Extracto
Antecedentes
La angiogénesis puede jugar un papel en la patogénesis del cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC). El CXC (ELR
+) de la familia de quimiocinas son potentes promotores de la respuesta angiogénica.
Métodos
La expresión de los miembros de la familia CXC (ELR
+) (
CXCL1-3 /GRO-γ
,
CXCL8 /IL-8
,
CXCR1 /2
) fue examinado en una serie de tumores de NSCLC fresco congelado resecados. Además, la regulación epigenética de la expresión y estas quimiocinas se examinó en el epitelio bronquial normal y líneas celulares de cáncer.
Resultados
En general, la expresión de los ligandos de quimiocinas (
CXCL1, 2
,
8
) y sus receptores (
CXCR1 /2
) son objeto de regulación en las muestras tumorales en comparación con los normales, con la excepción de
CXCL3
.
CXCL8
y
CXCR1 /2
se comprobó que estaban reguladas por epigenetically modificaciones de las histonas después de la traducción. CXCL8 recombinante no estimulan el crecimiento celular, ya sea en un epitelio bronquial normal o una línea celular de carcinoma escamoso (SKMES-1). Sin embargo, se observó un aumento a las 72 horas post-tratamiento en una línea celular de adenocarcinoma.
Conclusiones
CXC (ELR
+) quimiocinas se dysregulated en el CPNM. El balance de estas quimiocinas puede ser crítica en el microambiente tumoral y requiere una aclaración adicional. Queda por ver si la orientación epigenético de estas vías es una opción terapéutica viable en el tratamiento del cáncer de pulmón
Visto:. Baird AM, Gray SG, O'Byrne KJ (2011) La epigenética se basa el Reglamento del CXC ( ELR
+) Las quimiocinas en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (1): e14593. doi: 10.1371 /journal.pone.0014593
Editor: Kelvin Chan Kwong Yuen, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 14 Junio, 2010; Aceptado: 2 Enero 2011; Publicado: 27 de enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Baird et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca educativa sin restricciones de Pfizer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. La financiación de este proyecto era proporcionar por Pfizer bajo la forma de un salario por Anne- Marie Baird. No se proporcionó financiación para los consumibles. La financiación proporcionada era una subvención-en-ayuda, y como tal, no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La angiogénesis es importante en el crecimiento y la propagación del cáncer y también influye en los cambios inflamatorios que pueden predisponer a la enfermedad [1]. El CXC (ELR
+) quimiocinas inducen la angiogénesis y pueden ser importantes en cánceres que tienen un fenotipo angiogénico como NSCLC [2].
El término quimioquinas se refiere a una familia de bajo peso molecular (8- 10 kDa) citoquinas quimiotácticas. Las quimiocinas son citocinas inducibles pequeñas, que son quimioatrayentes para los leucocitos. Las quimiocinas se clasifican por su composición de aminoácidos, la actividad funcional y las propiedades de unión al receptor y comprenden de cuatro familias sub definidos de acuerdo con los dos primeros de los cuatro residuos de cisteína conservados (a) C, (b) CC, (c) CXC y (d) CXXXC [3]. La familia de las quimiocinas CXC consiste en dos subtipos, ELR
+ y ELR
-, de acuerdo con un motivo particular, Glu-Leu-Arg (ELR) que precede a la primera residuo de cisteína [3]. CXC (ELR
+) promotores contienen un
cis
elemento que reconoce NF-kappa B, y por lo tanto puede causar que la trans-activación de quimiocinas CXC [4].
El receptor angiogénico putativo para CXCL8 y el otro CXC (ELR
+) quimioquinas CXCR2 es [5]. El bloqueo de este receptor conduce a una disminución en la angiogénesis en el cáncer de páncreas [6], y una inhibición significativa del crecimiento del tumor de melanoma humano y metástasis pulmonares experimentales en CXCR2 - /- ratones, así como una reducción en la angiogénesis [7]. Dentro del entorno del pulmón, el cáncer y el crecimiento potencial metastásico es el regulado en varios CXCR2 ratón - /- modelos [7], [8]. Sin embargo, CXCL8 se puede unir a CXCR1 y CXCL1 /CXCL8 también se puede unir DARC, aunque la unión a DARC no transducir una señal. Actualmente, los estudios con DARC sugieren que actúa por "limpieza 'hasta quimioquinas y, por lo tanto, la reducción de su capacidad de señalización. La sobreexpresión de la DARC conduce a un aumento del crecimiento del tumor, sin embargo, esto era debido a la inducción de grandes áreas necróticas dentro del tumor [9], [10].
