Extracto
SSX es un factor de transcripción con funciones oncogénicas esquivos expresadas en una variedad de tumores humanos de origen epitelial y mesenquimal. Se ha aumentado el interés sustancial como un objetivo para la terapia del cáncer, ya que provoca respuestas humorales y muestra la expresión con el cáncer, espermatogonias y células madre mesenquimales restringidas. Aquí, hemos investigado las propiedades oncogénicas de SSX mediante el empleo de una interferencia de ARN para knock-down de la expresión endógena de SSX en líneas celulares de melanoma y osteosarcoma. El agotamiento de la expresión de SSX resultó en la proliferación reducida con las células que se acumulan en la fase G1 del ciclo celular. Se encontró que el promotor del crecimiento y las propiedades de supervivencia de SSX están mediados en parte, aunque la modulación de MAPK /Erk y las rutas de señalización de Wnt, ya que SSX silenciar inhibe la señalización mediada por Erk y transcripción de cMYC y Akt-1. También se encontró que SSX forma un complejo transitoria con β-catenina en el límite de la fase G1-S resulta en la expresión alterada de β-catenina genes diana tales como E-cadherina, caracol-2 y vimentina, implicado en las transiciones epiteliales-mesenquimales. Es importante destacar que el silenciamiento de la expresión de SSX en
in vivo
deteriora significativamente el crecimiento de xenoinjertos de tumores de melanoma. biopsias de tumores de los tumores SSX silenciados muestra reducida de la ciclina A tinción, indicativo de baja proliferación y predominantemente cycloplasmic β-catenina en comparación con los tumores que expresan SSX. El presente estudio demuestra una función previamente desconocida de SSX, que como un oncogén y como diana tumoral para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer
Visto:. D'Arcy P, W Maruwge, Wolahan B, Ma L, Brodin B (2014) oncogénico funciones del cáncer de testículo antígeno SSX sobre la proliferación, supervivencia y vías de señalización de las células cancerosas. PLoS ONE 9 (4): e95136. doi: 10.1371 /journal.pone.0095136
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Septiembre, 2013; Aceptado: March 24, 2014; Publicado: 30 de abril 2014
Derechos de Autor © 2014 D'Arcy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación sueca niños cáncer, el Lillian Sagens och Curt Ericssons Forskningsstiftelse, y la Fundación del cáncer de Estocolmo a Bertha Brodin. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
SSX
se identificó inicialmente como parte de la
ES18 /SSX
gen de fusión en el sarcoma sinovial [1] y como el antígeno tumoral de melanoma asociado HOM-Mel40 [2] . Se compone de una familia de nueve, genes altamente homólogas organizados en grupos en el cromosoma X con productos clasificados como antígenos de cáncer de testículo-en función de su expresión restringida en tumores y testículos. En las células normales, la expresión de SSX se ha encontrado en espermatogonias [3], [4], las células madre mesenquimales [5]. La expresión de miembros de la familia SSX en los tumores ha sido ampliamente investigados, y se ha demostrado que SSX1, SSX2, SSX4 y SSX5 se expresan de forma independiente o simultáneamente a menudo se presentan los patrones de expresión generalizadas, dispersos o focales en tumores de origen epitelial, hematopoyético, de los nervios y mesenquimales . origen [3], [6] - [8]
La proteína es rica en aminoácidos cargados [9], y contiene dos dominios llamados represor que reprime la transcripción
in vitro
; una caja Krüppel asociada localizada en el extremo N, y un dominio represor más fuerte (RD) en el extremo C-terminal [10], [11]. En las células, SSX tiene un patrón de expresión granular y se localiza en el núcleo y el citoplasma [5], [12]. La interacción directa de SSX con el ADN no se ha demostrado, por lo tanto, se supone que SSX reprimir la transcripción mediante la formación de complejos con proteínas de unión a ADN. En apoyo de este modelo, tanto SSX y SS18 /SSX producto génico de fusión han demostrado interactuar con miembros del complejo represor polycomb Bmi-1 y el anillo 1 [13], y las histonas de núcleo [14] lo que sugiere que SSX puede controlar la expresión de genes que regulan la diferenciación celular. Otras proteínas que interactúan con SSX son los RAB3IP proteína GTPasa de unión a Ras-como, la proteína nuclear SSX2IP [15], y la proteína LIM homeobox LHX4 [16].
