Extracto
El aumento de la lipogénesis es un sello distintivo de una amplia variedad de tipos de cáncer y está bajo intensa investigación en su potencial antineoplásico objetivo. Aunque la lipogénesis a paso ligero se observa en presencia de lípidos exógenos, más pruebas de que estos lípidos pueden afectar negativamente a la eficacia de los inhibidores de las vías de lipogénicas. Por lo tanto, para explotar completamente el potencial terapéutico de inhibidores de la síntesis de lípidos, una mejor comprensión de la interrelación entre
de novo
la síntesis de lípidos y los lípidos exógenos y su respectivo papel en la proliferación de células de cáncer y la respuesta terapéutica a los inhibidores de la lipogénesis es de crítica importancia. Aquí, se muestra que la proliferación de diversas líneas celulares de cáncer (PC3M, HepG2, HOP62 y T24) se atenúa cuando se cultivan en condiciones de reducción de lípidos de una manera dependiente de la línea celular, con PC3M siendo el menos afectado. Curiosamente, todas las líneas celulares - lipogenética (PC3M, HepG2, HOP62), así como no lipogenética (T24) - aumentaron su actividad lipogénica en estas condiciones, aunque en un grado diferente. Las células que alcanzaron la mayor actividad lipogenética en estas condiciones eran más capaces de hacer frente a la reducción de lípidos en términos de capacidad proliferativa. La suplementación del medio con las lipoproteínas de muy baja densidad, ácidos grasos libres y colesterol revierte esta activación, lo que indica que la mera falta de lípidos es suficiente para activar
de novo lipogénesis en las células cancerosas. En consecuencia, las células cancerosas cultivadas en condiciones de reducción de lípidos se hicieron más dependientes
de novo
vías de síntesis de lípidos y eran más sensibles a los inhibidores de las vías de lipogénesis, como sorafeno A y simvastatina. En conjunto, estos datos indican que la limitación del acceso a los lípidos exógenos, como puede ocurrir en los tumores intactas, activa
de novo
lipogénesis es células cancerosas, les ayuda a prosperar en estas condiciones y los hace más vulnerables a los inhibidores de la lipogénesis. Estas observaciones tienen importantes implicaciones para el diseño de nuevas estrategias antineoplásicos dirigidos metabolismo de los lípidos de las células cancerosas
Cita:. Daniëls VW, Smans K, Royaux I, Chipre M, Swinnen JV, Zaidi N (2014) Cancer Cells diferencialmente activar y prosperar en
de novo síntesis de lípidos Pathways en una de lípidos de baja Medio Ambiente. PLoS ONE 9 (9): e106913. doi: 10.1371 /journal.pone.0106913
Editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Francia |
Recibido: 11 Abril, 2014; Aceptado: 3 Agosto 2014; Publicado: 12 de septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Daniels y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de: Fundación de Investigaciones Científicas-Flandes (FWO, http://www.fwo.be/en/) G.0691.12 (JVS), Universidad Católica de Lovaina acciones concertadas de investigación (GOA, http://www.kuleuven.be/onderzoek/kernprojecten/goa.htm) GOA /11/2009 (JVS), y los polacos Interuniversitario Atracción - belga Federal de Ciencia Oficina de Políticas (IAP BELSPO, http://www.belspo.be/belspo/index_en.stm) IAP7-32 (DSI). VWD es un asistente de investigación de la Fundación de Investigación Científica-Flandes (FWO) y la Liga de Flandes contra el Cáncer (VLK, http://www.tegenkanker.be/home). Los co-autores KS, IR, MC, y Nueva Zelanda son empleados de Janssen Pharmaceutica NV. Janssen Pharmaceutica NV proporcionó apoyo en forma de salarios de los autores KS, IR, MC y Nueva Zelanda. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. Los co-autores Karine Smans, Inés Royaux, Melanie Chypre y Nousheen Zaidi se emplean por Janssen Pharmaceutica NV. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
proliferan rápidamente las células cancerosas requieren un suministro constante de los lípidos de membrana y la biogénesis de proteínas modificaciones. Varios estudios han demostrado que, con el fin de hacer frente a estas mayores demandas, células de cáncer o bien aumentar su absorción de los lípidos o activar
de novo de lípidos
