Extracto
A pesar de muchas evidencias que apoyan el concepto de "adicción oncogén" y muchas hipótesis racionalizarlo, hay es todavía una falta de comprensión detallada de los mecanismos moleculares subyacentes adicción oncogén precisa. En esta cuenta, hemos desarrollado un modelo matemático del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de la red de señalización asociado, lo que implica la proliferación de EGFR-conducción /vías Ras /extracelular señal-quinasa regulada (ERK) y la fosfo-3-quinasa (señalización pro-supervivencia PI3K) /Akt, y pro-apoptótica de regulación de la señal vía de señalización de la apoptosis quinasa 1 (ASK1) /p38. En el contexto de la activación del EGFR sostenida, los resultados de la simulación muestran un alto nivel persistente de la proliferación /efectores pro-supervivencia fosfo-ERK y fosfo-AKT, y un nivel basal de pro-apoptóticos efector fosfo-p38. El potencial de la activación de p38 (potencial apoptótico) debido al nivel elevado de especies reactivas de oxígeno (ROS) se suprime en gran medida por la diafonía negativa entre PI3K /AKT y vías /p38 ASK1. Tras la inactivación EGFR aguda, la señales de supervivencia decaen rápidamente, seguido por un rápido aumento de la señal de apoptosis debido a la liberación de potencial apoptótico. En general, nuestro modelo biología de sistemas, junto con las validaciones experimentales revela que la inhibición de las señales de supervivencia y liberación concomitante del potencial de apoptosis contribuyen conjuntamente a la muerte de células tumorales tras la inhibición del oncogén EGFR en adicto adicto cánceres
Visto:. Zhou JP , Chen X, Feng S, Luo SD, Pan YL, Zhong L, et al. (2011) Biología de Sistemas de modelado revela un mecanismo posible de la muerte de células tumorales en Oncogene La inactivación de EGFR cánceres adictos. PLoS ONE 6 (12): e28930. doi: 10.1371 /journal.pone.0028930
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 20 Junio, 2011; Aceptado: 17 Noviembre 2011; Publicado: December 14, 2011
Derechos de Autor © 2011 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (20872100, http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default124.htm) y la Fundación de Jóvenes de la provincia de Sichuan (08ZQ026-030, http: //www.qnjj .sc.cn /). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el concepto de "adicción oncogén" fue en primer lugar planteada por Weinstein sobre la base de los fenómenos peculiares que la proliferación y la supervivencia de algunos tipos de cáncer dependen en gran medida de una sola proteína oncogénica o vía, a pesar de la presencia de múltiples mutaciones genéticas y epigenéticas anomalías [1] - [3]. Ahora una gran cantidad de evidencias han encontrado para apoyar este concepto, incluyendo los de modelos de ingeniería genética de ratón [4], [5], estudios mecanísticos en líneas celulares de cáncer humano [6], [7], y en particular la buena eficacia terapéutica clínica de una serie de anticuerpos o fármacos moleculares pequeños que se dirigen a proteínas específicas en los cánceres humanos reportados en los últimos años [8] - [10]. Actualmente se han propuesto varias hipótesis para explicar el fenómeno de la adicción oncogén, incluida la simplificación genética [11], [12], la letalidad sintética [13], la amnesia oncogénico [14], y el choque oncogénico [15], [16]. Estas hipótesis dan varias explicaciones desde diferentes ángulos para el fenómeno de la adicción oncogén. Aun así, todavía hay una falta de conocimiento detallado para el mecanismo exacto que subyace a la adicción oncogén. En particular, la base molecular de algunos fenómenos esencial relacionada con la adicción oncogén sigue siendo poco clara, por ejemplo, el fenómeno de que la inactivación oncogén aguda conduce a la muerte de células tumorales en el oncogén adicto tipos de cáncer, sin afectar otras células que no son adictos de manera similar.
se ha sugerido que la anomalía de la circuitería intracelular (red de la transducción de señales) o "diagrama de cableado" es la razón más fundamental que da cuenta de los fenómenos de oncogén adicción [2], [17]. La complejidad de la circuitería intracelular junto con mutaciones múltiples genéticos en células de cáncer dificulta la comprensión de la base molecular adicción oncogén apuntalamiento [18], [19]. Ahora la situación ha cambiado un poco debido a los recientes avances en la biología de sistemas [20] - [22], en particular los sistemas de la biología computacional [23], [24]. Por lo tanto, uno se encuentra actualmente en una buena posición para aplicar dichas tecnologías para revelar posibles mecanismos moleculares subyacentes diversos fenómenos asociados con la adicción oncogén.
