saludable
Extracto
Los análisis de NY-ESO-1 específica espontánea respuestas inmunes en pacientes con cáncer revelaron que las respuestas de células anticuerpo y ambos CD4
+ y CD8
+ T fueron inducidos juntos en pacientes con cáncer. Para explorar si estas respuestas inmunes integrados también son inducidos espontáneamente para otros antígenos tumorales, hemos evaluado las respuestas de anticuerpos y de células T contra p53 antígeno propio /tumor en pacientes con cáncer de ovario y de los individuos sanos. Se encontró que el 21% (64/298) de los pacientes con cáncer de ovario, pero no hay donantes sanos mostraron respuestas IgG específicos contra la proteína p53 de tipo salvaje. Mientras que ninguno de los 12 pacientes con anticuerpos de alto título p53 mostró p53 específicos CD8
+ respuestas espontáneas de células T después de un solo
in vitro
sensibilización, específica de p53 significativa la producción de IFN-γ CD4
+ T se detectaron células en 6 pacientes. Sorprendentemente, los mismos niveles de p53 específicos de CD4
+ células T CD8 pero no
+ también se detectaron células T en pacientes con cáncer de 5/10 y 9/12 seronegativos donantes sanos. Es importante destacar que, p53 específicos de CD4
+ células T en donantes sanos se originaron a partir de un CD45RA
- población de células T antígeno-experimentado y reconocido procesados de forma natural de la proteína p53 de tipo salvaje. Estos resultados plantean la posibilidad de que las células CD4 específica de p53
+ T reflejan anormalidades en p53 se producen en individuos normales y que pueden desempeñar un papel en los procesos de la inmunovigilancia o inmunorregulación de eventos neoplásicas relacionadas con p53.
cita: Tsuji T, Matsuzaki J, Ritter E, Miliotto A, Ritter G, Odunsi K, et al. (2011) Dividir la tolerancia de células T contra un antígeno propio /Tumor: Espontánea CD4
+ pero no CD8
+ T respuestas de las células contra p53 en pacientes con cáncer y donantes sanos. PLoS ONE 6 (8): e23651. doi: 10.1371 /journal.pone.0023651
Editor: Mauricio Martins Rodrigues, de la Universidad Federal de Sao Paulo, Brasil |
Recibido: Marzo 4, 2011; Aceptado: July 22, 2011; Publicado: 12 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Tsuji et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Grupo de Investigación del cáncer del Instituto del cáncer de Ovario de Trabajo Grant y la vacuna contra el cáncer de colaboración financiado por el Instituto de Investigación del cáncer y el Instituto Ludwig para la Investigación del cáncer Ltd. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
aumento de la evidencia muestra que ambos antígenos tumorales específicos de CD4
células CD8 + y
+ T juegan un papel crítico en la erradicación del cáncer [1], [2]. Hemos investigado extensamente respuestas inmunes espontáneas o inducidas por la vacuna contra el antígeno de cáncer de testículo NY-ESO-1 como un antígeno de tumor prototipo en humanos [3], [4], [5], [6], [7], [8 ]. de origen natural NY-ESO-1 específica de CD4
+ y CD8
+ respuestas de células T se detectaron normalmente sólo en pacientes que tenían anticuerpos séricos contra NY-ESO-1, lo que indica que las respuestas inmunes espontáneas contra NY-ESO- 1 en pacientes con cáncer con NY-ESO-1 que expresan los tumores fueron altamente integrado [3], [4]. Recientemente, se demostró que después de la vacunación con la proteína NY-ESO-1 y CpG, NY-ESO-1-específico CD4
+ células T se convirtieron detectable primero, seguido por la aparición de anticuerpos y CD8
+ células T , lo que sugiere un papel para NY-ESO-1-específico CD4
+ células T en la facilitación de anticuerpos y CD8
+ respuestas de células T después de la inmunoterapia [8]. Además, recientemente hemos encontrado que la vacunación con anticuerpos MAGE-A3-integrada específica de la proteína inducida MAGE-A3, las respuestas de células CD8
+ y CD4
+ T [9]. En los pacientes no pequeñas de cáncer de pulmón de células que recibieron la proteína MAGE-A3 formulado en el AS02B sistema adyuvante, CD8
+ respuestas de células T fueron inducidos sólo en pacientes que desarrollaron anticuerpos valor muy alto y fuerte CD4
+ respuestas de células T . Sin embargo, dicha correlación entre anticuerpos y respuestas de células T no ha sido completamente abordado por otros antígenos tumorales humanas.