síntesis [1] - [5]. síntesis de ácidos grasos mejorada se encuentra en 20% a 90% de los tumores de muchos tipos diferentes y se refleja en la sobre regulación de las enzimas clave implicadas en esta vía [1]. Estos incluyen la sintasa de ácidos grasos (FASN), acetil-CoA carboxilasa alfa (ACACA) y ATP-citrato liasa (ACLY). Numerosos informes indican que la activación de estas enzimas se produce aguas abajo de la señalización del factor de crecimiento y otros eventos oncogénicos, independientemente de la presencia de los lípidos extracelulares [1], [6] - [12]. También la síntesis de colesterol, a través de la vía del mevalonato, es activo en muchas células cancerosas. Es importante destacar que la inhibición de la síntesis de ácidos grasos o de la síntesis de colesterol vías por interferencia de ARN o inhibidores químicos da como resultado la detención del crecimiento de las células tumorales lipogénesis, tanto
in vitro Opiniones y
in vivo
, rindiendo estas enzimas objetivos interesantes para la terapia antineoplásica [1], [13] - [19]. Desafortunadamente, los efectos citotóxicos inducidos por la inhibición de
de novo de lípidos
vías de síntesis parecen ser evitado por la presencia de lípidos exógenos o metabolitos intermedios [13], [20], [21]. Estas observaciones sugieren que es la dependencia de
de novo la síntesis de lípidos
que determina la respuesta de las células cancerosas a la inhibición de estas vías y que los lípidos extracelulares pueden comprometer los beneficios terapéuticos de estos inhibidores.
en este caso, para obtener una visión más clara la compleja interacción entre los lípidos exógenos y
de novo de lípidos
vías de síntesis en las células cancerosas y para explorar cómo esta interacción puede afectar a la eficacia de las terapias antineoplásicas lípidos de segmentación, se analizó el impacto de privación de lípidos sobre la proliferación celular y la respuesta a la inhibición lipogénica en una variedad de modelos de línea celular de cáncer de lipogénicas y menos lipogénicos bien establecidos. Curiosamente, encontramos que un entorno de crecimiento reducido en lípidos afecta diferencialmente el crecimiento de líneas celulares de cáncer y es suficiente para activar el
de novo
vías lipogénesis incluso en líneas celulares de cáncer que se consideran no lipogenética. Esta activación ayuda a las células cancerosas para mantener su tasa de proliferación en un entorno de baja los lípidos y las hace más sensibles a los inhibidores de la lipogénesis. Estos datos ponen de relieve nuevamente la heterogeneidad de las células cancerosas en función de sus necesidades metabólicas, hacen hincapié en la importancia de las condiciones extracelulares y tienen importantes implicaciones para la mejora del diseño de estrategias terapéuticas basadas en la manipulación de las necesidades de lípidos de las células tumorales.
Materiales y Métodos
cultivo de células y tratamientos
Todas las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). reactivos de cultivo celular se adquirieron de Invitrogen menos que se indique lo contrario. La línea celular PC3M se cultivó en medio HyClone MEM /EBSS (Thermo Scientific), suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 mM de piruvato sódico, 10 mM no aminoácidos esenciales, 2 mM L-glutamina, 50 mg /ml de gentamicina y 1X vitaminas BME (Sigma). HOP62 células fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 2 mM L-glutamina y 50 mg /ml de gentamicina. las células HepG2 se cultivaron en MEM suplementado con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 50 mg /ml de gentamicina, 100 mM de piruvato sódico, 0,37 g /L de bicarbonato de sodio, 10 mM no aminoácidos esenciales. La línea celular T24 fue cultivada en medio DMEM, suplementado con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 50 mg /ml de gentamicina. Todas las líneas celulares se cultivaron en la atmósfera de 5% de CO
2 y 37 ° C. Para las condiciones de reducción de lípidos los medios de comunicación se complementaron con una reducción de lípidos 10% de SFB HyClone (Thermo Scientific). Las diferencias en los lípidos y componentes relacionados con FBS normal frente a la reducción de lípidos se enumeran en el cuadro complementario S1. La simvastatina se adquirió de Merck Sharp. Sorafeno se recibió del Dr. R. Jansen, Helmholtz-Zentrum f. Infektionsforschung, Mikrobielle Wirkstoffe, Braunschweig, Alemania [22], [23]. Soluble en agua colesterol, trilinoleato de glicerilo y trilinolenate de glicerilo se adquirieron de Sigma. lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) se obtuvieron de Merck Millipore. Para cultivar las células en presencia de diferentes mezclas de ácidos grasos, palmítico (16:00), oleico (18:01), linoleico (18:02), α-linolénico (18:03), araquidónico (20:04) y docosahexaenoico (22:06) ácido (Sigma) se complejo con BSA libre de ácidos grasos (Sigma) como se describe anteriormente [18], antes de la adición al medio de cultivo. Los triglicéridos se incubaron en condiciones normales o de SFB durante 30 minutos a 37 ° C antes de la adición al medio de cultivo reducida en lípidos.
