Extracto
El cáncer de páncreas sigue siendo una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer, debido a un crecimiento agresivo, altas tasas de metástasis durante la primera etapa y la falta de un enfoque terapéutico eficaz. Anteriormente puso de manifiesto que Qingyihuaji (QYHJ), un niño de siete hierbas fórmula de la medicina china, exhibió importantes efectos anti-cáncer en el cáncer de páncreas, asociados a modificaciones en el microambiente tumoral, en particular la inhibición de la activación de fibroblastos asociados con el cáncer (CAF). En el presente estudio, hemos generado CAF y emparejado cultivos de fibroblastos normales (NF) de tejidos de cáncer de páncreas humano resecado. Hemos observado que los CAF exhibe una mayor capacidad para inducir la migración celular y la invasión de cáncer de páncreas en comparación con las federaciones nacionales, mientras que los CAF tratados con QYHJ mostraron una disminución de la migración y la invasión de promoción de las capacidades in vitro. Los resultados de los análisis indicaron que, en comparación con las federaciones nacionales, los CAF presentan un aumento de CXCL1, 2 y 8 de la expresión, lo que contribuye a la capacidad de invasión de promoción mejoradas de estas células, mientras que el tratamiento QYHJ suprimió significativamente las actividades de proliferación de CAF y la producción de CXCL1 derivada de la CAF, 2 y 8. Estas observaciones in vitro fueron confirmados en modelos de ratones de cáncer de páncreas humano. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la supresión de la capacidad promotora de tumores de la CAF a través de la medicina herbal china atenúa la invasión de células de cáncer de páncreas
Visto:. Chen L, Qu C, Chen H, Xu L, Q Qi, Luo J , et al. (2014) medicina herbal china suprime la invasión a promover la capacidad de los fibroblastos asociados al cáncer en el cáncer pancreático. PLoS ONE 9 (4): e96177. doi: 10.1371 /journal.pone.0096177
Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: Octubre 31, 2013; Aceptado: 4 Abril 2014; Publicado: 29 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por la National Science Fundation China (81001061, 81370068, 81273953, 81173461); Shanghai Naturaleza Fondo de Ciencia, Shanghai, China (09ZR1406800); Doctorado Fundación Programas del Ministerio de Educación de China (20090071120076); Comité de Ciencia y Tecnología de Shanghai-Star Rising Program (11QA1401300); Los talentos médicos Programa de Capacitación de la Oficina de Salud de Shanghai (XYQ2011008); y el programa de la Universidad de Fudan Zhuo-Xue. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Debido al crecimiento agresivo y una alta tasa de metástasis durante la etapa temprana, el cáncer de páncreas sigue siendo una enfermedad maligna altamente letal [1], y sólo aproximadamente 10 a 20% de cáncer de páncreas es resecable en el momento del diagnóstico [ ,,,0],2]. La gemcitabina ha sido el tratamiento estándar para el cáncer de páncreas avanzado; Sin embargo, la supervivencia media es de 5-6 meses, con el desarrollo frecuente de quimio-resistencia durante el tratamiento [3]. Por lo tanto, el cáncer de páncreas sigue siendo una enfermedad terrible, y hay una urgente necesidad de nuevos estudios para revelar los mecanismos moleculares de la invasión tumoral y la metástasis de desarrollar un enfoque terapéutico eficaz para prevenir y /o tratar de cáncer de páncreas.
fibroblastos cáncer asociado (CAF), componentes predominantes del estroma tumoral, se han extraído de varios carcinomas humanos invasivos, incluyendo cáncer de páncreas [4], [5], [6]. adenocarcinoma ductal pancreático se caracteriza por una extensa respuesta del estroma llamada desmoplasia [7]. Dentro del estroma tumoral, CAF son el tipo de célula primaria, que desempeñan un papel importante en la progresión del tumor [5]. CAF secretan múltiples factores, incluyendo CXC, quimiocinas CC, y otros mediadores de la inflamación, que promueven la proliferación, invasión y metástasis de las células cancerosas. Por otra parte, la acumulación de evidencia ha demostrado que los CAF juega un papel clave en la adquisición de resistencia a fármacos en la terapia de tumores [8], lo que repercute negativamente en los resultados clínicos [9], [10]. Por lo tanto, la inhibición de la activación de los CAF podría representar un enfoque terapéutico potencial para el tratamiento del cáncer de páncreas.