A medida que la primera obra de la comprensión de la adicción oncogén desde el punto de vista de la biología de sistemas, en este estudio, hemos desarrollado un modelo matemático del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) -asociado a la red de señalización para investigar posible mecanismo molecular de la muerte de células tumorales tras la inhibición de oncogén adicto. Aquí se optó por la red de EGFR-señalización asociada principalmente debido a las siguientes razones: (1) EGFR es uno de los oncogenes más importantes y implicado en muchos tipos de tumores humanos, en particular, cánceres de pulmón, cabeza y cuello tumores [25], [ ,,,0],26]; (2) la red de señalización EGFR ha sido ampliamente estudiada experimentalmente y teóricamente [27] - [30], lo que implica que muchos parámetros están disponibles en la literatura que facilita el desarrollo del modelo. Este modelo fue validado en primer lugar, y luego utilizado para simular el estado normal de las células cancerosas y las respuestas de la red a la inhibición del EGFR aguda.
Resultados
Creación del modelo matemático de la red de señalización del EGFR-asociado
aquí presentamos una ecuación diferencial ordinaria (ODE) modelo matemático de la red de señalización del EGFR-asociado, lo que implica la proliferación de EGFR-conducción /vías Ras /extracelular señal-quinasa regulada (ERK) y la fosfo señalización pro-supervivencia basada -3 quinasa (PI3K) /Akt, y pro-apoptóticos vía de señalización de la apoptosis quinasa reguladora de la señal 1 (ASK1) /p38. Las porciones de Ras /ERK y /AKT PI3K en este modelo se establece en base a los modelos /AKT PI3K conocido Ras /ERK y que incluye como Brightman [31], Birtwistle [30], Schoeberl [29], y Oda [32 ] modelos. Para conocimiento de los autores, sin embargo, no existe un modelo matemático de la vía de señalización pro-apoptótica mediada por p38 informado sin embargo, en la literatura. por lo tanto construimos un modelo de señalización de p38 y la incorporó a la red de señalización del EGFR. El modelo consta de 243 ecuaciones y las interacciones con 160 especies moleculares distintas, caracterizadas por 145 parámetros cinéticos y 28 concentraciones moleculares iniciales que no son cero. La mayoría de los parámetros cinéticos y las concentraciones moleculares iniciales en este modelo fueron tomados de la literatura o la deriva de cantidades físico-químicas básicas [29], [30], [33]. Otros fueron estimados por los resultados del modelo de ajuste a los datos experimentales conocidos con el uso del algoritmo de modelado de conjunto cuasi híbrido propuesto por nosotros recientemente [34]. Las principales reacciones y parámetros se presentan en la Tabla S1, y las concentraciones moleculares iniciales en el cuadro S2 (ver información de apoyo). Las vías de señalización importantes y componentes clave que intervienen en nuestro modelo de red se muestran en la Figura 1. Una breve descripción de este red EGFR-asociado se da como sigue.
Las líneas continuas con flechas indican la activación de las proteínas o lípidos. Las líneas de puntos representan proteína-proteína directa e interacciones proteína-lípido. Las líneas continuas con extremos romos representan inhibición.