análisis de inmunotransferencia
Igual cantidad de proteínas se cargaron en geles prefabricados (NuPAGE, Invitrogen), se transfirieron a membranas de PVDF y se incubaron con anticuerpos contra ACLY (conejo monoclonal, ab40793, Abcam), FASN (conejo monoclonal, 3180, Cell Signaling) y β-actina (monoclonal de ratón, Sigma). Las membranas se lavaron y se sondaron con anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 680 (Invitrogen) anticuerpos secundarios. a continuación, la señal fluorescente se midió usando el sistema Odyssey Licor (LI-COR Biosciences).
Ensayo de proliferación
PC3M y HOP62 células se sembraron a una densidad de 5 × 10
4 células ml
-1 en placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos (Nunc). células T24 se sembraron a 2 x 10
4 células ml
-1 en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Las células HepG2 se sembraron a 2,5 x 10
4 células ml
-1 en poli-D-lisina microplacas de 96 pocillos, negro /transparente (BD Bioscience). Las células se sembraron en medio normal o reducida de lípidos. Las curvas de crecimiento se construyeron mediante placas de imagen utilizando el
Incucyte sistema gratis (Essen Instruments), donde las curvas de crecimiento fueron construidos a partir de mediciones de confluencia adquiridos durante la exploración cinética alrededor del reloj. Para la determinación de las células suman las células flotantes en el medio de cultivo se combinaron junto con las células adherentes después de la tripsinización. Las células se tiñeron con azul de tripano y se contaron usando un contador de células automatizado condesa (Invitrogen).
ARN aislamiento y en tiempo real PCR cuantitativa (qPCR)
ARN total a partir de células cultivadas se extrajo y ADNasa I tratados usando el kit RNeasy Mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. 3 g de RNA total sirvió como molde para la síntesis de ADNc usando cebadores oligo dT y la transcriptasa inversa SuperScript III en un volumen de 20 l durante 1 hora a 50 ° C. Esto fue seguido por la inactivación de la enzima a 70 ° C durante 15 minutos, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). PCR cuantitativa (qPCR) se realizó en un (Applied Biosystems) del sistema de detección de secuencias 7900 HT-ABI Prism utilizando un kit básico qPCR w /o dUTP (Eurogentec). Las condiciones de ciclado térmico fueron 10 min a 95 ° C, seguido por 45 ciclos de 15 s a 95 ° C y 1 min a 60 ° C. Validados ensayos pre-diseñadas de expresión Taqman Gene (Applied Biosystems) correspondientes a los genes de limpieza TFRC (Hs00951083_m1) y PGK1 (Hs00943178_g1) se utilizaron para generar curvas estándar en diluciones en serie de cDNA. El método de la curva estándar relativa se utilizó para calcular los valores de expresión. Después de la normalización por TFRC o PGK1 se calcularon los valores relativos de expresión. Los otros ensayos de expresión TaqMan Gene utilizados en este estudio son: ACLY (Hs00982738_m1), ACSS2 (Hs00218766_m1), FASN (Hs01005622_m1), ACACA (Hs01046047_m1), HMGCR (Hs00168352_m1)
El ARN total de las células T24 se preparó. PureLink usando RNA Mini Kit (Ambion). La pureza y la concentración de ARN se evaluaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop DM-1000 (NanoDrop Technologies). 3 g de ARN de cada muestra se utilizó como molde para la síntesis de cDNA utilizando cebadores hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa Superscript II, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). Los cebadores se diseñaron con el software Primer-BLAST del NCBI, donde se seleccionaron posibles cebadores que abarcan una unión exón-exón. La especificidad de los cebadores se comprobó mediante análisis de la secuencia en el software Primer-BLAST y fundir análisis de la curva. Cuantitativos experimentos de PCR se realizaron en un rápido sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems) utilizando el Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Los ciclos térmicos condiciones fueron 20 segundos a 95 ° C, seguido por 40 ciclos de 3 segundos a 95 ° C y 30 segundos a 60 ° C. Los valores Ct obtenidos se normalizaron usando 18S como gen de mantenimiento.