QYHJ, una fórmula medicinal china de siete hierba utilizada para el tratamiento de cáncer de páncreas en China, inhibe tanto el crecimiento del tumor y la metástasis en ratones desnudos modelos de cáncer de páncreas [11], [12], [13]. Además, el uso combinado de QYHJ con la medicina occidental convencional prolonga el tiempo de supervivencia en pacientes con metástasis hepáticas de cáncer de páncreas [14]. Sin embargo, el mecanismo molecular subyacente sigue siendo poco clara.
A continuación, hemos demostrado que los CAF exhibe una mayor capacidad para inducir la migración celular y la invasión de cáncer de páncreas en comparación con las federaciones nacionales, mientras que los CAF tratados con QYHJ mostraron una disminución de la migración y la invasión de promoción capacidades in vitro. Además, se demostró que en comparación con las federaciones nacionales, los CAF expresan altos niveles de CXCL1, 2 y 8, lo que contribuye a la capacidad de invasión de promoción mejorada de estas células. Por lo tanto, el tratamiento QYHJ pudo reprimir las actividades de proliferación y los niveles de CXCL1, 2 y 8 de expresión en los CAF. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la supresión de la capacidad promotora de tumores de la CAF con la medicina herbal china atenúa la invasión de células de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los animales los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos nacionales de Salud para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio. El protocolo de estudio fue aprobado también por el Comité para el uso de animales vivos en la Enseñanza y la Investigación de la Universidad de Fudan, de Shanghai. Al final del estudio, todos los animales fueron decapitados través de la separación médula espinal en la nuca para minimizar el sufrimiento. Los fibroblastos se aislaron a partir de tejidos resecados de dos pacientes con adenocarcinomas ductales pancreáticas (PDAC). Antes de la recogida de muestras, el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente de acuerdo con las directrices institucionales, y el estudio fue aprobado por los comités de revisión ética de la investigación en el Centro de Cáncer de la Universidad Fudan de Shanghai.
Líneas celulares y ratones
la línea celular de cáncer de páncreas humano Capan1 y BxPC3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection, y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Gibco, Carlsbad, CA) a 37 ° C con 5% de CO
2. Se evaluó periódicamente la morfología de la línea celular Capan1, y se analizaron las células por la ausencia de contaminación por micoplasma (MycoAlert, Lonza, Rockland, ME, EE.UU.). Las líneas celulares Capan1 y BxPC3 en los 30~40 pasajes fueron utilizados en nuestro estudio.
hembra Balb /c-nu /nu ratones desnudos de 4-6 semanas se obtuvieron del Instituto de Materia Médica de Shanghai, China Academia de Ciencias (Shanghai, china), alojados en cabinas de flujo laminar en condiciones libres de patógenos específicos y proporcionó alimentos y agua
ad libitum
.
aislamiento de los CAF y pareadas federaciones nacionales
fibrolasts estromales como se describe anteriormente [15]. En resumen, los tejidos de cáncer de páncreas resecado quirúrgicamente se obtuvieron de dos pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático. escrito el consentimiento informado se obtuvo antes de la recogida de tejidos. El tejido tumoral páncreas fresco y tejido normal adyacente (por lo menos 2 cm de la margen del tumor exterior) se picaron en 1-3 mm
3 fragmentos y se digirieron con tripsina al 0,25% a 37 ° C durante 30 min. Los fragmentos resultantes se centrifugaron a 600 xg durante 5 min y se lavaron una vez con DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%. Los fragmentos de tejido se cultivaron posteriormente y se incubaron a 37 ° C. El medio de cultivo se cambió dos veces a la semana durante 3-4 semanas. En estas condiciones, los fibroblastos se explantaron de fragmentos de tejido, mientras que otras células se mantienen en su mayoría en el tejido. Los fibroblastos forman colonias multi-capa de extensión sobre la placa de cultivo. Después de 3-4 semanas más o menos células cultivadas se trataron con tripsina y re-sembraron en frascos de cultivo T25 (paso uno). Los fibroblastos fueron entonces sub-cultivaron durante otros 2-3 pasajes hasta que los cultivos estaban libres de contaminación de las células epiteliales y posteriormente mantenido en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2% de penicilina y estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) . Las células fueron cultivadas a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
cepas 2.NF y CAF se utilizaron en los pasajes 4-5.
