M (BEAS-2B, H1299) o 30 mM (H661, A549) 3-PO solo, o una combinación de AA y 3-PO. Las células de control se trataron con vehículo solo. A los 24, 48 y 72 h post-tratamiento, la viabilidad celular se determinó usando el ensayo de exclusión de azul de tripano. Los datos representan la media ± SEM determina a partir de tres experimentos individuales. un; una diferencia estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) de control tratado con vehículo. segundo; una diferencia estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) de control y AA individual y tratamientos 3-PO. Drewinko Índice de valores (DI) se calcularon utilizando la fórmula SF1 x SF2 /SF1 + 2 donde SF1, SF2 y SF1 + 2 representan la fracción superviviente de las células tratadas con AA solo, 3-PO solo, y la combinación de AA y 3- PO, respectivamente. DI valores & gt; 1 indica un efecto sinérgico, DI = 1 indica un efecto aditivo; y los valores de DI & lt; 1 indica un efecto antagonista
Una vez establecido que AA y 3-PO causan una inducción sinérgica de la muerte celular en líneas de células de NSCLC, se investigó aún más las interacciones de una gama de AA. y las concentraciones de 3-PO en las células H1299 (Fig. 3A). Las concentraciones de 1-10 mM 3-PO no tuvieron un efecto significativo sobre la viabilidad de las células H1299, mientras que 30 mM 3-PO causó una pérdida del 60% en la viabilidad. Las concentraciones de AA 50-500 mu M mostraron una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad, con 500 M causando una pérdida del 40% en la viabilidad. Se observó una respuesta sinérgica significativa en células H1299 en un amplio intervalo de AA y 3-PO combinaciones (Fig. 3b, Tabla 1). Las combinaciones de 100, 300 y 500 M AA con concentraciones de 3-PO ≥ 3 M causó la inducción sinérgica de la muerte celular [índice de combinación (IC) & lt; 1]. El tratamiento de combinación que contiene 50 mM con 30 mM 3-PO también causó un efecto sinérgico significativo que dio como resultado & gt; 90% de muerte celular (CI = 0,16). Varios tratamientos de combinación causados sólo efectos aditivos o potencialmente interacciones antagónicas (IC & gt; 1). Sin embargo, estos casos solo se observaron en las combinaciones que contienen las más bajas concentraciones de AA y 3-PO probados; estas concentraciones de 3-PO y AA solos causaron menos de un 5% de pérdida de viabilidad. Estos resultados demuestran combinaciones de AA y 3-PO en concentraciones de más de 20 veces menor que su respectivo IC
50 resultó en la inducción sinérgica de la muerte celular y una pérdida casi completa de la viabilidad celular NSCLC H1299.
(a) la viabilidad celular como una función de la concentración de 3-PO en combinación con las concentraciones de AA que van de 50 a 500 mM. (B) isobolograma normalizada para cada una de las combinaciones de 3-PO y AA probadas. células H1299 se trataron con 3-PO (1, 3, 10, 30 M) solo o en combinación con diferentes concentraciones de AA (25, 50, 100, 300 o 500 m). La viabilidad celular se evaluó 24 h después del tratamiento utilizando el ensayo de viabilidad de exclusión con azul de tripano. Los datos representan la media ± SEM determina a partir de tres experimentos individuales. Los datos del isobolograma fueron generados por software Calcusyn usando el método de la relación no constante y los datos mostrados en (A). Los símbolos indican los valores obtenidos en los tratamientos combinados que contienen la concentración indicada de AA.