Durante las últimas décadas, la respuesta inmune contra p53 se han investigado extensamente [10], [11], [12 ], [13]. La proteína p53 fue descubierto en nuestro laboratorio como un antígeno específico de tumor inmunogénico por investigación serológica de ratones portadores de tumores [14], y otros de forma concomitante en dos laboratorios utilizando otros métodos [15], [16]. Más tarde se descubrió que el gen p53 es frecuentemente mutado en varios tipos de cáncer, lo que lleva a la pérdida de heterozygoty, desregulación de redes de realimentación p53, y en última instancia resulta en la rotación p53 más lento y por lo tanto la acumulación de la proteína p53 mutante en células tumorales. En los seres humanos, p53 se acumula en hasta el 70% de los tumores de pacientes con ciertos tipos de cáncer como el de colon o cáncer de cabeza y cuello, y esta acumulación es un evento altamente inmunogénico, lo que provocó espontáneamente respuestas de anticuerpos específicos de alta titulación [12]. De hecho, p53 ha sido uno de los antígenos más frecuentemente detectados reconocidos por anticuerpos de origen natural en pacientes con cáncer por el cribado de bibliotecas de expresión de ADNc derivadas de tumores humanos con el anticuerpo autólogo (SEREX) y por ELISA en nuestro laboratorio [17], [18] , [19], [20]. de origen natural los anticuerpos en suero de p53 en pacientes con cáncer son conocidos para reconocer el tipo salvaje N-terminal o secuencias C-terminal de p53 pero no la región central de la proteína, donde se producen 90% de las mutaciones. También nosotros y otros han investigado las respuestas de células T contra p53 de tipo salvaje y muchos epítopos tanto para CD8
+ y CD4
+ células T han sido determinados por métodos inmunológicos inversa y la estimulación de las células T repetida con péptidos sintetizados [10 ], [21], [22]. Los resultados recientes de T immunomonitoring células de pacientes con cáncer de ovario y colorrectal vacunados con la superposición de péptidos p53 mostraron una fuerte inducción de p53 específicos de CD4
+ respuestas de células T, que eran aún detectable por
ex vivo
análisis de sangre periférica células mononucleares (PBMCs) después de la vacunación sin inducir ningún detectable específica de p53 CD8
+ células T [23], [24].
respuestas
En el presente estudio, hemos investigado y anticuerpos espontánea de células T contra p53 en pacientes con cáncer de ovario, cuyos tumores con frecuencia acumular la proteína p53 [25], y donantes sanos. Para comparar el
in vivo
inmunogenicidad de p53 con la de NY-ESO-1, que supervisó CD4
+ respuestas de células T
+ y CD8 específica de p53 utilizando los procedimientos immunomonitoring que se desarrollaron para monitorear las respuestas de células T NY-ESO-1-específicos espontáneos. Estos métodos estandarizados anteriormente se muestra para detectar NY-ESO-1-específico en circulación CD4
+ y CD8
+ T cell respuestas solamente en pacientes con tumor NY-ESO-1-expresando 1-seropositivos NY-ESO-, pero no en donantes sanos con baja frecuencia de precursores de [4], [26]. Usando este protocolo, se encontró que se detectaron células IFN-γ productoras de CD4
+ T contra las secuencias de p53 de tipo salvaje con frecuencia en pacientes con cáncer seropositivos. Sorprendentemente, espontánea específica de p53 CD4
+ T fueron también encontró respuestas de las células de magnitud similar en la mayoría de pacientes seronegativos y donantes sanos. Por el contrario, hay CD8 espontánea
+ T cell respuestas contra p53 de tipo salvaje ni contra propias secuencias de p53 mutados de los pacientes se detectaron en ninguna donantes probados, lo que sugiere que la activación espontánea de las células CD8
+ respuestas de células T contra p53 es controlado firmemente
in vivo
.
Materiales y Métodos
pacientes y muestras de donantes sanos
CMSP y suero se obtuvieron de pacientes con cáncer de ovario en el Instituto del cáncer Roswell Park, en virtud de un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. PBMCs y suero de donantes sanos se obtuvieron de New York Blood Center.