La inmunohistoquímica e inmunofluorescencia
La inmunohistoquímica (IHC) se realizó como se describe anteriormente [16]. Brevemente, las muestras de tejido de tumor se fijaron en 10% de formalina y embebidos en cera de parafina. secciones de 3 micras sin teñir posteriormente se cortaron a partir de los bloques de parafina para el análisis IHC. Las secciones se tiñeron con los siguientes anticuerpos: anti-vimentina de conejo (1:200), (1:100), de conejo anti-CXCL1 (1:100), conejo-α-SMA anti-conejo anti-CXCL2 (1:200) , y de conejo anti-CXCL8 (01:25) a 4 ° C durante la noche. Las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios, y el complejo de peroxidasa de avidina-biotina se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Vector Laboratories, CA, EE.UU.). Un control de inmunoglobulina-negativo se utilizó para descartar la unión no específica. Dos investigadores independientes y un patólogo, todos los cuales fueron cegados al tipo de modelo /tratamiento para la serie de muestras, llevado a cabo todos los procedimientos. Para evaluar cuantitativamente la actividad proliferativa inducida por la CAF en cada grupo, se calculó la proporción del área positivas para vimentina y tinción de α-SMA a la superficie total en las secciones histológicas de diez campos con microscopía de luz (200 ×) [11].
Para la tinción de inmunofluorescencia, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y se incubaron con anti-Pan-CK (1:100), anti-α-SMA (1:100), anti-vimentina (1:100) , anti-e-cadherina (1:100), anti-CD31 (1:200) y anti-D2-40 (1:100) a 4 ° C durante la noche. Las células se incubaron a continuación con anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia para 1 h. Después del lavado, las células se montaron con medio de montaje que contiene DAPI (Vector Laboratories). Un control negativo, en el que se omitió el anticuerpo primario, se utilizó para probar la especificidad del anticuerpo. Las imágenes fueron capturados utilizando un microscopio de fluorescencia Leica confocal.
Medicamentos y Reactivos
QYHJ, una fórmula medicinal china de siete hierbas, compuesto
Scutellria barbata gratis (Ban zhi lian) ,
Heydyotis diffusa gratis (Bai Hua ella se cao),
Amorphophallus kiusianus gratis (ella Liu gu),
Coix lacryma jobi-gratis (Yi s),
Gynostemma pentaphyllum gratis (Jiao gu lan),
Ganoderma luncidum gratis (Ling Zhi) y
amomo cardamomum gratis (Bai dou kou), se preparó en la forma descrita anteriormente [11], [12], [13]. En resumen, se obtuvo un polvo QYHJ de Jiang-yin Tianjiang Pharmaceutical Co, Ltd Para asegurar la normalización y mantener la fiabilidad de interbatch QYHJ, una cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) mediante un perfil cromatográfico fue desarrollado para el control de calidad. Los cromatogramas de huellas dactilares de fórmula QYHJ se muestran en nuestro informe anterior [17]. La decocción final del QYHJ se preparó después de disolver el polvo a base de hierbas en agua destilada a la concentración requerida. La dosis diaria para conejo y ratones desnudos fue 15 g /kg y 18 g /kg, respectivamente, calculado según la siguiente-conejo humana o fórmula de transferencia de humano-ratón: Db = Da × (Rb /Ra) × (Wb /Wa ) 2/3, donde D, R y W representan la dosis, coeficiente de forma, y el peso corporal, respectivamente, y a y B representan ratón o de conejo y humano, respectivamente. CXCL1 humano recombinante, 2, y 8 se obtuvieron de PeproTech (Rocky Hill, NJ, EE.UU.). El bloqueo de anticuerpos anti-CXCR1 se obtuvo de I + amp; D Systems (Minneapolis, MN, USA). El inhibidor de CXCR2 SB 225002 se obtuvo de Enzo Life Sciences, Inc. (Farmingdale, NY, EE.UU.). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-E-cadherina, anti-vimentina, anti-α-SMA, anti-CXCL8, anti-CXCL1 (todos de Epitomics, Burlingame, CA, EE.UU.), anti-Pan citoqueratina (AE1 /AE3) (Pan-CK; Ascend Biotecnología, Guangzhou, china)., y anti-CXCL2 (Bioss, Pekín, china)