En la condición normal, la señalización de la red se inicia por la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) para EGFR, seguido de la dimerización y la posterior mutua trans-fosforilación en varios residuos de tirosina de EGFR; aunque la familia EGFR tiene otros tres miembros incluyendo ErbB2, ErbB3, ErbB4 y además de EGFR (ErbB1) que pueden formar diferentes reguladores de luz (ya sean homo o hetero-dímeros) [30], [35], simplemente EGFR y homo-EGFR EGFR -dimers se consideran en este modelo de simplificación. Estos residuos de fosfo-tirosina actúan como sitios de atraque que permiten a los receptores de reclutar proteínas adaptadoras Shc y Grb2 [36], que pueden reclutar el factor de intercambio de nucleótidos de guanosina SOS. SOS promueve la sustitución del PIB para el GTP en Ras, activando de esta manera Ras [37]. Posteriormente, la Ras activado da como resultado la activación de la proteína quinasa Raf [38]; ya que el activador directo de la quinasa Raf No se sabe, sin embargo, se supone que la fosforilación de Raf es causada directamente por una molécula de Ras-GTP en este modelo. La Raf activado finalmente activa la proteína quinasa activada por mitógeno kinase1 /2 (MEK) y ERK en una forma de cascada [39]. La ERK activada puede fosforilar la proteína SOS aguas arriba, por lo tanto causando la disociación de Grb2-SOS desde el complejo de receptor, que forma un bucle de realimentación negativa [40]. Además, Grb2 en citomembrana también puede reclutar Gab1, lo que provoca la fosforilación de Gab1 y la consiguiente reclutamiento de PI3K [41]. En citomembrana, PI3K transforma fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) en el fosfatidilinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP3), que induce la activación de AKT a través de la cooperación con proteína dependiente de 3-fosfoinositida quinasa-1 (PDK1) [42 ]. En este proceso, la fosfatasa y tensina homólogo (PTEN) y la proteína fosfatasa 2A (PP2A) pueden desfosforilar específicamente PIP3 y AKT, respectivamente [43]. Fosforilada Raf, MEK y ERK pueden ser desfosforilado por sus fosfatasas específicas [30]
P38 que se cree como un importante efector pro-apoptótico puede ser activado por una variedad de tensiones ambientales y citoquinas inflamatorias [44]. - [46]. Entre los cuales, de particular importancia es el estrés debido a especies reactivas del oxígeno (ROS). Por ejemplo, Dolado et al. informó de que la oncogénico ROS inducida por H-ras desempeña un papel clave en la inhibición de la iniciación del tumor mediante la activación de p38 y por lo tanto resulta en apoptosis en los fibroblastos derivados de embriones de ratón [47]. Por otra parte, numerosos estudios han demostrado que la estimulación de las células cancerosas humanas, con resultados de EGF en un aumento de la concentración intracelular de ROS [48] - [50]. Jin y sus colegas, incluso detectan la velocidad de generación de ROS inducida por la estimulación de EGF en A431 [50]. Por lo tanto, ROS participa en nuestro modelo como un importante componente de explotación de la vía de señalización de p38. ROS desencadena la activación de ASK1, que luego se induce la fosforilación de mitogen-activated proteína quinasa kinase3 /6 (MKK) y p38 en un estilo en cascada [51]. fosfatasas específicas de ASK1, MKK y p38 también se incluyen en este modelo. Además, se ha establecido que activa AKT puede suprimir la activación de p38 a través de la fosforilación de ASK1, que forma una interferencia negativa entre PI3K /AKT y vías de señalización /p38 ASK1. Por ejemplo, Zhang et al. informó de que AKT puede fosforilar ASK1 en el sitio de Ser83 para inhibir peróxido de hidrógeno inducida por ASK1 /p38 de activación de señalización en las células endoteliales [52]. Yuan y sus colegas también demostraron que AKT puede inhibir la activación de p38 inducida por cisplatino través de la fosforilación de ASK1 [53]. En consecuencia, la diafonía entre AKT-ASK1 PI3K /AKT y vías de señalización /p38 ASK1 también participa en nuestro modelo.