Medición de anticuerpo específica de p53 en suero
recombinante de tipo salvaje p53 fue producida y el nivel de anticuerpos en suero específica de p53 se midió como descrito anteriormente [20]. A título recíproco se estimó a partir lecturas de densidad óptica de las muestras y los controles diluidos en serie como se describe [20].
péptidos solapantes
Las secuencias de péptidos de la proteína p53 de tipo salvaje utilizados para presensibilización y detección superpuestas se muestran en la Tabla S1. Todos los péptidos se sintetizaron por biosíntesis (Lewisville, TX) y se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración de 10 mM y se almacenaron a -80 ° C. Ellos fueron diseñados para ser longitud de 25 aminoácidos excepto#1 (19-mer) y#30 (22-mer) y tienen 15 aminoácidos superpone. aminoácido para el codón 72 de p53 de tipo salvaje muestra con frecuencia a Arg Pro polimorfismo [27]. Para hacer frente a este polimorfismo, dos péptidos diferentes con Arg o Pro en la posición 72 se prepararon para el péptido#6 y se mezclaron en una proporción 01:01.
presensibilización
in vitro
presensibilización se realizó como se describe antes [28]. CD8
+ y CD4
+ células T fueron separados de PBMCs utilizando Dynabeads (Invitrogen Dynal-AS) y fueron estimulados de forma independiente con CD8
-CD4
- células que se pulsaron durante la noche con 1 piscina (#1-#30), 2 piscinas (# 1-#15 y#16-#30), o 3 piscinas (# 1-#10,#11-#20, y#21-#30) de la superposición de péptidos de acuerdo para el número de células después de la separación e irradiado. Los cultivos de células se complementaron con 10 U /ml de IL-2 y 20 ng /ml de IL-7 dos veces a la semana. Al mismo tiempo, una porción de CD4
+ células T fue policlonal ampliado con fitohemaglutinina (PHA, Remel) en presencia de dosis bajas de IL-2 e IL-7, para ser utilizadas como células diana (T-APC) en ELISPOT ensayo. En algunos experimentos, CD4
+ células T fueron separados aún más en CD45RA
+ y CD45RA
- subconjuntos de ficoeritrina (PE) conjugado con contra-CD45RA anticuerpo monoclonal (mAb) (BD Biosciences) y anti-PE perlas magnetico (Miltenyi Biotec).
Detección de la respuesta de células T específica de p53
IFN-γ la producción específica de p53 se evaluó mediante el ensayo ELISPOT en el día 9-12 para CD8
+ células T y los días 18-25 de CD4
+ células T. En primer lugar, se evaluaron las células T por su reactividad frente a 6 grupos de 5 péptidos (# 1-#5,#6-#10, etc.). En algunos experimentos, un conjunto de 17 péptidos solapantes de NY-ESO-1 se utilizó como péptidos irrelevantes. Si se detectó la producción de IFN-γ contra cualquiera de reservas de péptidos, péptidos fueron probados independientes en la piscina para determinar un único péptido reconocido. Todos los resultados de los ensayos de ELISPOT se presentaron como el número medio de células formadoras de manchas de IFN-γ a partir de pocillos duplicados sin restar el número de manchas de fondo contra las células diana no pulsadas. Las respuestas se consideraron positivas si el número de puntos contra el péptido (s) células diana -pulsed era 3 veces más que contra las células diana no pulsadas y más de 25 puntos /células T efectoras 50.000. Para algunos pacientes, las células T específica de p53 se detectaron por tinción intracelular de citoquinas y ensayos de expresión CD107a. tinción intracelular de citoquinas para IFN-γ, IL-4, y TNF-α se realizó como se describe anteriormente [28]. Para ensayos de expresión CD107a, presensibilizada CD8
+ células T se volvieron a estimular en presencia de 40 l /ml de PE conjugado anti-CD107a mAb (BD Biosciences) y 0,66 l /ml GolgiStop (BD Biosciences). En algunos experimentos, las células T + p53-péptido específico CD4
se aislaron mediante clasificación por citometría de flujo de células que expresan CD154 después de la reestimulación con los péptidos p53 y fueron policlonal expandido con PHA como se describe anteriormente [28]. El reconocimiento de la proteína p53 natural procesado y la producción de citoquinas por p53 específicos de CD4
+ líneas de células T se investigaron mediante el uso de células autólogas derivadas de monocitos dendríticas (MO-DC) pre-pulsadas durante la noche con p53 superposición de péptidos (3,3 M), proteína recombinante p53 (20 g /ml) o el control de la proteína NY-ESO-1 (20 mg /ml). Los niveles de citoquinas en los sobrenadantes se midieron por ELISA sándwich utilizando los siguientes pares de mAb: no marcado y-anti-IFN-γ biotinilado (BD Biosciences), no marcado y anti GM-CSF biotinilado-mAbs (BD Biosciences), no marcado y biotinilado anti -il-4 anticuerpos monoclonales (BD Biosciences), y no marcados con biotina-anti-IL-13 mAb (eBioscience), y no marcados con biotina-anti-IL-10 anticuerpos monoclonales (mAb), eBioscience no marcadas con biotina y anti-TGF-beta (eBioscience ), no marcados y biotinilados anti-IL-17 mAbs (eBioscience), y mAb no marcados y biotinilado anti-IL-9 (eBioscience). proteínas citoquinas estándar se obtuvieron de eBioscience.