Preparación de QYHJ-que contenía suero
El suero que contienen QYHJ se preparó como se describe anteriormente [18]. Brevemente, 20 conejos hembra, que pesaban 1.800 ± 2.200 g, se dividieron al azar en dos grupos: el grupo Serum QYHJ que contienen y el grupo de control del vehículo. El grupo de suero que contienen QYHJ fue alimentado a la fuerza con intragástrico QYHJ una vez al día durante 7 días consecutivos (12,5 g /kg de peso corporal /hora), y el grupo de control de vehículo fue alimentado a la fuerza con agua desionizada intragástrico. Se recogió sangre de la arteria carótida dentro de 2 h después de la última administración y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. se centrifugó el suero de la sangre completa (4000 r /min durante 10 min) y se inactiva en un baño de agua a 56 ° durante 30 min. El suero se almacenó a -80 ° C, y los ciclos de congelación y descongelación se evitaron.
Migración y ensayo de invasión
La migración celular y la invasión se determinaron utilizando placas Transwell migración celular (Corning, Nueva York, USA) y Matrigel cámaras de invasión (membrana recubierta con Matrigel, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) como se describe anteriormente [19]. Brevemente, las células (1,0 × 10
4) se sembraron en medio libre de suero en la cámara superior y se permite que invadir hacia 10% de FCS en la cámara inferior como un quimioatrayente. Después de 12 h (para ensayos de migración sin recubrimiento matrigel) o 48 h (para ensayos de invasión con recubrimiento de Matrigel), las células que habían invadido a través de la membrana y adheridos a la cara inferior de la membrana se contaron como se describe anteriormente [16].
Análisis de Western Blot
la proteína total se extrajo de las células cultivadas, y se cuantificó usando el kit de ensayo de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Western Blot se realizó de acuerdo con nuestro informe anterior [16]. Igual cantidad de proteína de diferentes muestras se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilato 10% y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno. tampón de bloqueo, que contiene leche desnatada al 5%, se utilizó para bloquear e incubar las membranas con anticuerpos primarios. La expresión de las proteínas diana se examinó utilizando un quimioluminiscencia mejorar (ECL) Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), y el análisis cuantitativo se realizó utilizando el software ImageJ.
El aislamiento de ARN y PCR en tiempo real
ARN total fue aislado de las células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.), y transcripción inversa PCR (RT-PCR) se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Takara). Las mediciones cuantitativas de PCR en tiempo real se realizaron utilizando SYBR verde I (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ, EE.UU.). El primer secuencias de CXCL1, 2, y 8 se enumeran en la Tabla 1. GAPDH se utilizó como control interno. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron dos veces.
El medio condicionado (CM) preparación
CM de CAF y se obtuvo federaciones nacionales como se ha descrito anteriormente, con ligeras modificaciones [20]. Brevemente, las células se mantuvieron en DMEM a 37 ° C durante 48 h. Se recogió el medio condicionado de CAF o NFS. El medio acondicionado se aclaró por centrifugación, seguido de dilución 1:01 con medio definido antes de tratar las células Capan 1; el medio acondicionado estaba recién transferido sin almacenamiento.