Contribución de ROS y H
2O
2 al mecanismo de inducción de muerte celular por combinaciones de AA con la página 3-PO
los estudios anteriores han establecido que las ROS y H
2O producido
2 a través de la oxidación de AA es un mediador crucial de AA-citotoxicidad inducida [29], [31], [ ,,,0],33], [41], [42]. Se evaluó el potencial importancia de la producción de ROS en la sensibilidad de las células de NSCLC a combinaciones de AA y 3-PO por tratamiento de las células BEAS-2B y H1299 con una combinación de 10 M 3-PO con 300 mM AA y la medición de la fluorescencia celular de la ROS reportero 5- (y-6) -chloromethyl-2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein, éster de acetilo (CM-H
2DCFDA). los niveles de ROS no se vieron afectados significativamente en células BEAS-2B por AA o 3-PO solo durante un periodo de tratamiento de 4 h, o en tratamientos de combinación de 2 h o menos. La única estadísticamente significativa (
P
& lt; 0,05) efecto observado en células BEAS-2B se produjo con el tratamiento de combinación a las 4 h donde se observó un aumento de 51% en ROS (Fig 4A y Fig. S1.). Una significativa (
P
& lt; 0,05) se observó aumento en los niveles de ROS tan pronto como 15 min en células H1299 tratadas con AA o la combinación de 3-PO y AA, siendo el nivel de tratamiento de combinación sobre 2 -fold mayor que AA solo (Fig. 4B y la Fig. S1). los niveles de ROS en células AA-tratada siguieron aumentando modestamente y eran 4 veces más alto que el control tratado con vehículo en 4 h. 3-PO también indujo bajos niveles de producción de ROS entre 1 y 4 h de tratamiento que eran 2 veces mayor que el control. En contraste, el tratamiento de combinación indujo mucho más altos niveles de ROS que alcanzaron un máximo en 2 a 4 h; estos niveles eran 13 veces mayores que el control y significativamente mayor que los efectos suma de los AA individual y los tratamientos 3-PO. Los niveles de ROS en células H1299 en 4 h fueron 7 veces mayores que las células BEAS-2B de combinación tratados. Estos resultados demuestran que las combinaciones de AA y 3-PO inducen selectivamente altos niveles de ROS en H1299 comparado con BEAS-2B y sugieren que la producción de ROS es un componente de la inducción sinérgica de la muerte celular combinación inducida observada en las células de NSCLC.
células
BEAS-2B (a) y H1299 (B) fueron tratados con AA (300 mM), 3-PO (10 mM) o una combinación de AA y 3-PO durante los tiempos indicados. Las células se tiñeron con 5 mM CM-H
2DCFDA a 37 ° C en la oscuridad durante 30 min para detectar intracelular de ROS. Los datos representan medias ± SEM de dos experimentos independientes en los que se analizaron 100-125 células por muestra para la intensidad de fluorescencia. un; una diferencia estadísticamente significativa (P & lt; 0,05) de vehículo tratados control. segundo; una diferencia estadísticamente significativa (P & lt; 0,05). tratamientos de control y AA individual y 3-PO
Para determinar el grado en que H
2O
2 mediado el efecto de AA en la sensibilización NSCLCs a 3-PO, H1299 células fueron tratadas con una combinación de 10 M 3-PO con 300 mM AA, ya sea en la presencia o ausencia de catalasa en el medio de cultivo. Una significativa (
P
& lt; 0,05) se observó dependiente de la dosis reversión del efecto citotóxico de la combinación de AA y 3-PO largo de un intervalo de concentraciones de 25 a 1500 unidades de catalasa (Fig 5A.). El rescate por la catalasa no fue completa; la inhibición de la muerte celular se estabilizó en ~ 80% de viabilidad. El papel de H
2O
2 en la mediación de la activación sinérgica de la muerte celular por una combinación de AA y 3-PO se ensayó adicionalmente por las células pre-incubación con aminotriazol, un inhibidor de catalasa bien conocido, antes del tratamiento con AA y 3-PO. Una significativa (
P
& lt; 0,05) la mejora de la muerte celular en comparación con aminotriazol solo se observó sobre un intervalo de concentración aminotriazol de 30 a 100 mM (Fig 5B.) Dependiente de la dosis. Esto demuestra que la inhibición de la actividad de la catalasa endógena aumenta la inducción sinérgica de la muerte celular por una combinación de AA y 3-PO. Reducción En conjunto, estos estudios demuestran la importancia mecanicista de H
2O
2 en la inducción sinérgica de la muerte celular en células de NSCLC por co-tratamiento con AA y 3-PO.