Apoptosis ensayo
Las células fueron sembradas en condiciones normales o reducida de lípidos de crecimiento y se incubaron y se trataron durante 72 horas con sorafeno A o simvastatina. La apoptosis se evaluó mediante el uso de la etiqueta
Guayaba nexina
kit y el
Guayaba PCA sistema gratis (guayaba Techinnologies). El ensayo de guayaba nexina utiliza dos manchas (anexina V y 7-amino actinomicina D [7-AAD]) para cuantificar el porcentaje de células apoptóticas. Las células que se tiñen positivo para ambos colorantes están en las últimas etapas de la apoptosis, antes de la muerte celular. El ensayo nexina se realizó según el protocolo del fabricante. Los datos fueron recogidos y analizados por un análisis celular personal de guayaba (PCA) citómetro de flujo con el uso de software Cytosoft (Guava Technologies). Aproximadamente se analizaron 2000 células. Se sembraron
cultivo celular 3D
células HepG2 en ultra bajo de fijación placas de 96 pocillos (Corning Costar) a una densidad de 750 células /pocillo /200 l de medio . Se sembraron las células y se mantuvieron en medio de crecimiento normal o reducida de lípidos y monitoreados durante 20 días. Después de la formación de esferoides, el 50% del volumen medio fue reemplazado cada 3-4 días. Los esferoides se analizaron utilizando
En la celda Analizador gratis (GE Healthcare).
ATP ensayo
La viabilidad de las células que comprenden los esferoides se determinó mediante la medición del contenido de ATP celular utilizando CellTiter- Glo Luminescent Cell Viabilidad de ensayo (Promega) según el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadieron 100 l 'CellTiterGlo-reactivo' a los pocillos que contienen los esferoides. Antes de añadir el reactivo CellTiterGlo-100 l de medio se eliminó de cada pocillo. Los esferoides se lisan por agitación durante 10 minutos seguido de pipeteo. 100 l de suspensión de células de cada pocillo se transfieren a un Optiplate blanco 96 (Perkin Elmer). La luminiscencia se mide.
síntesis de lípidos
Las células se cultivaron en placas de 24 pocillos en medio normal o reducida en lípidos. Después de 72 horas [
14C] acetato marcado con (56 mCi /mmol, 0,2 Ci /pocillo, Amersham Biosciences) se añadió a las células. Después de 4 horas de incubación las células se recogieron por tripsinización y se sedimentaron por centrifugación. Los lípidos se extrajeron utilizando un método de Bligh Dyer modificada, como se describe anteriormente [19].
14C-incorporación en los lípidos celulares se cuantificó por recuento de centelleo, utilizando un Packard 1600CA
Tri-Carb contador de centelleo líquido
(Packard Instrument Company). Los recuentos obtenidos se normalizaron para el contenido de ADN de la muestra, para tener en cuenta las diferencias en el número de células después de 72 horas en condiciones de medio reducido en lípidos.
nanofluídico análisis proteómico
La expresión del precursor y la forma activa de SREBP1 y SREBP2 fue investigado por un inmunoensayo Western simple basada en tamaño, utilizando un dispositivo de Peggy NanoPro (Protein simple). La concentración de proteína total de las muestras se determinó usando un ensayo de proteína BCA (Pierce). La misma cantidad de muestra se prepararon en tampón de dilución occidental simple, reducida y desnaturalizada antes de cargar sobre la placa. Las placas se preparan de acuerdo con el procedimiento de la fabricación, el uso de todos los reactivos de proteína simple. SREBP1 y anticuerpos SREBP2 (Active Motif,#39939 y#39941) se utilizaron a una dilución de 1:25, se utilizó anticuerpo α-tubulina (Cell Signaling,#2125) a una dilución 1:500. Los datos fueron analizados utilizando el software simple Western Compass. Expresión de proteínas (área bajo la curva, AUC) se corrigió para el control de carga-alfa tubulina (AUC SREBP /AUC alfa-tubulina).