Para obtener CM de CAF tratados con QYHJ, CAF aisladas se sembraron en frascos T25 (1 × 10
6 células) y se cultivaron en DMEM que contenía un 10% QYHJ- que contiene suero o suero de control que contienen. Veinticuatro horas más tarde, se retiró el medio y las células se lavaron dos veces con PBS. Las células se incubaron posteriormente con 5 ml de medio fresco DMEM durante 48 horas adicionales. El CM se cosechó posteriormente como se describe anteriormente.
Enzyme-Linked Immunosorbent (ELISA) de ensayo
El CXCL1 suero, 2, y 8 concentraciones se midieron usando un ELISA como se describe anteriormente [17]. La muestra de sangre se almacenó a temperatura ambiente durante 30 min, se centrifugó (12.000 xg) durante 15 min, y criopreservados a -80 ° C. Las concentraciones se midieron usando un kit de ELISA sándwich (DuoSet; R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). Para detectar la secreción de citoquinas en el medio de cultivo, las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron como se describe anteriormente. Después de 48 h, se recogieron y se almacenaron a -80 ° C hasta su posterior utilización de los medios de comunicación.
La proliferación celular ensayo
El ensayo de proliferación celular se realizó como se ha descrito anteriormente [16]. Aproximadamente 5 × 10
3 células en 0,1 ml se sembraron en pocillos duplicados de placas de 96 pocillos. Después de la incubación durante la noche, la suspensión se retira y se transformó en condiciones diferentes medios de comunicación. Posteriormente, los índices de proliferación celular se evaluaron diariamente usando el Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Molecular Technologies, Inc, Gaithersburg, MD), y la curva de crecimiento se ha elaborado de acuerdo con los valores de DO obtener de CCK-8 ensayo.
Establecimiento de modelos de xenoinjertos tumorales
se establecieron modelos de xenoinjertos tumorales como se describe anteriormente [16]. Brevemente, las células Capan1 (2 × 10
6 en 0,2 ml) se inyectaron en fase logarítmica por vía subcutánea en la axila derecha de ratones desnudos. La longitud y anchura de los tumores (en mm) se midieron usando calibradores semanal. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula (a x b
2) × 0,5, donde a y b son las dimensiones corta y larga, respectivamente. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron 1.5 cm de diámetro. Los tumores se retiraron y se pesaron. Cada grupo estaba formado por al menos seis ratones.
El análisis estadístico
Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (SD). Los análisis estadísticos se realizaron mediante análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba t de Student. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS 15.0.
Resultados
Generación de fibroblastos asociados con el cáncer (CAF) culturas
Se extrajeron los fibroblastos de las piezas de resección de dos adenocarcinomas ductales pancreáticas. Las masas tumorales se disociaron, y diversos tipos de células se separaron para obtener poblaciones de CAF. También aislado una segunda población de fibroblastos de una región no canceroso del páncreas por lo menos 2 cm desde el margen exterior del tumor en cada uno de los mismos dos pacientes. Denominamos a estas células "normales fibroblastos (NFS)." Todos los experimentos se realizaron a través de comparaciones entre CAF y las federaciones nacionales correspondientes, evitando así el sesgo debido a diferencias interindividuales. La pureza de las células de fibroblastos cultivados se verificó mediante inmunotinción usando vimentina y PDGFR-β (marcador de células mesenquimales) y E-cadherina y citoqueratina (CK) (marcador de células epiteliales). Además, D31 y D2-40 se utilizaron para excluir el origen endotelial (Figura 1A y la Figura S1). Todos los cultivos celulares se vimentina y PDGFR-β positivo y 91% a 100% E-cadherina, citoqueratina, CD31 y D2-40 negativo. En comparación con NFS, el CAF establecidos expresaron altos niveles de alfa actina de músculo liso (α-SMA), un marcador de fibroblastos activados, típicamente expresadas en CAF, pero no los fibroblastos quiescentes normales. Estas observaciones se confirmaron adicionalmente a través de análisis de transferencia Western (Figura 1B). Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que han establecido con éxito emparejado culturas CAF y NF de PDAC humano.