Los receptores de quimiocinas están reguladas en las células tumorales, permitiendo que el tumor para tomar ventaja de ambientes ricos de quimioquinas, la promoción del crecimiento tumoral y la vasculatura. Además, las quimiocinas pueden reclutar macrófagos, que detectan el ambiente hipóxico dentro del tumor y posteriormente secretar factores pro-angiogénicos [11], [12]. Inicialmente se pensó quimiocinas para jugar un papel en la atracción de leucocitos específicos de un sitio de la lesión; sin embargo, ahora se ha demostrado que están involucrados en la transformación neoplásica de una célula, la promoción de la angiogénesis, la expansión clonal tumor y los cambios en el ECM y, en particular metástasis de órganos específicos mediar en el cáncer [13]. receptor pares ligando específicos dictan los patrones de metástasis de mama y el cáncer de pulmón [14]. En las metástasis del cáncer de mama al pulmón, CXCL1 era parte de una firma genética que también incluyó VCAM1 y MMP1 [15]. Un estudio reciente encontró que CXCL8 derivada del tumor actuó como un atrayente para las células tumorales circulantes para volver al tumor original, dando lugar a un fenotipo más agresivo del tumor [16].
Una variedad de quimiocinas CXC se han detectado en neoplásica tejidos como los productos de las células tumorales o elementos del estroma [12]. Por ejemplo, tumor infiltración de células inflamatorias eleva los niveles de CXCL8 en las células broncoalveolar, junto con sus dos receptores [17]. Una fuerte evidencia sugiere que CXC (ELR
+) quimiocinas tienen un papel en la promoción del cáncer, ya que pueden promover el crecimiento y la supervivencia de las células del cáncer [18].
El crecimiento y la progresión del cáncer es dependiente de la angiogénesis y CXCL8 se ha demostrado que desempeñan un papel en su potencial angiogénico y carcinogénico. En el cáncer de células renales los niveles de CXCL1, CXCL3 y CXCL8 fueron elevados en comparación con los controles y, en receptor negativo (CXCR2 - /-) ratones hubo una reducción correspondiente en el crecimiento del tumor [19]. Los estudios en modelos tumorales de melanoma apoyan el papel de CXCL1, CXCL2, y CXCL3 en la mediación de la angiogénesis tumoral y los niveles de los tres quimiocinas son altamente expresado en los tumores de melanoma. La transfección de CXCL1-3 en células no tumorigénicas inmortalizadas les dio la capacidad para formar tumores [20], [21]. CXCL8 es uno de los miembros más estudiados de la familia CXC (ELR
+), en particular en el cáncer de pulmón. CXCL8 fue identificado en una expresión genética que era predicativo de mal pronóstico en pacientes con cáncer en estadio I de pulmón [22], mientras que los niveles de CXCL8 se incrementan significativamente en ambos derrames pleurales malignos [23] y NSCLC [24], donde los niveles aumentan con etapa [25] y se correlaciona con la supervivencia del paciente /recaída [26]
las quimiocinas se encuentra dentro se cree que el microambiente tumoral para jugar al menos cinco funciones en el desarrollo de tumores y metástasis.; (A) control de infiltrado de leucocitos, (b) modificar la respuesta inmune del tumor, (c) regular la angiogénesis, (d) operar como factores de crecimiento y de supervivencia, y (e) dirigir el movimiento de las células tumorales a sí mismos [27]. Las CXC (ELR
+) ligandos y receptores son particularmente importantes en la mediación de tumor de NSCLC angiogénesis asociada [28] y el órgano metástasis específicos [13], [14]. ligandos CXCR2 también han sido implicados en la progresión del tumor de NSCLC a través de caracol, los altos niveles de que se correlacionan con una menor supervivencia [29].