La validación del modelo
El modelo establecido se validó mediante el cálculo de la evolución temporal de varios la activación de las especies clave incluyendo Ras, ERK, AKT y p38 después de una estimulación de EGF corta y la comparación de los resultados de la simulación con otros estudios experimentales o de simulación publicados sobre la señalización del EGFR. La Figura 2 muestra los patrones de curso de tiempo simulados de Ras, ERK, AKT y la exposición activación de p38 a EGF con diferentes concentraciones de más de 60 minutos. Tras la adición de EGF en t = 0, las concentraciones totales de Ras-GTP, fosfo-ERK (p-ERK) y fosfo-AKT (p-AKT) aumentan rápidamente hasta un máximo dentro de los 5 minutos con sus picos en función de la concentración de EGF , seguido por descomposición a sus niveles basales dentro de los 50 minutos. Mientras tanto, se observa un aumento retardado de fosfo-p38 (p-p38), que se alcanzó después de 15 minutos,. Estos son consistentes con los resultados experimentales anteriores. Por ejemplo, la estimulación de EGF de células PC12 resultados en una rápida activación, transitoria de Ras y ERK [27]. El nivel de Ras-GTP rápidamente alcanza un máximo en la exposición de 2 minutos para el EGF, pero disminuye en 10 minutos y poco a poco vuelve al nivel basal dentro de los 60 minutos. Del mismo modo, la activación de ERK es máxima dentro de los 5 minutos, y decae a menos del 50% del nivel máximo en 30 minutos, y a menos del 25% dentro de 60 minutos. Las activaciones transitorias de ERK y p38 después de la estimulación de EGF se observó también en células endoteliales capilares de la retina [54]. Después de una exposición de 5 minutos de las células endoteliales capilares de la retina a EGF, ERK alcanza un nivel máximo de fosforilación que es 20 veces mayor que la de su control. Durante los siguientes 2 horas, la activación de ERK se desintegra hasta que llega a una línea de base. Para p-p38, que aumenta un nivel casi tres veces respecto a su control después de 15 minutos, seguido de un descenso de su nivel de control.
cambios en la concentración de (A) activa ERK (fosfo-ERK), (B ) AKT activa (fosfo-AKT), (C) activa Ras (Ras-GTP) y (D) p38 activa (fosfo-p38) a la estimulación transitoria por EGF en diferentes concentraciones.
Simulación de sostenida activación del EGFR
a continuación, simular la activación de EGFR sostenida en las células cancerosas EGFR adictas. Para este propósito, las reacciones de la internalización del receptor se retiraron del modelo, y la concentración de EGF se estableció en un valor fijo. La Figura 3 presenta la evolución temporal de ERK, AKT y la activación de p38. Claramente, la activación de EGFR sostenida finalmente se traduce en un alto nivel estable de p-ERK y p-AKT después de un rápido aumento en el principio. Sin embargo, la activación de p38 todavía mantiene en su nivel basal a pesar de un pequeño pico detectable de p-p38 en los primeros 5 minutos. En general, la activación sostenida de EGFR conduce a un resultado final de alto nivel persistente de p-ERK y p-AKT, pero un bajo nivel de p-p38. Esto es consistente con los hallazgos experimentales en las células cancerosas adictas EGFR que la ERK y AKT mantienen en un alto nivel de activación y el p38 mantiene en un nivel bajo de activación [16].
cambios en la concentración de (A) activa ERK (fosfo-ERK), (B) AKT activa (fosfo-AKT) y (C) p38 activa (fosfo-p38) a la estimulación sostenida de EGFR en diferentes niveles.
Simulación de la red de respuesta tras la inactivación EGFR aguda en EGFR adicto células cancerosas
Acabamos simulado el estado normal de las células de cáncer EGFR adictas, a saber, un ajuste de la activación del EGFR sostenida. En esta sección, vamos a simular la respuesta de la red tras la inactivación del EGFR aguda, que imita la situación del uso de los inhibidores de EGFR en células de cáncer de EGFR adictas. En esta simulación, la inactivación EGFR aguda se llevó a cabo a través de un evento de pre-asignado en un punto de tiempo fijo, es decir, la actividad EGFR se fijó a su nivel basal. Los cambios en la concentración de ERK activado, AKT y p38 después de la inhibición de EGFR agudo se muestran en la Figura 4. Obviamente, la inactivación EGFR aguda conduce a una disminución inmediata de la concentración de p-ERK y p-AKT, y un aumento del retraso de p- p38. El pozo de simulación reproduce los fenómenos experimentales que la inactivación aguda de los resultados del oncogén EGFR en una rápida disminución de los efectores de la proliferación celular /pro-supervivencia p-ERK y p-AKT, y el posterior compromiso del efector pro-apoptótica p-p38 en el EGFR adicto células del cáncer [16], [55].
Perfil de cambios en la concentración de (A) activa ERK (fosfo-ERK), (B) AKT activa (fosfo-AKT) y (C) p38 activa (fosfo -p38). El evento virtual de la inhibición del EGFR se realizó en el tiempo 0 h.