Desde su descubrimiento como un antígeno de cáncer de testículo, la inmunoterapia focalización de SSX ha suscitado gran interés como una estrategia contra el cáncer debido a su inmunogenicidad expresión tumoral [2], [3], restringido, y la correlación entre la expresión de SSX y progresión de la enfermedad [8], [17], [18] . respuestas citotóxicas de las células T se han generado
in vitro
contra epítopos SSX [19] - [21], sin embargo, la validación de SSX como una diana terapéutica
in vivo
no ha sido reportado. En la presente investigación hemos evaluado el papel de SSX en la mediación de crecimiento celular y la supervivencia de las células cancerosas, en
in vitro
y
in vivo
, e identificado las vías de señalización de crecimiento expresión de SSX.
Resultados
SSX2 se expresa preferentemente en el melanoma metastásico lesiones y líneas celulares derivadas, pero no en las células normales
Hemos investigado la expresión de SSX1 a SSX5 en 12 lesiones del melanoma metastásico, 9 passaged temprana líneas celulares de melanoma, los melanocitos humanos normales epiteliales (NHEM) y fibroblastos diploides humanos (HDF) utilizando una secuenciación validados método RT-PCR descrita anteriormente [5]. Al igual que en otros estudios publicados, encontramos que varias transcripciones SSX se expresaron de forma simultánea en todos los melanomas y líneas celulares de melanoma examinadas. Curiosamente SSX2 se detectó en casi todos los tejidos de melanoma y líneas celulares derivadas (95%) en comparación con SSX4 (57%), SSX1 (38%), SSX5 (33%) y SSX3 (19%) de expresión. Ninguno de los miembros SSX se detectaron en los melanocitos epiteliales humanas normales (NHEM) o en fibroblastos diploides humanos normales (HDF) (Figura 1). La secuencia de los cebadores utilizados para la detección de SSX-1 a SSX-9 y la expresión de SSX en líneas celulares de osteosarcomas incluyendo la línea utilizada en este estudio SAOS-2 se muestra en la Figura S1.
Expresión
SSX era analizado por un método de RT-PCR anidada se ha descrito anteriormente utilizando cebadores que reconocen SSX1 a SSX 9 cDNA. biopsias frescas se obtuvieron de las lesiones metastásicas de pacientes con melanoma. La línea celular de melanoma DFW que expresan altos niveles de SSX1 a SSX5 se utilizó para los estudios de ARNi. NHEM: los melanocitos epiteliales humanas normales, HDF:. Fibroblastos diploides humanos
El silenciamiento condicional de SSX inhibe la proliferación celular del tumor al bloquear la entrada de células tumorales en la fase S
Para tener una idea de la función de SSX en las células tumorales, se silenció SSX en la línea celular de melanoma que expresa DFW SSX1 a SSX5 (Figura 1) usando plásmidos para la vez estable y doxiciclina expresión condicional de moléculas de ARNhc dirigidas transcripciones SSX1-9 (Figura 2A y la Figura S2) como se describe en materiales y métodos.
a) representación gráfica de la secuencia shRNA (complementaria a SSX1 a SSX9) se ligaron en vectores para la expresión de ARNhc shRNA estable y regulada doxiciclina (ver materiales y métodos). B) Western blot que muestra la expresión de SSX en control-shRNA y SSX-shRNA transfectadas las células 24 horas después de la adición de doxiciclina al medio de cultivo. C) Cuantificación de colonias de células en el control y SSX-shRNA transfectaron células DFW cultivadas en presencia de doxiciclina durante 8 días. curvas D) de proliferación celular determina contando el número de células vivas en cultivos de control y silencio SSX utilizando tinción con azul de tripano. E) la progresión del ciclo celular en fase S determinado por la incorporación de BrdU en un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). F) Porcentaje de células en G1, S y G2 fases del ciclo celular en el control y SSX shRNA derribado células DFW durante un período de 96 horas.