A. Los fibroblastos fueron extraídos de los tejidos resecados de dos adenocarcinomas ductales pancreáticas. La pureza de las células de fibroblastos cultivados se verificó a través de inmunofluorescencia para detectar Pan-CK (rojo), E-cadherina (verde), vimentina (rojo), α-SMA (rojo), PDGFR-β (rojo), CD31 (rojo) y D2-40 (rojo). Los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI (azul). controles de tejido positivo para CD31 y la inmunotinción D2-40 se han utilizado (Figura S1). El análisis de transferencia Western B. confirmó el patrón de expresión de los marcadores utilizados en A.
cáncer de páncreas células tratadas con medio condicionado de CAF-QYHJ tratados mostraron una reducción de invasión
CAF contribuyen a la proceso invasivo y metastásico en el cáncer pancreático humano [5]. En este estudio, hemos examinado la migración y la invasión efectos inductores de la CAF sobre las células de cáncer de páncreas humanos utilizando cámaras transwell con o sin recubrimiento de Matrigel. Los ensayos Transwell demostraron que el medio condicionado (CM) a partir de los CAF tratados con control exhibió una mayor capacidad para inducir la migración celular y la invasión del cáncer pancreático (Figura 2 y Figura S2). A continuación, se evaluaron los efectos de QYHJ sobre la migración celular inducida por la CAF y la invasión, el CM de QYHJ o CAF tratados con control se cosecharon y se evaluaron también los efectos de este medio sobre la migración celular y la invasión del cáncer pancreático. Hemos observado que la CM de CAF tratados con QYHJ mostraron una disminución de la migración y capacidad de invasión de promoción en comparación con la de los CAF tratados con control (Figura 2 y Figura S2), estos resultados sugieren que el tratamiento QYHJ podría suprimir la migración de células de cáncer de páncreas y la invasión a través de los CAF de orientación .
La migración celular y la capacidad de invasión de las células de cáncer de páncreas tratados con medio condicionado (CM) de CAF federaciones nacionales, tratados con Ctrl y CAF tratados con QYHJ se comparó el uso de cámaras transwell con o sin recubrimiento de Matrigel. El número de células que viajaban a través de la membrana se contaron en 10 campos bajo una lente objetivo × 20. Aumento original, × 200. Los resultados representan la media ± desviación estándar de los valores obtenidos en tres experimentos independientes. La significación estadística se calculó utilizando ANOVA. *
P
. & Lt; 0,05
QYHJ inhibe la secreción de CXCL1, 2 y 8 forman CAF
CAF estimulan directamente la proliferación de las células tumorales a través de diversos factores de crecimiento, hormonas y citocinas de una manera dependiente del contexto [5]. Anteriormente puso de manifiesto que los CAF promueven la migración y la invasión de las células Capan1 in vitro, y esta propiedad se inhibió después tratado con QYHJ. A continuación intentó identificar las moléculas potenciales que median la correlación entre los fibroblastos y las células cancerosas. Estudios previos han demostrado que los miembros de las subfamilias de quimioquinas CXC, incluyendo GRO1 (CXCL1), GRO2 (CXCL2) e IL-8 (CXCL8), se encuentran entre uno de los más altamente regulados hasta genes identificados en los CAF en comparación con las federaciones nacionales de páncreas cáncer [21]. Por lo tanto, hemos examinado la expresión de estos factores en los CAF y vinculado NFS. Hemos observado que los CAF presentan un aumento de CXCL1, 2 y 8 de ARNm y la expresión de proteínas en comparación con las federaciones nacionales. Además, se observó que el tratamiento QYHJ suprimió significativamente la expresión de CXCL1, 2 y 8 en ambas líneas celulares CAF (Figura 3A-B). ensayo de ELISA también confirmó que los CAF tratados con QYHJ secretan niveles más bajos de CXCL1, 2 y 8 en el medio (Figura 3C). Por lo tanto, estos resultados sugieren que QYHJ inhibe la expresión de CXCL1, 2 y 8 en los CAF.