El análisis de sensibilidad revela factores críticos responsables de la activación de p38
El análisis de sensibilidad ha sido durante mucho tiempo utilizado en la biología de sistemas para estudiar cómo variación del valor de la salida simulada de un modelo matemático se puede distribuir a diferentes fuentes de variación en la entrada de un modelo, que se pueden utilizar para identificar proteínas críticas que dominan la salida de una proteína efectora [29]. Aquí p-ERK, p-AKT y p-p38 se tomaron como las variables de salida para el análisis de sensibilidad. La Figura 5 presenta la sensibilidad integrado en el tiempo normalizada para las especies con valores distintos de cero en el modelo de red de señalización del EGFR. Obviamente, los nodos más sensibles para la activación de ERK son MEK y Raf además de la ERK indiferente y EGF; ERK y EGF son las soluciones triviales desde ERK es el precursor directo de p-ERK, y EGF es el iniciador de la respuesta de la red (por simplicidad, estos nodos sensibles indiferente serán ignorados más adelante). Para la activación de AKT, los nodos más sensibles incluyen Grb2, PIP2, Gab1, PI3K, PDK1, SOS, y PTEN. Y los de la activación de p38 incluyen principalmente ASK1, MKK, RacGDP, PP2A, AKT, PDK1 y SOS.
sensibilidades integrada en el tiempo normalizada de ERK, Akt y fosforilación de p38 (p-ERK, p-AKT, y p-p38) para cada especie no nulos en el modelo de red de EGFR-asociado.
el análisis de sensibilidad por encima revela los reguladores críticos en la red para la supervivencia efectores p-ERK y p-AKT, y pro-apoptóticos efector p-p38. También observamos que los mayores valores positivos y negativos de sensibilidad todos corresponden a la variable de salida p-p38. Por ejemplo, AKT que tiene el mayor valor negativo de la sensibilidad a la unidad de efectos pro-apoptóticos p-p38 puede desempeñar un importante papel en la regulación negativa de la apoptosis celular. ASK1, MKK y RacGDP, todos los cuales son los componentes clave de ROS /ASK1 /MKK /p38 cascada de señalización, tienen los mayores valores positivos de la sensibilidad, lo que implica un papel clave positivo de la señalización asociada ROS en la apoptosis celular. Estos resultados también pueden estar relacionados con la sensibilidad de las células tumorales a los efectos de muerte de fármacos dirigidos. Con el fin de probar esta hipótesis, hemos cambiado la red original, ya sea mediante la eliminación de la diafonía AKT-ASK1 o ROS, y luego volver a simulamos las respuestas de red en la configuración de la activación del EGFR sostenida e inactivación de EGFR aguda. La Figura 6A presenta los resultados de la simulación al retirar la diafonía AKT-ASK1. Obviamente, los altos niveles de p-ERK y p-AKT en el contexto de la activación del EGFR sostenido y un rápido descenso en la inhibición del EGFR aguda (véase la Figura 6A) se observaron, que son muy similares a los resultados de los modelos obtenidos en la red original. Sin embargo, después de eliminar la diafonía AKT-ASK1, p-p38 se mantiene en un nivel alto en el caso de cualquiera de la activación del EGFR sostenida o la inhibición del EGFR aguda, lo que implica una capacidad de apoptosis más fuerte. La Figura 6B representa los resultados de los modelos al retirar ROS. Al igual que en el caso cuando la eliminación de AKT-ASK1, que todavía está siendo verificado altos niveles de p-ERK y p-AKT en el contexto de la activación del EGFR sostenido y un rápido descenso en la inhibición del EGFR aguda. Sin embargo, la eliminación de ROS resultó en un bajo nivel de p-p38 en el caso de cualquiera de la activación del EGFR sostenida o inactivación EGFR aguda. Estos datos muestran que la eliminación de ROS conduce a la pérdida de la capacidad de apoptosis.
El evento virtual de la inhibición de EGFR se realizó a tiempo 0 hr. (A) Los efectos de la eliminación de la diafonía AKT-ASK1 sobre los cambios en la concentración de p-ERK, p-AKT y p-P38. (B) Los efectos de la eliminación de ROS sobre los cambios en la concentración de p-ERK, p-AKT y p-P38.