silenciamiento condicional de SSX fue inducida por la adición de doxiciclina en el medio y dio lugar a una disminución significativa de la proteína SSX después de 24 horas (Figura 2B). los recuentos de viabilidad celular utilizando células de exclusión de azul de tripano mostraron la presencia de células viables pero no proliferativas en presencia de doxiciclina que indica que la expresión de SSX es necesario para el crecimiento celular (Figura 2D). Para investigar la validez de esta observación también se realizó siRNA desmontables expresión de SSX en dos líneas celulares de osteosarcoma adicionales, U2-OS y SAOS-2, usando moléculas de ARNi dirigidos SSX1-9 o específico para SSX1 y SSX2. De manera similar a los resultados anteriores SSX agotamiento resultó en la proliferación reducida en comparación con el control de siRNA que indica que el fenotipo observado es un efecto de buena fe de SSX desmontables y no debido a los efectos fuera de objetivo (Figura S2). En ensayos clonogénicos, el silenciamiento de SSX en las células tumorales DFW resultó en una formación de colonias alterada como se observa por una disminución de cuatro veces en el número de colonias en las células cultivadas en presencia de doxiciclina durante 14 días en comparación con los controles (Figura 2C). Análisis del ciclo celular de las células DFW en después de la adición de doxiciclina mostró que las células no pudieron entrar en la fase S del ciclo celular (Figura 2D). El porcentaje de células en la fase S se redujo de 50% (a 0 y 24 horas) a 5% (a 72 y 96 horas) junto con una acumulación concomitante de células en fase G1, indicativo de un defecto en la progresión del ciclo celular ( Figura 2F). Para confirmar este efecto de la expresión de SSX en la entrada en la fase S, sincronizamos tipo salvaje (SSX +) y SSX derribado células DFW en fase G1 /S mediante el bloque doble timidina y la liberación en FBS normales que contienen medio. Control de las células (SSX +) DFW progresaron rápidamente de G1 a la fase S de 4 a 10 horas después de la liberación de la timidina bloque. En contraste desmontables células-SSX no podían atravesar el límite de la fase G1 /S, con las células restantes detenidas en la fase G1 (Figura 3A). En consonancia con esta observación, los niveles de la ciclina E, el componente de regulación del complejo ciclina E-CDK2 y un regulador clave de G1 y la progresión de la fase S, se redujo en paralelo a la regulación a la baja de SSX. (Figura. 3B).
Control (SSX +) y células de melanoma (SSX-) DFW silenciados se sincronizaron en G1 /S fase de doble bloqueo timidina y se liberan en el medio normal como se describe en materiales y métodos. A) La inclusión de las células a la fase S (S) se analizó mediante la cuantificación del contenido de ADN usando yoduro de propidio (PI incorporación) y unos fluorescentes activado FACS clasificador de células. B) Western blot que muestra la expresión dependiente del tiempo de SSX y ciclina E en el control y SSX silenciada (+ células Dox) DFW. Las células fueron sincronizadas en G1 /S (0 h), dado a conocer en un medio normal que contenía FBS y se recogieron en los puntos de tiempo indicados.
SSX media en el crecimiento de células tumorales a través Mapk /ERK vía de señalización
el hallazgo de que SSX sostiene la proliferación de células y es necesario para la entrada de células tumorales en la fase S nos llevó a investigar si este efecto se asoció con cascadas que estimulan la proliferación celular y la supervivencia de señalización. Empezamos comparando el potencial de SSX expresar y desmontables células para activar (fosforilado) los mensajeros intracelulares ERK y Akt-1, después de la estimulación del factor de crecimiento.
La pérdida de expresión de SSX se asoció con una disminución de la fosforilación de la señal extracelular quinasa -regulated (Erk) 1 y 2 pero no de Akt-1 después de la estimulación con FBS. Una disminución en los niveles de proteína de Akt-1, sin embargo se observó en SSX silenciado células (Figura 4). Nuestros resultados sugieren que los efectos de SSX sobre la proliferación de células tumorales están unidos al menos en parte, a la modulación de la actividad de la vía de señalización MAPK /Erk
.