(A) de muerte celular combinación inducida por la adición de catalasa al medio de cultivo. células H1299 fueron tratados con AA solo (300 mM), 3-PO solo (10 mM), una combinación de AA y 3-PO, catalasa sola (25, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 IU), o combinaciones de AA, 3-PO y catalasa. (B) Mejora de la muerte celular inducida por la combinación de la adición del inhibidor de aminotriazol catalasa (ATA) al medio de cultivo. células H1299 fueron tratados con AA solo (300 mM), 3-PO solo (10 mM), una combinación de AA y 3-PO, ATA solo (30, 50, 100 mM), o combinaciones de AA, 3-PO y ATA. Las células se evaluaron 24 h después del tratamiento utilizando el ensayo de viabilidad de exclusión con azul de tripano. Los datos representan la media ± SEM determina a partir de tres experimentos individuales. un; una diferencia estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) de control tratado con vehículo. segundo; una diferencia estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) de control y AA individual y tratamientos 3-PO. do; una diferencia estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05). de AA y 3-PO tratamiento combinado
Combinación de AA y 3-PO induce la apoptosis en las células NSCLC
el examen microscópico de células de NSCLC tratados con combinaciones de AA y 3-PO reveló que las células tratadas mostraron los cambios morfológicos clásicos asociados con la apoptosis, incluyendo el encogimiento celular, formación de ampollas y la formación de cuerpos apoptóticos. Para investigar más si la inducción sinérgica de la muerte celular en células de NSCLC mediante la combinación de 3-PO y AA era en efecto, debido a la apoptosis, se evaluó la fragmentación del ADN, una característica de las células sometidas a la apoptosis. la fragmentación de ADN se midió primero utilizando el ensayo de cometa en células de NSCLC H1299 y las células epiteliales de pulmón BEAS-2B tratados con AA o 3-PO solos y en combinación (Fig. 6A y B). El tratamiento con 10 mM 3-PO solo no causó un aumento significativo en la fragmentación del ADN, ya sea en línea celular mientras que 300 M AA causó una modesta, pero significativa (
P
& lt; 0,05) aumento tanto BEAS-2B y células H1299 a las 24 h después del tratamiento. La combinación de 3-PO y AA no causó significativamente más fragmentación del ADN en las células BEAS-2B que la observada en las células tratadas con AA solo. Por el contrario, la cantidad de fragmentación de ADN observada en las células H1299 fue significativamente (
P
& lt; 0,05) más alta en el tratamiento de combinación (75,02 ± 2,29) en comparación con los tratamientos individuales y con el control (AA 25,63 ± 2.38, 3-PO 19,63 ± 2,24, 17,96 ± 1,66 controlar) y fue significativamente mayor que los efectos suma de los tratamientos individuales de AA y 3-PO.
(A) imágenes ensayo cometa de BEAS-2B epiteliales de pulmón las células y las células H1299 tratadas con AA (300 mM), 3-PO (10 mM), o una combinación de AA y 3-PO. Las células se procesan 24 horas después del tratamiento y las células tratadas con vehículo se incluyeron como un control. (B) La cuantificación de la fragmentación del ADN detectado por el ensayo de cometa en las células epiteliales de pulmón BEAS-2B y las células H1299 tratadas con AA, 3-PO, o la combinación de AA y 3-PO. Las células se procesan 24 h después del tratamiento. La media de datos de longitud de la cola del cometa representan las medias ± SEM determinado a partir de tres experimentos independientes fueron la longitud de la cola de 150 células por tratamiento se midió en cada experimento. (C) La cuantificación de la fragmentación de ADN mediante ensayos de TUNEL. células H1299 fueron tratados con AA (300 mM), 3-PO (10 mM), o una combinación de AA y 3-PO durante los tiempos indicados. La detección de células TUNEL positivas utilizando el Sistema de DeadEndTM fluorométrico TUNEL. Los datos representan medias ± SEM de dos experimentos independientes, donde un mínimo de 100 células por muestra se visualizaron en cada experimento. un; una diferencia estadísticamente significativa (P & lt; 0,05) de vehículo tratados control. segundo; una diferencia estadísticamente significativa (P & lt; 0,05). de control tratado con vehículo y los tratamientos individuales de AA y 3-PO
Se realizaron estudios adicionales de la fragmentación del ADN en células H1299 utilizando un etiquetado terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP nick extremo ( TUNEL) de ensayo para evaluar la cinética de la fragmentación del ADN durante las primeras 24 h de tratamiento (Fig. 6C). Modesta pero significativa (
P
& lt; 0,05) el aumento de la fragmentación de ADN se observaron en las células tratadas con AA o 3-PO solo a partir de las 4 y 12 h, respectivamente. Después de 24 h de tratamiento, la cantidad de fragmentación de ADN observada en las células tratadas con 3-PO AA-tratado y era 6 veces y 2,5 veces mayores, respectivamente, en comparación con el control tratado con vehículo. Combinación de AA y 3-PO indujo una significativamente mayor (
P Hotel & lt; 0,05) el nivel de fragmentación del ADN en comparación con los tratamientos de control e individuales tan pronto como 2 horas después del tratamiento. la fragmentación del ADN en las células tratadas con la combinación comenzó a meseta a las 12 h después del tratamiento y fue 20 veces mayor que el control a las 24 h después del tratamiento. El nivel de fragmentación de ADN observada en las células tratadas con la combinación en todos los puntos de tiempo ensayados también fue significativamente mayor que los efectos suma de los AA individual y los tratamientos 3-PO. Estos resultados son consistentes con los estudios de ensayo de cometa y sugieren que la inducción de la apoptosis es un componente de la muerte celular inducida por combinación en células H1299.