En conjunto, los resultados de la simulación obtenidos aquí sugieren que existe un potencial más fuerte de apoptosis existente en el estado normal de las células cancerosas, que se suprime por la diafonía negativo AKT-ASK1 entre PI3K /AKT y vías de señalización /p38 ASK1. La liberación del potencial de apoptosis debido a la desvanecimiento de diafonía negativo AKT-ASK1 tras la inactivación EGFR podría ser un factor importante que causa la muerte celular, además de la inhibición de la proliferación /señalización pro-supervivencia. En particular, la rápida liberación del potencial acumulada por apoptosis podría ser una razón clave que conduce a la sensibilidad de las células tumorales a los efectos mortales de fármacos que se dirigen al oncogén adicto.
evidencias experimentales de la existencia de ROS y apoptosis potencial en las células del cáncer de EGFR-adicto
el modelo descrito anteriormente es algo artificial, que puede no corresponder exactamente con el EGFR real adicto células cancerosas. Por lo tanto, también se realizaron una serie de experimentos para examinar varias cuestiones clave relacionadas con nuestro modelo. Dos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) líneas celulares HCC827 y NCI-H460 (H460) fueron seleccionados para los experimentos; HCC827 es una línea celular de cáncer de EGFR adicto típico, y H460 no es adicto EGFR, que es para la comparación. El primer experimento se diseñó para investigar los niveles de ROS en las dos líneas celulares de NSCLC. El nivel de ROS intracelular se muestra por 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA) [56], una sonda molecular sensible ROS, y se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia invertida. Como se muestra en la Figura 7, se detectó un nivel muy alto de ROS en las células HCC827 EGFR-adicto, mientras que ROS no podía ser percibida en células H460. Este hallazgo refleja uno hecho de que HCC827 sufre un gran estrés ROS, o en otras palabras, HCC827 tiene un potencial de apoptosis más fuerte. Aún así HCC827 aún mantiene la capacidad de proliferación vigoroso, lo que sugiere que el potencial de apoptosis es bien suprimida
.
Las señales de la sonda ROS, así como la localización nuclear DAPI en HCC827 y H460 se presentaron solos o fusionados (Merge).
análisis de transferencia de western Posteriormente y citometría de flujo (FCM) ensayos se utilizaron para investigar si la activación de p38, así como la apoptosis de las células cancerosas se pueden activar a través de la inhibición de AKT. Se han tratado HCC827 y H460 células con wortmanina 1 M; wortmanina es un inhibidor de la señalización /AKT PI3K. Como se muestra en la Figura 8A, el tratamiento de wortmanina HCC827 células puede causar inhibición casi completa de AKT y la acumulación grande de p-p38 dentro de las 4 horas de tratamiento. Para células H460, el tratamiento wortmanina también puede causar inhibición casi completa de la AKT, pero muy pequeña acumulación de p-p38 sin cambiar el nivel intracelular de ROS (Figura S1). Los resultados de los ensayos de FCM (Figura 8B) muestran que el tratamiento wortmanina puede resultar en aumentos de las tasas de apoptosis tanto en células HCC827 y H460. En comparación con H460, HCC827 células mostraron mucho más apoptosis después de 10 M wortmanina tratamiento. Estos experimentos demuestran que la inactivación de la supervivencia efector p-AKT conduce a la rápida liberación de potencial apoptótico acumulado en células de cáncer de EGFR-adicto, que puede ser una razón importante que conduce a la sensibilidad de las células tumorales a los fármacos que se dirigen a la EGFR oncogén adicto .
(a) la inmunotransferencia con anticuerpos indicados para mostrar la fosforilación de AKT y p38 en células H460 HCC827 y tratados con 1 mM wortmanina (WM). (B) La apoptosis de HCC827 y H460 células con o sin tratamiento 10 M wortmanina (WM) durante 24 horas. Las tasas de apoptosis se dan como porcentajes.