Western blot que muestra la expresión de Erk1-2 y Akt-1 y sus activados (fosforilados) formas pAkt (Ser 473) y Perk (Thr202 /Tyr204) en el control shRNA y células SSX-shRNA DFW. Las células se mueren de inanición en medio libre de suero durante 36 horas (0 h) y la señalización celular se activó por la adición de suero en los medios de comunicación. Las muestras se recogieron a los 10 y 30 minutos (10 'y 30') ya las 6 y las 24 horas (6 h, 24 h) después de la estimulación con suero. expresión de SSX se determina mediante inmunoprecipitación (anticuerpo fl188) y Western Blot (anticuerpo N18) las posteriores bandas recognozing de aproximadamente 22 y 14 kDa.
SSX interactúa con β-catenina para regular la transcripción de β EMT asociados genes-catenina
la región 3 'de la SSX-1, 2 y 4 genes se fusionan a casi todo el gen SS18 en sarcomas sinoviales. Es interesante que la proteína de fusión /SSX2 SS18 forma un complejo con β-catenina que resulta en la activación de un factor de células T TCF /constructo indicador de linfocitos factor de potenciador (Lef) cuando se expresa de forma ectópica en células de mamífero [22]. Por ello, investigó si esta interacción se conserva para las proteínas SSX de larga duración.
Dado que la expresión de SSX varía con la progresión del ciclo celular, sincronizamos DFW y SAOS-2 células (tiempo 0) en el /S límite de la fase G1 y se liberan en el ciclo celular para 6 y 24 hrs y realizado inmunoprecipitación en lisados de células con anticuerpos SSX y inmunotransferencia con β-catenina anticuerpos (Figura 5a). β-catenina se co-precipita con SSX de ambos Saos-2 y células DFW bloqueados en G1 /S (tiempo 0) así como a partir de células que se publicaron en el ciclo celular para 6 y 24 hrs. Para garantizar la especificidad, cantidades iguales de proteína SAOS-2 extractos celulares se inmunoprecipitaron con inmunoglobulinas irrelevantes de ratón (M) y conejo (R) como controles (Figura 5A).
) las líneas celulares DFW y SAOS-2 A se sincronizaron en G1 /S por doble bloqueo timidina como se indica en los materiales y métodos (0 horas), y se liberan en medio normal que contiene FBS para 6 y 24 hrs. SSX se inmunoprecipitó a partir de extractos de proteínas recogidos en los puntos de tiempo indicados mediante el anticuerpo de conejo contra SSX (FL188, detectando SSX1-9). Una cantidad equivalente de proteína de G1 /S bloqueado SAOS-2 células se inmunoprecipitaron con un ratón irrelevante contra (m) o anticuerpo ant-conejo (r). El complejo de proteínas se sometieron a electroforesis en condiciones reductoras y se transfirió éter con cabra anti SSX (N18) o anticuerpos anti-β-catenina de ratón. Los niveles de entrada totales de β-catenina se muestran la imagen del gel superior en. B) Actividad de un indicador de luciferasa TCF /Lef en SSX silenciado y controlar DFW y células Saos-2, 48 horas después de la transfección de las moléculas de siRNA (n = 5). La actividad del reportero TCF /Lef en SSX silenciado células es relativa a la de células de control (= 1). C) la transcripción de genes asociados con la expresión de SSX tanto en las células Saos-2 y DFW, determinded por arrays de PCR que contienen 84 genes asociados con la transición epitelial a mesenquimal (n = 5) y confirmado por Q-RT PCR en SSX silenciados y controlar DFW y SAOS -2 células como se describe en materiales y métodos. SSX fue derribado en células Saous-2 o DFW utilizando moléculas de siRNA o shRNA vectores como se indica. Las células se recogieron y el ARN se aisló 6 nuestra después de siRNA transfección o 6 horas después de la adición de doxiciclina en el medio (condicionalmente shRNA). La pérdida de expresión de SSX siguiente RNAi silenciamiento fue confirmada por Western blot antes de cada matriz Q-RT-PCR, como se muestra en la figura. Pliegue de cambio [2∧ (-Delta Delta Ct)] es la expresión génica normalizada [2∧ (-Delta Ct)] en SSX células divididas por la expresión génica normalizada en el control (SSX +) las células silenciado. Los valores inferiores a uno indican una regulación a la baja o negativa.
El experimento inverso se lleva a cabo también en el que extractos celulares de DFW se precipitaron con anticuerpos β-catenina y borró con anticuerpos anti-SSX. La inmunoprecipitación de β-catenina como resultado la co-precipitación de SSX. De notificación es que el rendimiento de SSX obtuvo siguientes anticuerpos β-catenina fue menor que la inmunoprecipitación inversa, lo que puede deberse a una mayor competencia de unión con otras proteínas (Figura S3) β-catenina.