A fin de evaluar si la muerte celular inducida por la combinación de AA y 3- PO estaba relacionado con la inducción de la apoptosis, se analizó el grado de división de PARP. PARP es una proteína de estrés-respuesta 116 kDa involucrada en la reparación del ADN dañado y regula estructura de la cromatina por poli (ADP-ribosilación) de las proteínas nucleares. La escisión proteolítica de PARP en 89 kDa y 24 kDa fragmentos por caspasas es un indicador de apoptosis [43]. Los niveles de PARP escindida se midieron por inmunotransferencia de lisados de células 24 h después del tratamiento con 300 mM AA, 10 mM 3-PO o una combinación de AA y 3-PO durante 24 h (Fig. 7A y B). El tratamiento con 3-PO solo no causó un aumento significativo de la PARP escindida (89 fragmento kDa). Se observó un aumento en la acumulación de PARP escindida en las células tratadas con AA solo o la combinación de AA y 3-PO que fue significativamente (
P
& lt; 0,05) más alta que el control del vehículo. La extensión de la escisión de PARP en células tratadas con la combinación de AA y 3-PO fue significativamente (
P
& lt; 0,05). Mayor que en las células tratadas con AA solo
(A) H1299 las células se trataron con AA (300 mM), 3-PO (10 mM), o la combinación de AA y 3-PO. Las células se recogieron 24 h después de extractos de tratamiento y de proteínas sometidas a análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo de PARP específico. Duplicar inmunotransferencias sondadas con un anticuerpo-actina específica servido como controles de normalización. (B) La cuantificación de los niveles de PARP escindida (Cl PARP) se realizó mediante el análisis de imágenes de las inmunotransferencias utilizando Carestream Molecular Imaging Software versión 5.0. Las mediciones de la intensidad mostrados representan la media ± SEM determinan a partir de tres experimentos independientes. un; una diferencia estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) de control tratado con vehículo. segundo; una diferencia estadísticamente significativa (
P
& lt; 0,05). de los tratamientos de control y AA individual y 3-PO
Uno de los primeros acontecimientos de la apoptosis involucra la translocación de fosfatidilserina a la superficie de la célula que se puede detectar usando ensayos de unión sobre la base de la anexina V. Por lo tanto, para evaluar adicionalmente si la muerte celular inducida en células H1299 por tratamientos de combinación de AA y 3-PO es debido a la apoptosis, se analizaron las células tratadas por la unión de anexina V y tinción con yoduro de propidio para medir temprana de apoptosis (anexina yoduro de V + /propidio -) y apoptótica tardía (anexina V + /propidio yoduro +) poblaciones de células (Fig. 8A y B). El tratamiento con 10 mM 3-PO sí solo no tiene un efecto significativo en el número de células apoptóticas tempranas o tardías en comparación con el control. El tratamiento con 300 M AA indujo una disminución significativa (
P Hotel & lt; 0,05) aumento gradual en los dos células apoptóticas tempranas y tardías. Early se detectaron células apoptóticas tan pronto como 15 min después del tratamiento y alcanzó un máximo de 29% en 3 h post-tratamiento. El porcentaje de células apoptóticas tempranas disminuyó a 4 h. Una acumulación gradual similar de células apoptóticas finales se produjo en células AA-tratado durante el período de tratamiento de 4 h, con la primera diferencia significativa detectable desde el control observado a los 30 minutos y alcanzó 18% en 4 h. El tratamiento de combinación también mostró un aumento gradual de células apoptóticas tempranas de 15 min a 3 h, sin embargo, el porcentaje de células apoptóticas tempranas fue significativamente mayor que la observada con AA solo y alcanzó un máximo de 56% en 3 h post-tratamiento. Similar a la AA tratamiento solo, el número de células apoptóticas tempranas disminuyó con un aumento concomitante de células apoptóticas finales en 4 h. El porcentaje de células apoptóticas finales a las 4 h post-tratamiento fue de 50% y fue significativamente (
P
& lt; 0,05). Mayor que el 26% observado en células tratadas con AA solo
( A) Análisis de células apoptóticas tempranas y (B) células apoptóticas tarde por la anexina V vinculante y la tinción de propidio yoduro. células H1299 fueron tratados con AA (300 mM), 3-PO (10 mM) o una combinación de AA y 3-PO durante los tiempos indicados. Las células fueron teñidas con anexina V y yoduro de propidio y se visualizaron por microscopía de fluorescencia. Un mínimo de 200 células se anotó para cada muestra y los datos representan las medias ± SEM de tres experimentos independientes. (C) Análisis de la caspasa 3/7 actividad. Chen et al. Chen et al.