Resultados
respuesta de anticuerpos anti-p53
Para evaluar la inmunidad espontánea contra p53, que mide los títulos de anticuerpos en suero contra p53 y NY-ESO -1 proteínas en 298 pacientes con cáncer de ovario epitelial avanzado y 153 individuos sanos por ELISA. Como se muestra en la Figura 1, 21% de los pacientes, pero ninguno de los individuos sanos mostró significativa de anticuerpos en suero anti-p53, que era muy similar a la frecuencia de anti-NY-ESO-1 respuestas de anticuerpos observados (21%). Estas frecuencias de respuestas de anticuerpos espontáneas contra p53 y NY-ESO-1 están en el rango de los reportados para los pacientes con cáncer de ovario en diversos estudios [29]. Por el contrario, un menor número de pacientes (7%) mostraron anticuerpos séricos significativa contra antígeno de cáncer /testículo MAGE-A3 (datos no mostrados). La frecuencia de pacientes que mostraron ambos anticuerpos séricos p53 NY-ESO-1 y fue del 4,7%, que está cerca de la frecuencia calculada de frecuencias contra cada antígeno Suponiendo que la inducción de estas respuestas es independiente (0,21 (21% frente a p53) × 0,21 (21% contra NY-ESO-1) = 0,044 (4,4% frente a ambos antígenos)).
los sueros de 298 pacientes con cáncer de ovario y 153 individuos sanos se evaluaron para el anticuerpo contra p53 de tipo salvaje y NY -ESO-1 proteínas por ELISA. Los títulos recíprocos se calculan como se describe en la referencia [20].
indetectable espontánea CD8
+ respuesta de células T en pacientes con cáncer y donantes sanos
Para el immunomonitoring de T espontánea respuestas de las células, es importante seleccionar un método que puede distinguir
en Destinia.com -primed de células T in vivo
in vitro inducida por las células T
. Para supervisar las respuestas de células T inducidas de forma espontánea contra-p53, se empleó una sola
in vitro
protocolo de sensibilización que se ha desarrollado y validado para detectar respuestas de células T espontánea NY-ESO-1 específica sólo en NY-ESO- 1 pacientes con cáncer seropositivos pero no en los individuos sanos. El uso de este protocolo, NY-ESO-1 específica CD8
+ células T se detectaron con frecuencia de NY-ESO-1 seropositivos pacientes con cáncer ovárico, pero no de individuos sanos en este estudio de cohorte (Figura S1 (A)). Por el contrario, varias rondas de estimulación de las células de procesamiento de antígeno profesionales (APC), tales como mo-DC pueden inducir a las células T NY-ESO-1 específica a partir de precursores NY-ESO-1 específica de ingenuos en donantes sanos [30], [31 ]. Debido a la frecuente aparición de anticuerpos en el suero espontánea contra p53 en pacientes con cáncer de ovario, se analizaron primera p53 específicos CD8
+ respuestas de células T en estos pacientes. Desde el descubrimiento de que las células T NY-ESO-1-específicos espontáneas son detectables sólo en pacientes seropositivos, se seleccionaron 12 pacientes con cáncer de ovario con las respuestas de anticuerpos espontáneas contra p53 para la evaluación de respuestas de células T. + células T
CD8
+ y CD4 fueron aisladas de PBMC como se describe en materiales y métodos, y se estimularon por separado con
-CD8
pulsadas CD4-péptido p53 - células. Después de cultivar durante aproximadamente 10 días, se evaluó el número de IFN-γ productoras específica de p53 CD8
+ T células mediante el ensayo ELISPOT. Como se muestra en la Figura 2A, dos pacientes seropositivos representativos no mostraron detectable anti-p53 CD8
+ respuesta de células T por nuestro protocolo immunomonitoring estándar. Del mismo modo, no hay producción significativa de IFN-γ CD8 se detectó
+ células T de 10 pacientes seropositivos adicionales (Figura 2B). Diez pacientes con cáncer de ovario seronegativos y 12 donantes sanos también fueron probados por su espontánea CD8
+ respuesta de células T contra p53 y como se esperaba, no hubo indicación de p53 específicos CD8
+ células T (Figura 2B). Es posible que específica de p53 CD8
+ células T carecen de capacidad-γ productoras de IFN y que son detectables por la expresión de otras moléculas. Para probar si específica de p53 CD8
+ células T fueron detectables por otras moléculas de activación inducida, 5 seropositivos y seronegativos 5 pacientes se analizaron para la producción de TNF-α y la expresión CD107a después de la reestimulación con los péptidos. Como se muestra en la Figura 2C, no específica de p53 CD8
+ se detectó respuesta de células T basado en TNF-α y la expresión CD107a
.