En la canónica vía Wnt, β-catenina se une a TCF /Lef para activar la transcripción de genes asociados con la proliferación celular, la supervivencia, la motilidad y la diferenciación [23]. Con base en esta se investigó si la interacción de β-catenina con impactos SSX la transcripción de TCF /β-catenina genes diana. En primer lugar se determinó la actividad de un reportero TCF /LEF-luciferasa en células (SSX) + derribado-SSX y control. DFW y células Saos-2 se transfectaron en tetraplicates con a /Lef- reportero de luciferasa de luciérnaga y TCF, ya sea con siRNA a SSX o moléculas de control. La actividad del reportero se evaluó 48 h después de la transfección. Curiosamente se observó una disminución en las células tratadas reportero de la actividad siRNA-SSX en cinco experimentos independientes (Figura 5B). A continuación se investigó si la interacción /β-catenina SSX se asocia con cambios en la transcripción de genes diana endógenos β-catenina /TCF. Con este fin se compararon los perfiles de transcripción de control y SSX desmontables utilizando matrices de RT-PCR para 84 transcripciones asociadas con epitelial a mesénquima (EMT) transiciones en SAOS-2 células. Elegimos genes asociados con EMT basado en el papel de β-catenina en la promoción de EMT y nuestro informe anterior que muestra que la expresión de SSX se asocia con la capacidad invasiva de las células tumorales y con la expresión de genes mesenquimales [5]. Los resultados obtenidos en 5 arrays independientes fueron confirmados por RT-PCR en la línea celular DFW. De 84 genes analizados se encontró que la pérdida de expresión de SSX en células Saos-2 y DFW se asoció con la transcripción reducida de Akt-1, E-cadherina (CDH1), GSK3, Snail 2 (SNAI2), c-myc (cMYC), y vimentina (VIM) (Figura 5C). Con la excepción de Akt-1, todos estos genes llevan secuencias de unión a ADN para el TCF /Lef y por lo tanto se consideran objetivos β-catenina. También se observó un aumento de la transcripción 3A colágeno siguiente regulación a la baja de SSX en SAOS-2 (Tabla S1).
siRNA dirigidos xenoinjerto de tumor Crecimiento SSX deteriora
Después de haber demostrado que SSX se requiere para el tumor crecer células
in vitro
, se analizó el crecimiento de control y SSX silenciados xenoinjertos en ratones. Nos inyectada por vía subcutánea ratones SCID, ya sea con el control shRNA (SSXm) o SSX-shRNA (SSXi) células estables transfectadas DFW (Figura 5A-B), o con células DFW en el que la expresión de shRNA fue condicional regulado con doxiciclina (Figura 5C-D ). En el sistema condicional, SSX caída fue inducida mediante implantación subcutánea de lentos pelets de liberación de doxiciclina como se describe en materiales y métodos. En comparación con el control (SSX +) xenoinjertos de tumores, los tumores desmontables SSX mostraron alteraciones en el crecimiento como se observa por la reducción de las curvas de crecimiento del tumor y por el volumen del tumor reducida en el punto final del ensayo (Figura 6 A-D). Al microscopio, los tumores negativos SSX se muestra necrosis extensa, hasta el 80% y tenía fronteras delineadas (Figura 6E, HTX) con proliferación local de la ciclina A las células positivas. En contraste los tumores de control mostraron crecimiento celular radial con abundante proliferativa (ciclina A positivo) áreas y β-catenina nuclear (Figura 6E). Curiosamente tumores desmontables SSX mostraron una localización predominantemente citoplasmática de β-catenina en comparación con los tumores de control, posiblemente indicando un papel para SSX en la localización celular de β-catenina (Figura 6E). Se confirmó SSX caída en los tumores mediante western blot en biopsias tumorales recientes. (Figura 6F).