A-B. CAF se trataron con QYHJ que contienen suero o suero de control que contienen de 48 h. a continuación, se recogieron las células, y la expresión de CXCL1, 2 y 8 se evaluó mediante PCR en tiempo real (A) y Western Blot (B). C. Los CAF aisladas se sembraron en frascos T25 (1 × 10
6 células) y se cultivaron en DMEM que contenía 10% de suero QYHJ que contienen o Control que contenía suero. Veinticuatro horas más tarde, se retiraron los medios, y las células se lavaron dos veces con PBS. Las células se incubaron posteriormente con 5 ml de medio DMEM fresco durante 48 horas adicionales. El medio se recogió con posterioridad y el CXCL1, se detectaron 2 y 8 concentraciones a través de ELISA. ANOVA se utilizó para determinar la significación estadística. *
P
. & Lt; 0,05
QYHJ inhibe la proliferación in vitro CAF
Estudios previos han indicado que el número de CAF en el estroma se asocia significativamente con la CAF números reducidos pobre diferenciación y el pronóstico de los cánceres [22], [23], [24], y también se observaron cuando el tumor fue tratado [11]. Por lo tanto, la hipótesis de que QYHJ afecta a la proliferación de la CAF. El ensayo de proliferación in vitro indicó que el tratamiento QYHJ inhibe la proliferación de los CAF en ambas líneas celulares (Figura 4), lo que contribuye a la secreción de quimiocinas CXC suprimida de los CAF.
Aproximadamente 5 × 10
3 en los CAF se sembraron 0,1 ml en pocillos duplicados de placas de 96 pocillos. Después de la incubación durante la noche, la suspensión se retira y se transfiere a DMEM que contiene 10% de suero QYHJ que contienen o Control que contenía suero. Los índices de proliferación celular se evaluaron diariamente utilizando el Kit-8 Recuento celular. Los resultados se presentan como la media ± SD de los valores obtenidos en tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0.05.
CXCLs aumentó la migración y la invasión de células de cáncer de páncreas humano
quimiocinas CXC se han asociado con la invasión de células de cáncer en muchos tipos de cánceres humanos [25]. Como hemos observado que CAF exhiben una mayor CXC quimiocinas expresión y secreción, se confirmó si la secreción regulada positivamente de quimiocinas CXC contribuye a la mejora de la capacidad para inducir la migración de células de cáncer de páncreas y la invasión. Hemos probado los efectos de quimioquinas CXC sobre la migración celular y la invasión Transwell usando cámaras con o sin recubrimiento de Matrigel. La adición de CXCL1 humana recombinante, 2 y 8 aumentó tanto la migración y la invasión de las células Capan 1 en los ensayos Transwell. Además, la inhibición de la señalización de quimiocinas CXC usando antagonistas del receptor significativamente bloqueado CXC la migración celular inducida por quimiocinas y la invasión (Figura 5 y la Figura S3).
migración y la invasión ensayos se realizaron en las células Capan1 tratados con vehículo, 100 /ml CXCL1, 2, y 8, o sus antognists 20 mg /ml de anticuerpo anti-CXCR1 y 400 nM SB 225002 como se indica, el uso de cámaras transwell celulares. El número de células que invadió la membrana se contó en 10 campos con la lente objetivo × 20. Aumento original, × 200. Los resultados se presentan como la media ± SD de los valores obtenidos en tres experimentos independientes. La significación estadística se calculó utilizando ANOVA. *
P Hotel & lt; 0.05.
QHYJ tumorigénesis tratamiento de inhibición y expresión de CXCL1, 2, 8 in vivo
Para confirmar aún más los efectos de la CAF en QYHJ actividad de proliferación y CXCLs la producción in vivo, se establecieron ratones modelos de xenoinjertos utilizando células Canpan1. Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos QYHJ y control, tratados con QYHJ (0,2 ml, sonda, todos los días) o solución salina normal como control, respectivamente. Hemos observado que el tratamiento QYHJ resultó en el crecimiento del tumor reducida (Figura 6A). Consistente con los resultados del análisis in vitro, QYHJ reduce la proliferación CAF en los tumores (Figura 6B). Por otra parte, IHC confirmó que los tumores tratados con QYHJ exhibieron la reducción de la expresión de CXCL1, 2, y 8 (Figura 6D). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que el tratamiento QHYJ inhibió la proliferación de la CAF y la expresión de CXCL1, 2 y 8, lo que podría reflejar los efectos anticancerígenos de QHYJ en el cáncer de páncreas.