regulación epigenética de la expresión génica aberrante es un evento frecuente en NSCLC [30], [31] . La orientación de estos mecanismos de regulación epigenética en NSCLC es un área activa de investigación farmacéutica. Hemos tratado de examinar la expresión de las quimiocinas CXC (ELR
+) y sus receptores en una serie de muestras de tumor primario de CPCNP en un panel adicional de líneas celulares de cáncer, y para examinar directamente si la epigenética juega un papel en la regulación de estos genes en esta enfermedad. Nuestros resultados indican que la expresión de estas quimiocinas y sus receptores son frecuentemente desregulado en CPNM, siendo regulada a través de forma directa y en directo por mecanismos epigenéticos (modificaciones de las histonas después de la traducción y la metilación del ADN CpG, respectivamente) y puede ser un buen candidato objetivos para la terapia epigenética en el tratamiento de este tipo de cáncer.
Métodos
las líneas celulares
el A549 (adenocarcinoma), SKMES-1 (carcinoma de células escamosas), H460, H647 y H1299 (grande carcinoma de células) y BEAS-2B (transformado bronchoepithelial normales) las líneas celulares se adquirieron de la ATCC (LGC Promochem, Teddington, Reino Unido). HBEC líneas celulares [32] fueron un regalo del profesor John D. Minna (Hamon Centro de Investigación Terapéutica de Oncología, UTSoutwestern, Dallas, TX, EE.UU.). Todos los reactivos de cultivo celular fueron adquiridos de Lonza (Walkersville, MD, EE.UU.). Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 en los siguientes medios; A549 - F-12 (Ham) complementado con 10% (v /v) FBS, penicilina estreptomicina (500 U /ml) y 2 mM L-glutamina. BEAS-2B también se mantuvieron en F-12 (Ham) medio sin la adición de FBS. SKMES-1 - EMEM con la adición de 10% (v /v) FBS, penicilina estreptomicina (500 U /ml), 2 mM L-glutamina y 0,1 M aminoácidos no esenciales. Todas las grandes líneas de carcinoma de células se mantuvieron en RPMI con 10% de FBS y penicilina estreptomicina (500 U /ml). líneas HBEC se mantuvieron en queratinocitos medio libre de suero (SFM), con L-glutamina (GIBCO Invitrogen, Paisley, Escocia) y suplementado con 2,5 mg de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (regf), y 25 g bovina extracto de pituitaria (GIBCO Invitrogen) .
muestras
tumor primario
Una serie de 37 muestras de tumores (14 adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas 23) fueron tomadas de pacientes con NSCLC en estadio temprano en el hospital St. James, Dublín. el tejido normal correspondiente fue tomada en paralelo para cada paciente y se evaluaron las muestras por un patólogo inmediatamente después de la disección.
Reactivos
tricostatina A (TSA) se adquirió de Calbiochem (San Diego, CA, EE.UU. ) y se disolvió en DMSO a una concentración de 250 mg /mL. Los cultivos de células fueron tratados durante un período de 16 horas, a una concentración final de 250 ng /ml.
El fenilbutirato (PB) (tributirato ™) fue un regalo de la Triple Corona Latina, Perkasie, PA, EE.UU.. Los cultivos de células se trataron a una concentración final de 10 mM durante 16 h.
5-Aza-2 'desoxicitidina (DAC) se adquirió de Merck (Darmstadt, Alemania) y se disolvió en metanol. Los cultivos celulares se trataron con DAC (concentración final - 1 M). durante 48 h con DAC y los medios reemplazan cada 24 h
CXCL8 humano recombinante se adquirió de PromoKine (PromoCell GmbH, Heidelberg, Alemania) y se reconstituyó en estéril agua destilada.
SB 225002 se adquirió de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EE.UU.) y se disolvieron en DMSO a una concentración de 2,2 mM. Las líneas celulares se trataron durante una hora antes de la adición de CXCL8, a una concentración de 0,022 M.