El análisis estadístico
Los resultados fueron analizados por Students't -test (Excel) o ANOVA de una vía seguido por la prueba de comparación múltiple de Tukey (GraphPad Prism Software), en su caso. Los valores de p & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los datos presentados representan las medias ± S. D. como se indica en las leyendas de las figuras correspondientes.
Resultados
condiciones de crecimiento reducida de lípidos atenúan diferencialmente la tasa de proliferación de líneas celulares tumorales
Para estudiar el efecto de la reducción de los lípidos en la proliferación y la supervivencia de células de cáncer que selecciona PC3M, HOP62, HepG2 y líneas de células T24. Se ha reportado que las tres primeras líneas celulares que tienen un fenotipo lipogenética en condiciones estándar de cultivo celular con suero completo. Hemos observado en nuestro estudio anterior que estas líneas celulares se vieron afectados por los lípidos del medio ambiente [24]. Esto fue inesperado, ya que se piensa que las líneas celulares lipogénesis a depender principalmente de
lipogénesis de novo
para satisfacer el requisito de ácidos grasos. Las células T24 muestran un fenotipo de bajo lipogénica en estas condiciones y se incorporaron como una línea celular de control [14], [24] - [26]. Todas estas líneas celulares se cultivaron en condiciones normales en medio con suero completo 10% o con 10% de suero reducido de lípidos. Incucyte imágenes en tiempo real y de tripano ensayos de exclusión de azul revelaron que el cultivo en condiciones de reducción de lípidos atenuadas proliferación de las células de las diversas líneas de células en un grado diferente. HOP62 mostró una reducción dramática en las tasas de crecimiento cuando se cultiva en condiciones de crecimiento reducido en lípidos, seguido de HepG2 (Figura 1a-b). células T24 fueron mucho menos afectada y células PC3M no fueron influenciadas en absoluto (Figura 1a-b). Sin embargo, el ambiente de baja en lípidos no indujo apoptosis en el PC3M y líneas de células HepG2 (Figura S1).
(a) las curvas de proliferación para PC3M, HOP62, HepG2 y células T24. Las células se sembraron y se cultivaron en la proliferación normal o reducida de lípidos-medio y célula se controló por
Incucyte imágenes en tiempo real.
Los paneles en el lado derecho de cada gráfico proliferación mostrar la imagen de contraste de fase de la línea celular correspondiente en ambas condiciones. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. (B) Se contó el número de células vivas utilizando un método de exclusión de colorante azul de tripano, después de 72 horas de cultivo en normal (N) o medio LR. * Significativamente diferente (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), N. S. no significativa (p & gt; 0,05).
Para HepG2, que se han demostrado previamente para formar esferoides 3D compactos en los sistemas de cultivo de células en 3D [27] - [30], también estudiaron la efectos de las condiciones reducida de lípidos en un sistema de 3 dimensiones (3D) de cultivo celular que imita los tejidos y órganos naturales más de cerca que 2-dimensional sistema de cultivo celular (2D). En condiciones normales de crecimiento se observó un aumento dependiente del tiempo en el tamaño de esferoides (figura 2a). Sin embargo, en condiciones de reducción de lípidos crecimiento de HepG2-esferoide fue detenido por completo (Figura 2a). Al día 20, se observaron 5 veces más grande esferoides en condiciones normales de crecimiento, en comparación con condiciones de crecimiento reducido en lípidos (Figura 2a). Esto también se reflejó en el número de células viables como se revela mediante mediciones de ATP [31] (Figura 2b).