(A) CD8
+ T células de cáncer de ovario positiva anticuerpo pacientes fueron presensibilizada con un grupo de 30 p53 péptidos solapantes. Después de 9-12 días, específica de p53 células T productoras de IFN-γ se evaluaron por ensayos de ELISPOT. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) de pocillos duplicados. Autólogo T-APC se utilizaron como células diana en ensayos de ELISPOT. se muestran (B) CD8
+ respuestas de células T en 7 seropositivos y 5 pacientes con cáncer de ovario seronegativos y 12 donantes sanos. células (C) presensibilizada CD8
+ T se analizaron mediante ensayos intracelular tinción de TNF-α y la expresión CD107a después de la re-estimulación con p53-péptidos pulsado, las células (NY-ESO-1) péptidos-pulsados o diana no pulsada irrelevantes.
Estos resultados indican que IFN-γ espontánea productoras de CD8
+ respuestas de células T contra la p53 de tipo salvaje no eran detectables incluso en pacientes con cáncer seropositivos por nuestro protocolo presensibilización en contraste con la detección frecuente de NY CD8 -ESO-1 específica
+ respuestas de células T en pacientes NY-ESO-1-seropositivos (Figura S1 (A)). La acumulación de proteína p53 mutado en las células tumorales es conocido que se correlaciona con la respuesta de anticuerpos [32]. Debido a que los péptidos mutados se consideran ser inmunogénica debido a la ausencia de la tolerancia y la inmunogenicidad de p53 mutante para inducir CD8
+ respuestas de células T se demostró en ratones [33], [34], el próximo tratado CD8
+ de células T respuestas contra p53 mutado. Para ello, los exones 5-7 del gen p53 a partir de tejidos tumorales y linfocitos normales de pacientes con cáncer de ovario se secuenciaron para identificar posibles mutaciones de p53 en el tumor (datos no mostrados). Entre las mutaciones detectadas, tres mutaciones que se producen con frecuencia, S127F, R273C, R282W y se seleccionaron para buscar CD8 específica
+ respuesta de células T contra epítopos que abarcan estas mutaciones. CD8
+ células T de tres pacientes que tenían tumor con S127F, R273C o mutación R282W se estimularon con péptidos que contienen la mutación de p53 del paciente o con péptidos que contienen la secuencia de tipo salvaje correspondiente. No se detectó mutada específica de péptido CD8
+ respuesta de células T en estos tres pacientes (datos no mostrados).