Total aislamiento de ARN y la amplificación RT-PCR
El ARN total se extrajo usando TRI Reagent® ( molecular Research Center, Montgomery Road, OH, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Antes de la primera síntesis de ADNc, 10 g de ARN total se pre-tratados por digestión con DNasa RQ1 (Promega, Madison, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. cDNA se generó usando Superíndice III (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE.UU.) y Oligo dT (20) cebadores (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Las líneas celulares se examinaron para la expresión de
CXCL1-3
,
CXCL8
,
CXCR1 /2 Opiniones y
Beta-actina fotos: por RT-PCR, utilizando cebadores y temperaturas de recocido describen en la Tabla 1. las condiciones de los ciclos de PCR consistió en -95 ° C durante 5 min seguido de 35 ciclos de 1 min a 94 ° C, 1 min a la temperatura objetivo gen de recocido y 1 min a 72 ° C con una extensión final a 72 ° C durante 10 min.
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los productos a electroforesis en un gel de agarosa al 1%. la cuantificación del producto se realizó usando TINA 2.09c (Raytest, Isotopenmeßgeräte GmbH, Straubenhardt, Alemania) software de densitometría. La expresión de mRNA se normalizó a
Beta-actina
controles, y se expresa como una proporción de la expresión del ARNm diana:.
Beta-actina
expresión
inmunoprecipitación de cromatina (X- chIP)
cromatina inmunoprecipitación se realizó como sigue: Después de los tratamientos, las células se fijaron con formaldehído (concentración final 1%), se suspendieron en tampón de lisis SDS (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) y se sometió a ultrasonidos hasta que el ADN era fragmentado en longitudes de entre 200-1000 pb. Alícuotas de este ADN cizallado se inmunoprecipitaron posteriormente usando el OneDay ChIP Kit ™ (Diagenode, Lieja, Bélgica) según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos utilizados para la inmunoprecipitación fueron los siguientes: pan acetil-histona H3 (Millipore Cat#06-599), H4 pan acetil histona (Millipore Cat#06-598), H3 histona acetil-(K9 /14ac) (Cat#Diagenode pAb -ACHBHS-044), H3 histona acetil-(K9ac) (Cat#Diagenode pAB-ACHAHS-044), acetil fosfo - histona H3 (K9pS10) (Sigma Cat#H0788), di-H3 histona metil (K9Me2) (Sigma Cat#D5567), di metil histona H3 (K4Me2) (Sigma Cat#D5692) y H3 histona metil-(K4Me) (Sigma Cat#M4819). Un control sin anticuerpo se incluyó la prueba de no unión específica
.
Los cebadores usados para estudiar las regiones promotoras de
CXCL8
y
CXCR1 /2 fotos: por chip fueron diseñados a partir de la conocida 5 'UTRs contenidos dentro de sus secuencias de nucleótidos. condiciones de los ciclos de RT-PCR fueron los mismos que los descritos anteriormente. Los cebadores y las temperaturas de recocido para la viruta se presentan en la Tabla 2.
ELISA
La concentración de CXCL8 se midió en medios acondicionados utilizando un sistemas de desarrollo DuoSet® ELISA (R & amp; D systems , Minneapolis, MN, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con una excepción; la solución de sustrato utilizado se hizo en tampón citrato fosfato (que contiene ácido cítrico y disódico dodecahidrato ortofosfato de hidrógeno, pH 5,0), 10 mg de 1, dihidrocloruro de 2-fenilendiamina (OPD) y 18 l de 1 MH
2O
2 .
CXCL2 se cuantificó usando un kit de desarrollo de ELISA comprado a Strathmann Biotec (Hamburgo, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
ensayos de proliferación celular
la proliferación celular se midió utilizando una proliferación celular ELISA, BrdU (Roche Diagnostics Ltd., Sussex, UK). Brevemente, las células se sembraron a 5 x 10
3 /pocillo en una placa de 96 pocillos y se adhirió durante la noche. Posteriormente se retiró el medio completo y las células se lavaron con 100 l de PBS. se añadió suero medios empobrecido (0.5% de FBS) a sólo las células de cáncer de pulmón, ya que este imita más de cerca las condiciones fisiológicas. Después de la incubación durante la noche, las células se trataron durante 24, 48 o 72 h con CXCL8 humano recombinante a diferentes concentraciones (0,1 a 100 ng /ml). Los estudios de inhibición se llevaron a cabo por las células pre-tratamiento con 0,022 M SB225002 para 1 h antes de la adición de CXCL8. Se midió la absorbancia en un lector de placas a 450 nm con una longitud de onda de referencia fijado a 690 nm y pozos en blanco y no tratados fueron utilizados para los propósitos de normalización. Las células no tratadas se establecieron como el 100%, y los tratamientos CXCL8 evaluados en relación con esto.
El análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± SEM (error estándar de la media). El análisis estadístico se realizó con INSTAT (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.) utilizando un emparejado de Student una cola
t-test
. Las diferencias se consideraron significativas cuando p & lt; 0,05
Resultados
Expresión de
CXCL1-3
,
CXCL8
y
CXCR1 /2
en el cáncer de pulmón primario muestras de tumor
Para evaluar la expresión de un número de CXC (ELR
+) miembros de la familia en un panel de muestras de pacientes /tumorales normales emparejados de la Etapa I y II los pacientes, RT- se realizó la PCR (Figura 1A), y se resume en la Figura 1B. El análisis densitométrico de la RT-PCR reveló una disminución significativa en la expresión de
CXCL1
,
CXCL2
(p & lt; 0,01) y el
CXCR1
receptor (p & lt; 0,05) en el CPNM muestras tumorales en comparación con el normal (Figura 1C)
a) Los niveles de
CXCL1 CD -.
3
,
CXCL8
y
CXCR1 /2
fueron examinados por RT-PCR en un panel de líneas de NSCLC (adenocarcinoma (n = 14), carcinoma de células escamosas (n = 23)) muestras de pacientes. se muestran imágenes representativas de las muestras regulados hacia arriba y abajo.
Beta actina
niveles se utilizaron con fines de normalización. B) Un resumen de los cambios en la expresión de las quimiocinas CXC diferentes (ELR
+) y sus receptores en un panel de muestras de tumor /normal emparejados de pacientes con CPNM. C) En general densitometría análisis de muestras de tumor /normal emparejados de pacientes con CPNM. Los datos se grafica como media ± error estándar de la media (n = 37). (N - Normal, T - tumor) guía empresas
Expresión de
CXCL1-3
,
CXCL8
y
CXCR1 /2
en una. panel de líneas celulares normales y el cáncer de pulmón
Utilizando RT-PCR, las quimiocinas se examinaron en un panel de líneas celulares normales y de NSCLC (Figura 2). Todas las líneas celulares ensayadas expresaron niveles variables de
CXCL1-3
y
CXCL8
, con una mayor expresión basal observada en las líneas de NSCLC. Sin embargo, sólida expresión de ambos receptores (
CXCR1 /2
) se detectó en las líneas de células normales (HBEC3-5).
El panel incluyó A549 (adenocarcinoma), SKMES-1 (escamosas carcinoma de células), líneas de células H460, H647 y H1299 (carcinoma de células grandes), BEAS-2B (SV40 transformado bronchoepithelial normal) y HBEC (líneas epiteliales bronquiales normales de células inmortalizadas en ausencia de oncoproteínas virales).
Beta actina
se incluye para validar la eficacia de carga. (M - marcador de ADN de tamaño, -ve - Negativo control de RT-PCR).
acetilación de histonas está implicado en la regulación de
CXCL8
y
CXCR1 /2
expresión
Uso del inhibidor de la histona deacetilasa (HDACi), tricostatina a (TSA), una inducción de
CXCL8
y
CXCR1 /2
tanto en el normal (HBEC4) y las líneas celulares de cáncer de pulmón (A549 y SKMES-1), con una disminución concomitante de
CXCL1-3 gratis (SKMES-1, p & lt; 0,05) se observó (Figura 3A). La inducción de
CXCL8
fue significativa en HBEC4 y SKMES-1 (p & lt; 0,05), así como el aumento de la
CXCR1
y
CXCR2
tanto en la célula de cáncer de pulmón líneas (A549 - P & lt; 0,05, SKMES-1 - p & lt; 0,01) y
CXCR1
en HBEC4 (p & lt; 0,05) (Figura 3B). La reactivación de la expresión de estos receptores en las líneas celulares de NSCLC indicaría que estos genes están regulados epigenetically en el nivel de acetilación de histonas. El tratamiento de líneas celulares con un inhibidor adicional de histona desacetilasa, fenilbutirato (PB), también dio lugar a una reactivación de
CXCR1 /2
(datos no presentados), lo que indica que los resultados son HDACi específico. Se seleccionaron dos quimiocinas, CXCL2 y CXCL8, para la determinación de la expresión de proteínas por ELISA. El patrón observado refleja la observada en el nivel de mRNA en SKMES-1, con una disminución en CXCL2 y un aumento de CXCL8 con TSA tratamiento (p & lt; 0,05) (Figura 3C). Sin embargo, no hubo ningún cambio significativo en los niveles de proteína, ya sea en A549 o HBEC4 entre basal y las células TSA tratados (datos no mostrados).