(a) la microscopía de contraste de fase que muestra la formación HepG2-esferoide. células HepG2 se sembraron en medio normal y LR en placas de fijación ultra-baja a una densidad de 750 células /pocillo y la formación de agrupaciones se controló más de veinte días, como se indica. Los esferoides se analizaron usando un
en la celda del analizador 2000
instrumento. Circunferencia de esferoides se midió utilizando
IN Cell Analyzer 2000 software.
(B) Viabilidad de las células que comprenden los esferoides se determinó mediante la medición del contenido de ATP celular usando un ensayo de luminiscencia.
Las células cancerosas activar el
de novo
vías de síntesis de lípidos en las condiciones de crecimiento reducida en lípidos
se espera que la proliferación celular en las condiciones de reducción de lípidos a depender de la capacidad de las células cancerosas para sintetizar los lípidos requeridos
de novo. Sin embargo, nuestros datos proliferación mencionada no coincide con la actividad lipogénica de las líneas de células cancerosas cultivadas bajo condiciones estándar, como la tasa de crecimiento de las células T24 bajo lipogénesis fue menos afectado que los de la HOP62 lipogenética y las células HepG2. Por lo tanto, se evaluó la capacidad de las líneas celulares para activar esta vía en condiciones de reducción de lípidos. En primer lugar, se comprobó el efecto de las condiciones normales y la reducción de los lípidos de crecimiento de mRNA perfiles de expresión de genes mayores en
lipogénesis de novo
vías: ATP-citrato liasa (ACLY), una enzima citosólica que cataliza la generación de acetil -CoA tanto para los ácidos grasos y la síntesis de colesterol, acil-CoA sintetasa de cadena corta miembro de la familia 2 (ACSS2), que cataliza la síntesis de acetil-CoA a partir de acetato, la sintasa de ácidos grasos (FASN), la enzima clave implicada en la síntesis de ácidos grasos y hidroximetil glutaril-CoA reductasa (HMGCR), la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de colesterol. Ct-valores de los genes de la prueba se indican en el cuadro complementario S2. Curiosamente, la expresión de estas enzimas se aumentó en todas las líneas celulares, incluyendo la línea celular T24 no lipogénica, aunque en un grado algo diferente, con HepG2 ser el menos sensible (Figura 3a-d). Western blot de FASN y ACLY mostró que estas enzimas eran más dramáticamente hasta reguladas en medio de la reducción de lípidos en PC3M y menos en HepG2 (Figura 3e). De acuerdo con estos resultados, la proteína de unión de esterol regulador 1 (SREBP1) y SREBP2, que son los principales reguladores de la expresión de genes de la síntesis de ácidos grasos y la vía del mevalonato, respectivamente, también mostraron un aumento de la expresión (Figura S2) y eran activado más a nivel de proteínas en condiciones de reducción de lípidos en HOP62, PC3M y células T24, pero no en HepG2 (Figura 4 anuncio y la figura S3). El elemento de carbohidrato que responde a la proteína de unión (ChREBP), otro importante regulador de la expresión de genes lipogénicos [32], fue sólo se expresa en niveles detectables en las células HepG2 (línea celular de cáncer de hígado) (Figura S4a) y en esta línea celular , no pudimos observar una activación y translocación nuclear del factor de transcripción, cuando se cultiva en condiciones de poca lípidos (Figura S4b). En el PC3M, la de las líneas celulares de cáncer de líneas de células T24, próstata, pulmón y riñón respectivamente HOP62 y, no pudimos detectar ChREBP en los extractos celulares totales o en las fracciones nucleares, cuando las células se cultivaron en condiciones de crecimiento reducida en lípidos (Figura S4b). Estas observaciones sugieren que ChREBP no juega un papel fundamental en el aumento de la expresión de genes lipogenética en condiciones de reducción de lípidos.
La expresión génica de FASN, ACLY, ACSS2 y HMGCR se analizó mediante análisis de qPCR en (a) HOP62 ( b) células HepG2 (c) PC3M (d) T24. Las células se cultivaron en medio normal o LR durante 48 horas. Los datos se expresan como media ± S.D. de muestras por triplicado, normalizados a TFRC para HOP62, HepG2 y PC3M o a 18S para T24. * Significativamente diferente (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), N. S. no significativa (p & gt; 0,05). (E) FASN y expresión ACLY a nivel de proteína se analizó por análisis de transferencia Western en HOP62, HepG2, PC3M y células T24 cultivadas en medio normal (N) o LR durante 72 horas. Beta-actina se utilizó como control de carga.