Dado que se ha demostrado la existencia de un potencial de apoptosis debido a la tensión de ROS en células de cáncer de EGFR-adicto, se postula, además, que la servidumbre de la tensión ROS pueden desensibilizar el cáncer células al tratamiento dirigido. Para probar esta hipótesis, se trataron células HCC827 con la vitamina C, un antioxidante que puede ser utilizado para mitigar en parte la tensión ROS. Entonces FCM y ensayos de Western blot se llevaron a cabo para probar la exposición apoptosis de las células a la gefitinib inhibidor de EGFR. Como se muestra en la Figura 9A, la vitamina C puede disminuir la apoptosis de las células tratadas por HCC827 gefitinib en comparación con el control en el que no se usó vitamina c. La figura 9B representa los resultados de ensayos de Western blot, que muestran que la mitigación de los ROS de hecho reduce el nivel de p-p38 en las células tratadas por HCC827 gefitinib. Al mismo tiempo, también notamos que el alivio de ROS disminuyó los niveles de p-ERK y P-Akt también. Una posible explicación podría ser que el estrés ROS puede promover la proliferación /supervivencia, además de inducir la apoptosis [57] - [59], por lo tanto, la mitigación de los ROS conduce por consiguiente a una disminución de p-ERK y p-AKT. Reconocemos que esto no consiguió la reflexión de nuestros resultados de los modelos ya que nuestro modelo matemático caso omiso de la señalización de ERK a ROS /AKT, que no se conoce en la actualidad. Además, un ensayo de MTT se llevó a cabo para poner a prueba la viabilidad de HCC827 células. El resultado muestra que la vitamina C puede disminuir la citotoxicidad de gefitinib en HCC827 células (Figura 9C). Estos resultados sugieren que la sensibilidad de las células a la HCC827 gefitinib inhibidor de EGFR se reduce debido a la reducción del potencial de apoptosis.
HCC827 células fueron tratadas con vitamina C (VC), gefitinib (GEF) o su combinación (GEF + vc). (A) La citometría de flujo la detección de la apoptosis de las células bajo HCC827 cada tratamiento durante 24 horas. Las tasas de apoptosis de los tratamientos se dan como porcentajes. (B) La inmunotransferencia con anticuerpos indicados para mostrar la fosforilación de ERK, Akt y p38 en las células tratadas HCC827 por los agentes indicados. gefitinib 1 M, se utilizaron 1 M vitamina C o su combinación. (C) La viabilidad de las células de la exposición HCC827 células a los agentes indicados medidos por MTT. 1 nM gefitinib, se utilizaron 10 nM vitamina C o su combinación.
Discusión
El concepto de "adicción oncogén" ahora ha sido aceptado por más y más investigadores a través de la última década . Sin embargo, el mecanismo subyacente a la adicción oncogén está lejos de ser comprendido. En esta investigación, hemos desarrollado un modelo matemático de la red de señalización del EGFR-asociado. Reconocemos que el modelo de red establecida no incluye todas las vías y componentes que regulan la supervivencia y la apoptosis de las células cancerosas de señalización; establecimiento de un modelo de red completa no es práctica en la actualidad. Desde otro punto de vista, haciendo caso omiso de otras vías de señalización alternativas puede dar un golpe de suerte que el modelo establecido más se cierra para el estado de EGFR adicto.
Las simulaciones con el modelo de red de EGFR-asociado validado junto con la validación experimental revelan la existencia de un potencial apoptótico. El potencial de apoptosis puede ser inducida por diferentes tipos de estrés, por lo general, por ejemplo, ROS. Las células cancerosas a menudo muestran los niveles intracelulares de ROS [60], [61] se incrementaron. Hay muchos factores que pueden contribuir a la generación de ROS [61]. La activación de EGFR oncogén puede provocar la generación de ROS a través de la activación secuencial de PI3K, Rac y NADPH oxidasa [48]. Además, la hipoxia-reperfusión en el microambiente del tumor puede conducir a la producción de ROS, lo que a su vez puede iniciar un ciclo viscoso de daño mitocondrial y además la generación de ROS [62]. En las células normales, el ROS podría ser aliviado mediante la participación de la glucólisis y abajo-regulación de la función mitocondrial [63]. Las células cancerosas a menudo tienen deficiencia en el sistema de reducción de ROS debido a alteraciones genéticas, que dificultan la liquidación de ROS [61]. La acumulación de ROS por lo general da lugar a la apoptosis a través de la activación secuencial de ROS /ASK1 /p38 [47], [64]. Sin embargo, la activación de p38 efector pro-apoptótica es inhibida por la diafonía negativo AKT-ASK1 en las células del cáncer [52], [65]. Una vez que la atenuación de la diafonía negativo AKT-ASK1, a través de, por ejemplo, la inactivación de AKT, el potencial de apoptosis puede ser puesto en libertad, por lo tanto, la inducción de apoptosis de las células [53].