A) las células del melanoma DFW transfectadas de forma estable con SSX-shRNA (SSXi) o con un shRNA vector de control (SSXm), ampliado y xenoinjerto en ratones SCID. A) El volumen del tumor se determina en el momento indicado. B) El volumen del tumor en el punto final del experimento (21 días). curvas C) Crecimiento de xenoinjertos de forma condicional SSX-shRNA silenciados células DFW (SSX-) y células de control shRNA (SSX +). La doxiciclina se administró a todos los ratones mediante la inserción subcutánea de una pastilla de liberación lenta para MANTENER concentración constante de doxiciclina (10 M) durante 21 días. D) El volumen del tumor en el punto final del experimento. E) La inmunohistoquímica de los tumores se visualizaron en el microscopio óptico con objetivo de 10x, 63x inserta ampliación:. Hematoxilina (HTX), el marcador de proliferación (Ki-67) y β-catenina (β-cat) guía empresas
Estos resultados demuestran que la baja regulación de la expresión de SSX perjudica el crecimiento del tumor
in vivo
y da como resultado la alteración de localización β-catenina.
Discusión
las proteínas son codificadas SSX por genes que sólo se expresan en varios subtipos de cáncer con la expresión en tejidos normales restringida a las células germinales, trofoblastos y células madre mesenquimales fetales. Teniendo en cuenta esta expresión restringida, los antígenos SSX son objetivos atractivos para la inmunoterapia tumoral [21]. Sin embargo, la función de las proteínas de SSX en la espermatogénesis o tumorigénesis está mal definido. SSX se expresa en distintas subpoblaciones de espermatogonias y en las células madre mesenquimales fetales sugiere un papel para SSX en la diferenciación celular [4], [5]. En los tumores, SSX aumenta el potencial invasivo y reprime la expresión de E-cadherina, como se ha demostrado en el melanoma células [5] y de cáncer de mama, respectivamente [24]. Nuestros resultados muestran que la expresión de SSX es esencial para la entrada de células tumorales en la fase S del ciclo celular y, en consecuencia, las células tumorales que expresan SSX sostener la proliferación celular y la supervivencia a largo plazo. Estas funciones pueden estar asociados con la capacidad de SSX para modular MAPK /ERK, Akt y vías de señalización β-catenina. Consistente con un papel de SSX en la proliferación celular, desmontables de SSX bloqueado activación pERK un componente clave de la cascada de proliferación iniciado por quinasas del factor de crecimiento extracelulares. Además SSX desmontables también resultó en la reducción de la expresión de Akt, una quinasa de señalización celular con un papel central en un gran número de funciones celulares incluyendo el crecimiento celular, el metabolismo y la supervivencia [25]. En apoyo de esto, informes recientes han demostrado que SSX es esencial para la proliferación de células de melanoma [26] y para la capacidad de invasión de células de cáncer de mama [24].
Hemos encontrado que SSX interactúa directamente con β-catenina en G1 células detenidas y que esta interacción afecta a la transcripción de β-catenina /TCF genes diana ya que el silenciamiento de la expresión de SSX se asoció con la disminución de la actividad de un constructo informador de TCF /LEF y disminución de la transcripción de β-catenina /genes diana TVC tales como e -cadherin, GSK3b, caracol-2, vimentina y c-Myc.
β-catenina es un potente factor de transcripción con una larga lista de genes diana implicados en la proliferación celular, y en stemcellness epitelial a las transiciones mesenquimales (EMT ). En un informe anterior hemos propuesto un papel para SSX en EMT sobre la base de nuestras conclusiones de que en una línea celular de melanoma y en las células madre mesenquimales fetales, la expresión de SSX se asoció con un fenotipo mesenquimal, tales como el aumento de la capacidad de invasión de las células, disminución de la E-cadherina y aumento de la matriz de proteinasa 2 (MMP2) expresión [5]. Ahora demuestran que SSX interactúa con β-catenina y en base a nuestros datos de perfiles de transcripción propone que esta interacción puede inducir o mantener un fenotipo mesenquimal. Sin embargo, la actividad del complejo /β-catenina SSX en sitios diana endógenos puede ser dependiente de la línea celular, el tiempo, y la señalización de la microambiente.