(a) blot virtual Representante de análisis Western simple de precursor y la expresión SREBP1 activo en HepG2, PC3M, HOP62 y las células T24 después del cultivo de 72 horas en condiciones normales (N) o LR condiciones del medio. Alfa-tubulina se utilizó como control de carga. Diferentes exposiciones de precursores y SREBP1 activos se muestran con el fin de tener una exposición precisa de ambas formas. Para los datos originales véase la Figura complementario S3a-d. (B) Análisis cuantitativo de simple Western. datos, expresada como el área bajo la curva (AUC). Expresión de SREBP1 se corrigió para el control de carga de alfa-tubulina. Gráfico representa la media ± S. D. (N = 2-3). (C) transferencia virtual Representante de análisis Western simple de precursor y la expresión SREBP2 activo en HepG2, PC3M, HOP62 y las células T24 después de 72 horas de cultivo en condiciones normales (N) o LR medianas. Alfa-tubulina se utilizó como control de carga. Diferentes exposiciones de precursores y SREBP2 activos se muestran con el fin de tener una exposición precisa de ambas formas. Para los datos originales véase la Figura complementario S3E-h. (D) Análisis de Quantificative simple occidental. datos, expresada como el área bajo la curva (AUC). Expresión de SREBP2 se corrigió para el control de carga de alfa-tubulina. Gráfico representa la media ± S. D. (N = 2-3).
Para corroborar nuestros resultados en el aumento de la expresión de los genes lipogénesis en condiciones de reducción de lípidos, la síntesis de lípidos se determinó midiendo la incorporación de acetato marcado radiactivamente en los lípidos celulares. En línea con nuestras otras observaciones,
14C-acetetate incorporación fue significativamente mayor en el PC3M, células HOP62 y T24, cuando fueron cultivadas en un ambiente de baja en lípidos (Figura 5). Las células HepG2, que ya muestran una alta actividad basal lipogenética, no mostraron importantes sobre regulación de su síntesis de lípidos cuando se cultivan en medio de crecimiento reducido en lípidos. Aunque, HOP62 y T24-hasta podría regular su
lipogénesis de novo
, sólo podían alcanzar el mismo nivel de actividad lipogenética como las células HepG2. Por el contrario, las células podrían PC3M hasta de regular su actividad lipogénica a un nivel mucho más alto que las otras líneas de células. Esto da una indicación de por qué estas células posteriores podrían mantener una tasa de crecimiento normal en condiciones de reducción de lípidos y las otras tres líneas celulares no pudo. Estos resultados indican que en las células de cáncer de condiciones lípidos privada, independientemente de si son o no lipogénica lipogénica en condiciones de cultivo estándar, tienen la capacidad de un máximo de regular
de novo
vías lipogénesis, ya sea a una diferente grado. La medida en que las células de un máximo de regular su camino lipogenética en un entorno de reducción de lípidos determina su capacidad para mantener la proliferación en estas condiciones.
HepG2, PC3M, HOP62 y células T24 que crece en medio normal o LR de 72 horas, se incubaron durante las últimas 4 horas con
14C-acetato. lípidos celulares se extrajeron y la incorporación de
14C en los lípidos celulares se determinó por recuento de centelleo. los recuentos de centelleo se normalizaron para contenido de ADN de la muestra. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. * Significativamente diferente (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001), N. S. no significativa (p & gt; 0,05).