A) El efecto del tratamiento TSA (250 ng /mL para 16 h) en la expresión de
CXCL1 CD -
3
,
CXCL8
y
CXCR1 /2
. B) Análisis de Densitometría de expresión en tratados frente a las muestras sin tratar cuando se normalizaron a
beta actina
. Los datos se grafica como media ± error estándar de la media (n = 3). C) El tratamiento con TSA también afecta a la producción de CXCL2 y CXCL8 a nivel de proteínas en las células SKMES-1. Las quimiocinas se cuantificaron en medio condicionado retiraron del cultivo después de la exposición a TSA (250 ng /mL para 16 h). Los datos se grafica como media ± error estándar de la media (n = 3). (UT - no se trata, la TSA - tricostatina A).
Reglamento de
CXCL8
y
CXCR1 /2
se produce a través de la cromatina remodelación directa
para confirmar que los efectos observados para HDACi se debieron al aumento de hyperacetylation histonas en los promotores de la
CXCL8
y
CXCR1 /2
genes, se llevó a cabo la inmunoprecipitación de la cromatina (cHIP), el análisis del individuo promotores de células A549 tratadas con TSA. Como puede verse en la Figura 4, el tratamiento con TSA resultados en un aumento de la cantidad de producto PCR para
CXCL8
y
CXCR1 /2
indicando mejorada hyperacetylation histona alrededor de los promotores de estos genes. Se demuestra que la lisina 9 y 14 son lisina hyperacetylated en esta región después del tratamiento con TSA. Este experimento demuestra claramente que la remodelación de la cromatina está directamente involucrado con la activación de CXCL8 gratis (Figura 4A), gen
CXCR1 gratis (Figura 4B) y
CXCR2 gratis (Figura 4C) expresión. Además, también se observó un aumento de la histona H3 lisina 4 tri-metilación (H3K4me3) en el
promotor CXCR1
(datos no mostrados) y la fosforilación de la serina 10 (H3K9pS10) en el
CXCL8
promotor. Un aumento en diemethylation H3K4 (H3K4me2) se detectó con una disminución simultánea en dimethylation H3K9 (H3K9me2) en la región promotora. Estas modificaciones se han asociado con la activación de la transcripción y de respuesta temprana genes, respectivamente, y añadir resistencia adicional a la evidencia de que estos genes están regulados dinámicamente por modificaciones pos-traducción de histonas.
El chip de ensayo demuestra que el tratamiento TSA se traduce en un aumento de la acetilación de la histona H3 y H4. Las células A549 se cultivaron en presencia o ausencia de TSA (250 ng /ml) durante un período de 16 h. Posteriormente, un chip de ensayo se realizó utilizando los siguientes anticuerpos; pan acetilado histona H3 (Ac H3) y H4 (Ac H4), histona H3 acetilada en la lisina 9 y 14 (H3K9 /K14Ac), histona H3 acetilada en la lisina 9 (H3K9ac), histona H3 acetilada en la lisina 9 y fosforilada en la serina 10 (H3K9pS10), la histona H3 en la lisina marcador dimetylation 9 (H3K9me2), marcador dimetylation en la lisina 4 (H3K4me2) y el marcador de la metilación en la lisina 4 (H3K4me). El estado de la cromatina en la región promotora de (A)
CXCL8
, (B)
CXCR1
y (C)
CXCR2
se muestra. ADN de entrada sirve como control positivo recomendado por el fabricante (Diagenode). Un control sin anticuerpo se incluyó para poner a prueba para el transporte no específica de ADN con histonas. (M - tamaño de escalera de ADN) guía empresas
La metilación no está directamente implicada en la regulación del CXC (ELR
+)
familia
Tras el tratamiento de las células con un ADN metiltransferasa. inhibidor (DAC), los efectos sobre CXC expresión familia (ELR +) se examinaron mediante RT-PCR (Figura 5). Se observó en la línea celular HBEC4 y no en todas las líneas celulares de cáncer (Figura 5B); Una reducción significativa de
CXCL3 gratis (0,01 p & lt).