SSX es un objetivo actual para el desarrollo de immunovaccines basados en células . células T citotóxicas (CD8 +), que reconocen péptidos SSX han sido aislados de los ganglios linfáticos de un paciente con melanoma SSX2 seropositivos [19], y también se han generado para el immunotargeting de cáncer de próstata células
in vitro
HLA A2 restringido [ ,,,0],21]. Además, se ha informado de que el tratamiento con células dendríticas autónomas cebados con péptidos SSX dio lugar a la remisión del tumor de un paciente sarcoma sinovial [27]. En este informe, muestran que el silenciamiento transcripcional de SSX inhibe el crecimiento de xenoinjertos de melanoma añadiendo más apoyo a la significación de SSX como diana terapéutica.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todo el trabajo de los animales ha sido aprobado por la junta central sueca para estudios en animales (Centrala Försöksdjur nämnden, CFN), Estocolmo Norte. La aprobación ética números N399 /07, N-340/10 a B. B. El animal se han realizado estudios de acuerdo con sus directrices éticas. Recolección de muestras clínicas para la investigación se realizó con el paciente y concent aprobado por el Karolinska, forskningsetikkommitté Nord No 03-019. Todos los datos fueron analizados de forma anónima y de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki.
Líneas Celulares
DFW es una línea celular de melanoma HLA-A2 obtenido a partir de un tumor melanoma metastásico. La línea se genera en el Instituto Karolinska [28], y proporcionado amablemente por R. Kiessling. SAOS-2 (sarcoma osteogénico) es una línea celular generada a partir de un osteosarcoma primario [29] y U2OS es una línea celular de osteosarcoma, las dos líneas celulares fueron proporcionados por M. Fritsche, Universität Freiburg, Alemania. Todas las líneas celulares detectan altos niveles de DO SSX1 a SSX5, determinados usando RT-PCR (Figura 1 y la Figura S1). Las células se cultivaron como cultivos monocapa en medio RPMI (Sigma) suplementado con 10% FBS exento de tetraciclina (Clonetech), 100 mg /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina y 2 mM L-glutamina con atmósfera humidificada, y 5% de CO
2 a 37 ° C.
SSX-ARN de interferencia
Una interferencia de ARN adecuado (RNAi) oligonucleótido dirigido todas las isoformas de SSX SSX (1, 2, 3, 4, 4B, 5 , 7, 8 y 9 de la transcripción de fusión) y el TC 18 /SSX1, ES18 /ES18 SSX2 y /SSX4 expresadas en los sarcomas sinoviales fue identificado mediante la alineación de las secuencias de ARNm del exón 5, el exón 6 y la región 3'UTR del SSX1 a SSX5 usando criterios de ARNi establecidos. Los insertos se diseñaron para contener una secuencia de mRNA SSX 19 pb separadas por un 9-nucleótido espaciador no complementaria, y seguidas por la inversa complementaria secuencia de ARNm 19 pb (Figura 2A). Para el control de vector de ARNhc, una secuencia codificada que contiene 3 posiciones no coincidentes también se clonó en los vectores. oligonucleótidos shRNA fueron clonados en pSuper (por estable) y pSUPERIOR (doxiciclina inducible) vectores (OligoEngine) y mediante PCR y secuenciación del ADN
.
En SSX silenciamiento en las líneas celulares que usamos ambos vectores shRNA y también moléculas de siRNA . Para investigar la especificidad del sistema de RNAi-SSX y controlar fuera de objetivo efectos El efecto de siRNA-SSX utilizados en este estudio se comparó con shRNA vectores disponibles comercialmente dirigidos SSX1 y SSX2 en líneas celulares de 3 independet (DFW, U2OS y SAOS- 2. Esto se muestra en la figura 2. complementaria
Para transfecciones transitorias DFW se transfectó con pSuper SSX shRNA (SSXi) o ARN de control de vector (SSXm) junto con un vector vacío que lleva un casete de resistencia a neomicina. las células se seleccionado después de la transfección en G418 que contiene medios de comunicación, y ampliado en mayor antes de los ensayos. para la generación de células siRNA inducibles, las células DFW se transfectaron con el represor de tetraciclina expresando vector vector pcDNA6 /TR (Invitrogen) y pSUPERIOR usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo las instrucciones del fabricante y seleccionado con 8 mg /ml blasticidin y 1 mg /ml de puromicina. clones de células fueron seleccionados en base a su eficacia en el silenciamiento de la expresión de SSX tras la adición de doxiciclina a una concentración de 10 mg /ml, evaluada por Western blot.