Sobre regulación de
novo la síntesis de lípidos de
inducida por el ambiente de baja en lípidos puede ser revertido por las VLDL y se puede atribuir a una escasez de ácidos grasos y colesterol
a continuación, se trató de confirmar que la inducción de
lipogénesis de novo
bajo condiciones de reducción de lípidos fue debido al agotamiento de los lípidos específicos del medio de cultivo. Como suero reducido en lípidos se prepara por la eliminación de las lipoproteínas tales como las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) [33], que son una fuente rica de triglicéridos y colesterol, que explican la fuerte reducción de estos dos lípidos en nuestra FBS reducido en lípidos ( el cuadro complementario S1), las células T24 se cultivaron en condiciones de reducción de lípidos y el medio fue suplementado con VLDL. Además de VLDL disminuyó la expresión de SREBP1a, SREBP1c y SREBP2 (Figura S5a). En consecuencia, la expresión de FASN, ACACA, ACLY, ACSS2 y HMGCR también se redujo significativamente (Figura 6a). Esta disminución de la expresión de los genes lipogénicos fue acompañado por una disminución de la actividad de la vía de lipogénica, según lo determinado por
ensayo de incorporación de 14C-acetato (Figura 6d). Para definir si los triglicéridos o el colesterol presente en la partícula VLDL causaron este efecto lipogénesis inhibidora, completamos las células con triglicéridos o colesterol por sí solos. Además de los triglicéridos no pudo revertir la lipogénesis elevado observado en el T24 se cultivaron en condiciones de poca lípidos de crecimiento (Figura S6). Los ácidos grasos libres, sin embargo, dio lugar a un rescate significativa. Diferentes mezclas de ácidos grasos saturados, mono- y poli-insaturados disminuyeron la expresión de SREBP1a, SREBP1c y SREBP2 (Figura S5B). En consecuencia, la expresión de FASN, ACACA, ACLY, ACSS2 y HMGCR fue también disminuyó significativamente adición después de ácidos grasos (Figura 6b) y fue acompañado por una disminución de la actividad de la vía de lipogénica, como se determina por ensayo de incorporación de 14C-acetato
( Figura 6e). Estos resultados indican claramente que los ácidos grasos exógenos pueden afectar a la regulación de los
lipogénesis de novo
también en las células cancerosas. En contraste con la adición de ácido graso, la suplementación del medio de crecimiento reducido en lípidos con colesterol no dio lugar a niveles de ARNm disminuidos de SREBP1a, SREBP1c o SREBP2 (Figura S5C), y aún así afectó a los niveles de mRNA de los genes lipogénicos aguas abajo, FASN, ACLY, ACSS2 y HMGCR (Figura 6c). Esto está de acuerdo con informes anteriores que muestran el colesterol para regular la actividad de SREBP en el nivel post-traduccional, en lugar de a nivel de traducción [34]. La disminución de colesterol inducida por la expresión de enzimas lipogénicos fue acompañado por una disminución de la actividad de la vía de lipogénica (Figura 6f), lo que indica que también el colesterol exógeno influye en la actividad de la vía de la lipogénesis en las células cancerosas.
La expresión génica de FASN, ACLY, HMGCR y ACSS2 se analizó mediante qPCR en células T24 se cultivaron durante 48 horas en condiciones normales (N) o condiciones de crecimiento LR en la presencia o ausencia de VLDL (a), diferentes mezclas de ácidos grasos (b) y diferentes concentraciones colesterol (c). VLDL se añadió a una concentración de 607 g triglicéridos séricos /ml (correspondientes a los triglicéridos de concentración en FBS normal). ácidos grasos (AG) mezclas fueron los siguientes, FA mezcla 1: 20 M linoleico (18:02), (18:03), 5 mM araquidónico (20:04), ácido docosahexaenoico 5 M α-linolénico 20 mM (22: 6), FA mezcla 2: 10 M 18:02, 18:03 15 mM, 10 mM 20:04, 22:06 15 mM y FA mezcla 3: 20 M 18:02, 18:03 20 M, 5 M 20 :4, 5 mM 22:06, 30 mM de ácido oleico, ácido palmítico 30 mM. colesterol diferentes concentraciones (CH) son como se indica en las figuras (25 mM, 50 mM o 100 mM). Se normalizaron los datos de 18S y representan como media ± S. D. (Por triplicado por experimento y n = 3). La significación se determinó por ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Tukey. * Significativamente diferente (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001; **** p≤0,0001) de control de medio normal.
#Significantly diferente (
#p≤0,05;
## p≤0,01;
### p≤0,001;
#### p≤0,0001 ) desde el control de LR. (D, e, f) se determinó
14C-incorporación en los lípidos celulares en células T24, se cultivaron durante 48 horas en normal (N) o condiciones de crecimiento LR en la presencia o ausencia de VLDL (d), diferentes mezclas de ácidos grasos