CD4
+ T respuestas de células en pacientes con cáncer e individuos sanos
las respuestas que ocurren de forma natural Para detectar CD4
+ células T contra p53, CD4
+ células T de pacientes con cáncer seropositivos fueron estimuladas con péptidos pulsados en PBMCs sin células T autólogas utilizadas como vehículos blindados se solapan. Después de 20 días de cultivo en presencia de dosis bajas de IL-2 e IL-7, IFN-γ-la producción de células CD4
+ células T fueron enumerados por ensayo ELISPOT contra la sub áreas de superposición de péptidos y luego contra péptidos individuales de sub áreas reactivas . En contraste con la indetectable específica de p53 CD8
+ células T, significativa IFN-γ productoras específica de p53 CD4
+ T respuestas de las células a sub áreas de superposición de péptidos se encontraron en 6 de cada 12 pacientes seropositivos (Figura 3A y los datos no presentados), con una magnitud comparable a CD4 espontánea
+ T cell respuestas contra NY-ESO-1 en NY-ESO-1 seropositivos pacientes con cáncer de ovario en esta cohorte de estudio (Figura S1 (B)). Seguidamente, evaluó espontánea CD4
+ respuestas de células T contra p53 en 10 pacientes seronegativos y 12 individuos sanos. Sorprendentemente, a pesar de nuestro método presensibilización no detectó NY-ESO-1 específica de CD4
+ células T en individuos sanos (Figura S1 (B)), el mismo procedimiento detectó significativa de IFN-γ-la producción de células CD4
+ T respuestas de las células en 5/10 pacientes seronegativos y 9/12 individuos sanos probaron (Figuras 3B y C y los datos no presentados). En pacientes seleccionados, p53 específicos de CD4
+ T células fueron detectables por la producción de TNF-α después de la tinción intracelular de citoquinas (Figura S2).
CD4
+ T células de anticuerpos positivo (A) y negativo (B) los pacientes con cáncer de ovario y de donantes sanos (C) se presensibilizada con piscina (s) de la superposición de péptidos p53. Después de 18-25 días, p53 específicos de células T productoras de IFN-γ se evaluaron contra el péptido-pulsado o no pulsada (
φ
) células diana por ELISPOT. Las barras de error representan la desviación estándar de pocillos por duplicado. Autólogo T-APC se utilizaron como células diana en ensayos de ELISPOT. respuestas de células T fueron evaluados por primera vez contra el sub áreas de péptidos (1er ensayo) y luego contra el péptido independiente en un subgrupo reactiva (segundo ensayo). Para el donante sano se muestra en (C),
+ células T CD4 que fueron presensibilizada con#1-#10 o#21-#30 péptido no mostró respuestas significativas (datos no mostrados).
Figura 4 se resumen los epítopos reconocidos por CD4
sup + T de pacientes con cáncer seropositivos y seronegativos y donantes sanos. Como se muestra en la Figura 4, los epítopos que se encuentran en los dos pacientes con cáncer de seropositivos y seronegativos y donantes sanos fueron distribuidas en toda la secuencia de la proteína p53. Ciertos péptidos tales como#9,#13 y#26 inducida de células CD4
+ respuestas más frecuentes de células T en 4 (20% de los encuestados), 6 (30%) y 7 (35%) donantes, respectivamente. Algunos pacientes con cáncer y donantes seronegativos sanos mostraron múltiples específico de epítopo CD4
+ T cell respuestas, como se ve en los pacientes de cáncer seropositivos. Para tener en cuenta el polimorfismo observado con frecuencia en un codón 72, se utilizó una mezcla de dos péptidos variantes de péptido nº 6 (Tabla S1), que podría inducir a
de novo
respuestas en individuos con un genotipo homocigótico p53 en un codón 72. sin embargo, no se detectó ninguna respuesta de las células T contra péptidos nº 6 en este estudio, lo que indica que nuestro protocolo de cultivo a corto plazo no parece inducir
de novo
CD4
+ T cell respuestas. La magnitud de las respuestas y la distribución de los epítopos eran similares en pacientes con cáncer e individuos sanos. Es bien sabido que los epítopos reconocidos por el anticuerpo específica de p53 se limitan a la N-terminal y la región C-terminal de la proteína [32], [35]. Sin embargo, no hubo correlación entre los mapas de epítopos de CD4 + células T
y para los anticuerpos (Figura 4). Además, la mutación de la proteína p53 en células de cáncer se encuentra con frecuencia en la región central del gen [32]. Sin embargo, no había sobrerrepresentación de CD4 epítopos
+ de células T en esta región, lo que sugiere que las respuestas no fueron mediadas por reactividad cruzada de mutada específica de péptido CD4
+ células T. Para encontrar la mutación específica de CD4
+ células T en tres pacientes con un tumor que expresa p53 mutado, las células CD4
+ T de los pacientes fueron presensibilizada con péptidos que contienen la mutación afines de los pacientes. Aunque un paciente cuyo tumor tenía S127F mutación mostró débiles CD4
+ respuestas de células T contra los dos péptidos de tipo salvaje mutados y correspondientes, no significativo-mutación específica CD4
+ respuesta de células T podría ser detectado (datos no mostrados).