La rápida liberación del potencial acumulada después de la inhibición de apoptosis es oncogén una razón importante que conduce a la sensibilidad de las células tumorales a los efectos de muerte de las drogas que tienen como objetivo el oncogén adicto, que es el sello más importante de la adicción oncogén. Sin embargo, esto no significa que el resultado de apoptosis en general en respuesta a la inactivación oncogén es aportado sólo por el potencial apoptótico. Se ha reconocido que el EGFR puede producir resultados pro-apoptótica a través de la activación de algunas vías efectoras abajo que se han relacionado con los resultados pro-apoptóticos. Por ejemplo, EGFR se puede unir directamente a la denominada "ligando de muerte" FAS /CD95 [66], por lo tanto, conduce a resultados apoptótica. Las aguas abajo de Ras puede ser pro-apoptótica a través de una interacción con el objetivo efector NORE1 [67].
Los resultados de este estudio también pueden tener implicaciones clínicas en las terapias dirigidas cáncer, así como en el desarrollo de fármacos contra el cáncer. Por ejemplo, el uso exclusivo de ERK inhibidor de AKT o no puede traer un buen efecto terapéutico incluso para los pacientes con cánceres de EGFR-adicto. Faber et al. [68] han demostrado que la inhibición /AKT PI3K no promovió la apoptosis sustancial en el EGFR adicto cánceres. Sin embargo, el bloqueo de ambos PI3K /AKT y Ras /MEK llevado simultáneamente a la apoptosis a niveles similares a los de los inhibidores de EGFR. Además, el uso de agentes que benefician el aumento de potencial apoptótico puede aumentar aún más la sensibilidad de las células tumorales a fármacos dirigidos. Por ejemplo, se ha informado de que los agentes de generación de ROS tienen efectos muerte selectiva en los cánceres-resistentes a la terapia dirigidos [69], [70]. Por el contrario, los agentes que pueden ayudar a mitigar el potencial de apoptosis podrían disminuir la sensibilidad de las células tumorales a los inhibidores de EGFR [59], que se deben evitar utilizar clínicamente. Por último, este estudio también sugiere que un buen objetivo anti-cáncer debe tener un carácter que su inhibición funcional debería beneficiarse de la liberación de potencial acumulada apoptosis en células de cáncer, además del bloqueo de la supervivencia.
En resumen, nuestro modelo la biología de sistemas revela que hay una apoptosis fuerte potencial existente en los cánceres de EGFR-adicto, que es en gran medida suprimida por el diafonía negativa entre PI3K /AKT y vías de señalización /p38 ASK1. La inhibición de las señales de supervivencia y liberación concomitante del potencial acumulado de apoptosis contribuyen conjuntamente a la muerte de células tumorales tras la inhibición del oncogén EGFR en adicto adicto cánceres. En general, este es el primer intento de comprender la "adicción oncogén" desde la perspectiva de los sistemas de la biología. Todavía están fuertemente requieren más conocimientos sobre los mecanismos que subyacen a la adicción oncogén desde el punto de vista de los sistemas de la biología. Cualquier avance en este campo en última instancia en beneficio de la terapia dirigida contra el cáncer, así como el desarrollo de fármacos contra el cáncer.
Materiales y Métodos
Modelo de Desarrollo
El modelo de red fue desarrollado con la ayuda de Matlab (The MathWorks, MA, EE.UU., http://www.mathworks.com). La información para todas las vías de señalización y la topología de la red se recogió de las obras publicadas. interacciones moleculares en el modelo fueron descritos por un conjunto de ecuaciones diferenciales ordinarias acopladas, que se derivan en base a las leyes de acción de masas.