Para los estudios de transcripción del gen de tipo salvaje, DFW o SAOS-2 fueron transfectadas con siRNA-SSX o controlar las moléculas de siRNA (Ambion). silenciamiento eficiente de SSX se confirmó en los clones transfectados a las 8 y 24 horas antes del aislamiento del ARN y las matrices Q-RT-PCR.
Para simplificar SSX células silenciado se conocen como células SSX- y control como SSX +.
sincronización del ciclo celular y análisis
Las células se sincronizan en fase G1 /S mediante el bloque doble timidina
en pocas palabras.; Las células se sembraron a 50% de confluencia y se trataron con 2 mM de timidina durante 12 horas, tripzinized, replated y se liberan en medio normal durante 8 horas, y se bloquean de nuevo en un medio que contenía 2 mM de timidina durante 12 horas. Para silenciamiento condicional de SSX en células DFW sincronizados, se añadió doxiciclina (10 mg /ml) a las células 2 horas antes de la liberación de células en muestras de medio y de células normales a continuación se recogieron en los puntos de tiempo indicados y se analizaron por tinción con yoduro de propidio, o 5'- bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) (Roche Diagnostics) la tinción y análisis FACS. El porcentaje de células en cada fase del ciclo celular se calculó utilizando el software ModFit.
Antibodies, inmunotransferencia e inmunoprecipitación
Para SSX inmunoprecipitación, las células cultivadas se lisaron en tampón de lisis RIPA (Tris 50 -HCl pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,25% de Na desoxicolato, 1% NP-40) suplementado con inhibidores de la proteasa (Roche). Las muestras fueron luego se sonicaron y se centrifugaron durante 10 min (14.000 x g). 100 g de proteína del sobrenadante resultante se resuspendió en un volumen total de 1 ml con PBS que contiene inhibidores de la proteasa y se inmunoprecipitaron durante la noche a 4 ° C con con 3 g fl188 contra SSX 1-9 de anticuerpos (Santa Cruz Technologies) acoplados a la proteína G-Dynabeads (Invitrogen). Los inmunoprecipitados se lavaron una vez con tampón de lisis y dos veces con PBS se resuspendieron en tampón de carga (Invitrogen), se calentó a 70 ° C durante 5 minutos y se resolvió en geles de poliacrilamida al 4-12% para el Western Blot.
Para la detección de proteínas por Western blot, las células se lisaron
In situ
con tampón de lisis /carga; sonicó y se calentó a 70 ° C y se resolvieron en electroforesis en gel de poliacrilamida 4-12% para el Western Blot
Se utilizaron los siguientes anticuerpos:. FL188 (en conejo) para la detección de SSX 1-9, y N18 ( criados en cabra) para la detección de SSX1-4, 6 y 8, (Santa Cruz biotecnologías), y una en la casa producen anticuerpo policlonal contra una secuencia de péptido SSX (SSX PAB); anticuerpos contra la ciclina E-(HE-12, Santa Cruz); ß-catenina (BD Biosciences Pharmingen), Erk, gratificación, Akt, pAkt (Señalización Celular). Para la detección de quimioluminiscencia se utilizó conjugados de peroxidasa de rábano picante acoplada y una mayor detección de quimioluminiscencia sustrato (ECL y Super Señal West Femto, Pierce).
se evaluó la viabilidad celular Ensayo
La viabilidad celular contando el número de vivos y las células muertas mediante recuentos de células de exclusión con azul de tripano tinte por triplicado. En breve 50000 se sembraron en placas de 12 pocillos y se trataron con 10 mg /ml de doxiciclina. Las células se trataron con tripsina y se tiñeron con azul de tripano en los puntos de tiempo indicados. Cada condición se realizó por triplicado y todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
La proliferación celular se determinó en tiempo real usando el analizador de células xCELLigence (Asea BioSciences) que mide la impedancia eléctrica de las células adherentes y se expresa en unidades arbitrarias (índice de célula). Índice de Células es dependiente de la adherencia celular, la morfología y la proliferación.
formación de colonias de ensayo
1 × 10
3 células DFW SSXi se sembraron en placas de cultivo celular 3 cm (por triplicado).