CXCL8
expresión se indujo significativamente en dos de las tres líneas celulares (HBEC4 /SKMES-1 - p & lt; 0,05, Figura 5B). Los dos receptores
CXCR1
y
CXCR2
fueron significativamente inducida por el CAD en HBEC4 (p & lt; 0,01) (Figura 5 A, B). DAC demostró la capacidad de reactivar
CXCR1
pero no
CXCR2
expresión en SKMES-1 (p & lt; 0,01) (Figura 5A, B). DAC podría inducir
CXCR2
pero no
CXCR1
en el A549 (p & lt; 0,05) (Figura 5 A, B). Si bien estos datos sugiere que la metilación del ADN CpG está involucrado en la regulación de la expresión de los receptores de CXC y CXCL8, una búsqueda de la biblioteca del genoma UCSC (http://genome.ucsc.edu/) reveló un escaso número de residuos de CpG en las regiones promotoras de estos tres genes. Por lo tanto, creemos que un cambio en los niveles de expresión de esta familia quizás debido a un efecto secundario causado por el tratamiento del CAD, tales como la regulación de factores de transcripción específicos.
A) El efecto de 5-aza- 2'deoxycytidine (DAC) de tratamiento sobre la expresión de
CXCL1 CD -
3
,
CXCL8
y
CXCR1 /2
. Las células se cultivaron en 1 M DAC durante 48 h con los medios y el fármaco reemplazados cada 24 h. Expresión cambios se midieron utilizando RT-PCR con Beta-actina utilizado como control interno para los propósitos de cuantificación. B) Análisis de Densitometría de expresión en tratados frente a las muestras sin tratar cuando se normalizaron a
beta actina
. Los datos se grafica como media ± error estándar de la media. (N = 3). (DAC - 5-aza-2'deoxycitidine) guía empresas
La proliferación celular de SKMES-1 se reduce en presencia de CXCL8 recombinante, mientras que el aumento en el A549
Cuando se trata con varias. concentraciones de CXCL8 recombinante (0,1 a 100 ng /ml) durante un período de 24 a 72 h, hubo una tendencia a una disminución en la proliferación en la línea celular HBEC relación con el control sin tratar (datos no mostrados). tratamiento CXCL8 (100 ng /mL y 10 ng /ml) provocó un aumento en la proliferación de la línea celular A549 (p & lt; 0,01 a 100 ng /ml, p & lt; 0,05 a 10 ng /ml) a solamente 72 h post-tratamiento (Figura 6A). Sin embargo, hubo una disminución significativa en la proliferación a las 24 h post-tratamiento en SKMES-1 (Figura 6B) en todas las concentraciones ensayadas (p & lt; 0,01, 100 ng /ml y 10 ng /ml; p & lt; 0,05 1 ng /ml y 10 ng /ml), pero no en cualquier otro punto de tiempo (datos no presentados). Para determinar si el efecto proliferativo en ambas de estas líneas celulares fue específicamente debido al tratamiento CXCL8, se llevó a cabo un enfoque CXCR2 neutralizante. Las líneas celulares se trataron con SB 225002 en un IC publicado previamente
50 valor de 22 nM [33] durante una hora antes de la adición de CXCL8 a 100 ng /ml durante 72 h (A549) y 24 h (SKMES-1 ) (Figura 6C). El bloqueo del receptor CXCR2 niega el efecto proliferativo en tanto SKMES-1 líneas celulares en comparación con el tratamiento solo CXCL8 A549 y.