La magnitud de CD4
+ respuestas de células T en pacientes con cáncer de ovario con o sin anticuerpos en suero específica de p53 y de donantes sanos contra la superposición de péptidos p53 se representa. Cada símbolo representa un individuo. Todas las respuestas se muestran fueron significativas en comparación con el número de manchas de fondo. 6/12 seropositivos (símbolos de color rosa) y 5/10 seronegativos (símbolos azules) pacientes con cáncer de ovario y 9/12 individuos sanos (símbolos negros) fueron positivos para CD4
+ T cell respuestas contra células diana pulsadas con péptido p53 en comparación con los no pulsada las células diana.
origen del repertorio de p53 específicos de CD4
+ células T
a diferencia de la detección de células T CD4 + específica de p53 en seropositivos y seronegativos pacientes con cáncer así como en donantes sanos, nuestro protocolo presensibilización sólo permite la detección de NY-ESO-1-específico IFN-γ productoras de CD4
+ células T en-1 NY-ESO pacientes con cáncer seropositivos pero no en pacientes con cáncer seronegativos y saludable los individuos cuando las células T derivadas de PBMC toda CD4
se presensibilizada con NY-ESO-1 péptidos superpuestos. Sin embargo, se informó recientemente de que NY-ESO-1 específica de CD4
+ células T podrían ser inducidas a partir CD45RA
+ indiferenciadas CD4
+ T células en donantes sanos después de
in vitro
presensibilización mediante la eliminación de CD25
+ células T reguladoras [36], [37]. Estos resultados indican que NY-ESO-1-específico CD4
+ T precursores de células presentes en individuos sanos son susceptibles a la supresión por células T reguladoras, pero en pacientes con cáncer,
in vivo
-primed NY-ESO -1-células específicas CD4
+ T se vuelven resistentes a esta supresión [36], [37]. Detección de IFN-γ secretora de p53 específicos de CD4
+ células T en individuos sanos después de una sola
in vitro
sensibilización en la presencia de células T reguladoras sugiere que ya están preparados
in vivo
. Para determinar el estado de activación de p53 específicos de CD4
+ células T en donantes sanos, ingenuo y con experiencia antigénica CD4
+ células T fueron separados basados en la expresión de CD45RA y se estimularon con péptidos p53 se solapan. La inducción de p53 específicos de CD4
+ células T se evaluó mediante ensayos de ELISPOT. Como se muestra en las Figuras 5A y 5B, a diferencia de lo que se había observado con NY-ESO-1-específico CD4
+ T células, específica de p53 IFN-γ productoras de CD4
+ células T fueron detectables a partir de una CD45RA
- población con experiencia antigénica de donantes sanos. Además, las respuestas más pequeños también se indujeron de CD45RA
+ población de células T naïve (Figura 5A). Debido CD45RA no es un marcador absoluto de células T ingenuas, todavía hay una posibilidad de que
+ células T CD4 + específicas de p53 en el CD45RA
+ población de células T ya se activaron
in vivo
[ ,,,0],38]. Sin embargo, este resultado indica que al menos una parte de p53 específicos de CD4
+ células T se han cebado
in vivo
incluso en individuos sanos.
(A-B)
en vivo
cebado de p53 específicos de CD4
+ T en individuos sanos. CD4
+ CD45RA
+ ingenuo y CD4
+ CD45RA
- células T con experiencia antigénica se aislaron mediante citometría de flujo y presensibilizada con péptidos p53 se solapan. Después de 20 días, las células T específica de p53 IFN- productoras se evaluaron por ensayos de ELISPOT. Autólogo T-APC se utilizaron como APC. (C) El reconocimiento de la proteína p53 natural procesada.
+ líneas de células T CD4-p53 específica contra p53#1-#15 péptidos piscina o#16-#30 péptidos de la piscina se establecieron a partir de 3 donantes sanos como se describe en materiales y métodos. Fueron estimulados por autólogo mo-DC pre-pulsadas con péptidos p53, la proteína p53 o la proteína NY-ESO-1. la producción de IFN-γ se evaluó mediante ensayos de ELISPOT (izquierda) y ELISA (derecha). Las barras de error representan SD de pocillos por duplicado.