A. Efecto de QYHJ sobre el crecimiento tumoral en un modelo de tumor subcutáneamente trasplantado. Se inyectaron células Capan1 (2 x 10
6cells en 200 ml) por vía subcutánea en la axila derecha de cada ratón desnudo /c-nu /nu BALB. El día siguiente, los ratones se trataron por vía oral con o sin QYHJ. Se midieron los volúmenes tumorales medios de (agua salina) tratado con vehículo y los tumores tratados con QYHJ. La media ± desviación estándar se determinó en cada grupo de tratamiento. Las curvas de crecimiento tumoral se muestran en el panel superior, y las fotografías de los tumores trasplantados por vía subcutánea de ambos grupos se muestran en el panel inferior. Se utilizó la prueba t de Student para determinar la significación estadística. *
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el grupo tratado con QYHJ. B. IHC tinción para vimentina y α-SMA en secciones de tumores para evaluar las actividades de proliferación de la CAF. Una flecha indica fibroblastos y la punta de flecha indica células de cáncer pancreático. Aumento original, 200 ×. CAF actividades proliferativas (derecha) se evaluaron cuantitativamente después de calcular la relación de la vimentina o área de tinción positiva para el anticuerpo α-SMA a la superficie total en cada campo, y el valor medio de diez campos por debajo de 200 × microscopía se indican. *
P Hotel & lt; 0.05. C. IHC tinción utilizando anti-CXCL1, 2, y 8 anticuerpos se realizó con secciones de tumores trasplantados. Aumento original, × 200. Las tasas positivas de CXCL1, 2, y 8 en los tumores se muestran a la derecha. Se utilizó la prueba t de Student para determinar la significación estadística. *
P Hotel & lt; 0.05.
Discusión
En este estudio se demostró que el QYHJ inhibe la invasión de células de cáncer de páncreas y metástasis por la orientación CAF, en particular la producción de CXCL1, 2 y 8. Estos hallazgos confirma aún más nuestra anterior especulación de que las células en el microambiente del tumor pueden servir como objetivos fundamentales para la medicina herbal china [11].
medicina tradicional china (MTC) se basa en una teoría única formada en la experiencia práctica solitaria plazo. Desde hace miles de años, la medicina tradicional china ha sido ampliamente practicado en China, y más del 90% de los pacientes con cáncer chinos modernos han recibido terapia de la medicina tradicional china durante el tratamiento [26]. Recientemente, TCM se ha utilizado en el exterior y está bien aceptado en muchos países, particularmente para el tratamiento de la oncología [27]. TCM se basa en el concepto de holismo, teniendo en cuenta la interrelación entre el cuerpo humano y el medio ambiente circundante en el nivel macro. A escala microscópica, consideramos la relación integral entre las células cancerosas y el microambiente. De hecho, estudios recientes han confirmado que las células tumorales no actúan de forma aislada, sino que subsisten en un microambiente rico proporcionada por los fibroblastos residentes, células inflamatorias, células endoteliales, pericitos, leucocitos, y la matriz extracelular [28]. A medida que el cáncer progresa, el microambiente que rodea se activa, coevolving través de la comunicación paracrina continua, para apoyar la carcinogénesis [29]. El cáncer de páncreas se caracteriza por una extensa respuesta del estroma llamada desmoplasia [7]. CAF son el principal tipo de células en el estroma del tumor, y la importancia de un papel para los CAF en la progresión tumoral es bien aceptado [5]. Por lo tanto, como el cáncer ya no se considera una entidad discreta se define sólo a través de los rasgos de las células cancerosas dentro del tumor, con el tiempo afecta a todo el organismo, TCM ofrece un enfoque holístico para regular la integridad de todas las funciones del cuerpo y la interacción entre los seres humanos y el el ambiente alrededor.