Caracterización de las células
p53 específicos CD4 + T
Para caracterizar mejor
+ células-T CD4 específica de p53 en sana donantes, líneas de células T específica de p53 se generaron mediante el aislamiento de CD154 que expresan CD4
+ células T después de la reestimulación con los péptidos p53 seguido de una expansión policlonal con PHA (datos no presentados). Se empleó este método basado en la expresión de CD154 para detectar múltiples CD4
+ subconjuntos de células T para el análisis de la producción de citoquinas patrón [28]. Cuatro
líneas de células CD4 + T se generaron contra reservas de péptidos p53 a partir de 3 donantes sanos. Todos
+ líneas de células T CD4 producen específicamente GM-CSF, que se produce a partir de ambas células Th1 y Th2, tras la estimulación con péptido-pulsado mo-DCs (Tabla 1). Los niveles de otras citoquinas producidas por CD4
+ líneas de células T se muestran en la Tabla 1. De acuerdo con la detección eficiente de específica de p53 CD4
+ T células por ensayos ELISPOT de IFN-gamma, todo-p53 específico CD4
+ líneas de células T de donantes sanos producen grandes cantidades de IFN-γ. Además de IFN-γ, niveles significativos de IL-13 y pequeñas cantidades de IL-4 también se produjeron en concreto, lo que indica que las líneas de células T eran una mezcla de células Th1 y Th2. Dos líneas de células CD4
+ T producen pequeños niveles de citocina inmunorreguladora, IL-10. Una CD4
línea + células T produjo niveles pequeños pero significativos de IL-9, que se produce por Th9 y está regulada por IL-4 y TGF-β, indicando potencialmente la presencia de la señalización de TGF-β durante la diferenciación de p53 específico de CD4 + células T
. Sin embargo, la producción de TGF-β no se detectó en el sobrenadante (datos no mostrados). Además, IL-17, que es producida por Th17, no se detectó en ninguna CD4
líneas celulares + T (datos no mostrados). A continuación, el reconocimiento de la proteína p53 natural procesada fue investigado por el uso autólogo mo-DC como APC. Como se muestra en la Figura 5C, todos CD4
+ líneas de células T reconoció de manera eficiente las células diana en proteínas p53 pulsada como se detecta por la secreción de IFN-γ. Este resultado demuestra células T CD4 específica de p53
+ detectable en donantes sanos son capaces de reconocer la proteína p53 natural procesado y hace que sea poco probable que se activan
in vivo fotos: por otras proteínas con secuencias similares.
Discusión
acumulación de la proteína p53 mutado en tumor se observa con frecuencia en muchos tipos de tumores e induce respuestas inmunes humorales, demostrando fuerte inmunogenicidad de p53 [12]. Por lo tanto, p53 ha sido considerado un objetivo prometedor para la vacunación contra múltiples tipos de cáncer. Sin embargo, aquí nos informe la falta de detección de
in vivo
-primed específica de p53 CD8
+ T cell respuestas en pacientes con cáncer con anticuerpos espontáneos a p53, así como en pacientes seronegativos y p53 en donantes sanos utilizando nuestra única
in vitro
protocolo de sensibilización en. En contraste, el mismo protocolo de frecuencia detecta
células NY-ESO-1-específicos CD8 + T en pacientes con cáncer de NY-ESO-1-seropositivos en la misma cohorte de estudio, lo que indica que la inmunogenicidad natural para inducir espontánea CD8
+ respuestas de células T pueden ser diferentes en p53 y NY-ESO-1, incluso en los pacientes seropositivos para estos antígenos. Se informó de que a pesar de la ciclina B1-específica CD8
+ células T se convirtió detectable después de un corto única
in vitro
estimulación, p53 específicos CD8
+ células T contra 6 HLA-A * 02 vinculante péptidos no pudieron ser detectados en 5 ciclina B1-reactivo y 5 pacientes no reactivos con el mismo método [39]. Nuestros resultados ampliar sus observaciones mediante el control de las respuestas CD8
+ células T a toda la región de la proteína mediante la superposición de péptidos y mediante la inclusión de anticuerpos con immunomonitoring espontánea y CD4
+ T cell respuestas. Varios ensayos de vacunas, tales como los DC-p53 transducidas o largos péptidos superpuestos han informado de la inducción de respuestas de células T con el beneficio clínico limitado [23], [24], [40], [41].