proliferación A) de las células se examinó mediante ensayo de BrdU después de 24 a 72 h de tratamiento con CXCL8 en A549 ( 72 h post-tratamiento) y SKMES-1 (24 h post-tratamiento) líneas celulares. Sólo los puntos de tiempo con datos significativos se muestran. Los datos se representan como porcentaje del control sin tratar (UT), que se establece en 100% y se expresan como media ± SEM. (N = 3) (ε p & lt; 0,01 - tratamiento CXCL8
vs
UT, ψ p & lt;.. 0.05 - tratamiento CXCL8
vs
UT) B) Las líneas celulares fueron tratados con una CXCR2 selectiva antagonista (0.022μM) durante 1 h antes de la adición de CXCL8 y se cultivaron durante un período de 24 (SKMES-1) o 72 h (A549). Los datos se representan como porcentaje del control sin tratar (UT), que se establece en 100% y se expresan como media ± SEM. (N = 3).
Discusión
La familia de las quimiocinas CXC (ELR
+), una familia pro-angiogénico potente, se encontró que estaba regulada epigenetically tanto en NSCLC y las líneas de células epiteliales bronquiales normales a nivel de ambas histonas modificaciones post-traduccionales.
En un panel de muestras normales /tumorales emparejados, las quimiocinas y receptores muestran ningún patrón de expresión alterada entre el adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas muestras, con la excepción de
CXCL3
(valor medio elevado en el carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma reducido). Los mayores niveles de CXCL8 se han detectado por IHC en muestras de tejido de cáncer de pulmón en comparación con el normal [34], y en nuestros niveles muestras de
CXCL8
ARNm fueron elevados en el 37,8% (14/37) muestras. Aunque los valores de densitometría una media global (n = 14 adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas n = 23) indican una reducción de las quimiocinas en las muestras tumorales (Figura 1C), esto no fue cierto para cada muestra individual (Figura 1 A). Debido a la heterogeneidad de las muestras, es difícil hacer una conclusión definitiva sobre la base de estos resultados. Hay que señalar sin embargo, que la expresión de muchas de las quimiocinas se encontraron con más frecuencia para ser downregulated en los tumores de NSCLC como sigue
CXCL1
(64,9%, p & lt; 0,01),
CXCL2
( 81,1%, p & lt; 0,01),
CXCL3 gratis (59,5%) (Figura 1B). Además, los niveles de
CXCR1
también resultaron ser significativamente reducida en los tumores de NSCLC (35,2%, p & lt; 0,05).
En un panel de líneas celulares de cáncer tratados con HDACi había una disminución de la
CXCL1-3
con un aumento concomitante de
CXCL8
y los receptores
CXCR1
y
2 gratis (Figura 3B). TSA previamente se ha demostrado que un máximo de regular CXCL8 en el pulmón [35] y las líneas celulares de cáncer de mama [36]. La reactivación de estos receptores en las líneas celulares de cáncer de pulmón indicaría que están bajo la regulación epigenética en el nivel de modificación de histona. El dogma general asociada con HDACi es que funcionan para inducir la expresión de genes. Sin embargo, en este estudio, la TSA causado tanto una regulación hacia arriba y abajo de las quimiocinas, un efecto observado por otros en otros estudios. Por ejemplo, HDACi se ha demostrado que regular a la baja Wilms gen del tumor 1 (Wt1) [37] y EGFR [38]. La limitada disponibilidad de factores de transcripción específicos puede dar lugar a sólo un cierto número de genes regulados. Como tal, la activación de
CXCL8
puede conducir a la regulación a la baja a
CXCL1-3
, ya sea a través de un interruptor molecular o a través de la valoración de los factores de transcripción lejos de las regiones promotoras de estos genes. Los resultados indican que la TSA chip actúa directamente por la remodelación de la región promotora del
CXCL8 Opiniones y
CXCR1 /2
genes (Figura 4). Nuestros resultados muestran que ChIP histonas H3 y H4 se convierten hyperacetylated en estos promotores de genes, que implica lisinas 9 y 14 de la histona H3, y lisinas 5, 8, 12 y 16 de la histona H4. Observamos un fuerte aumento de los niveles de la histona H3 lisina 4 (dimethylation H3K4me2) después de la activación de la transcripción a través de HDACi, y también se observa una pérdida de la histona lisina 4 monometilación (H3K4me), después de la activación de CXCL8 /CXCR1 /CXCR2. De acuerdo con la literatura actual, se observa la presencia de una marca represiva H3K9me2 en el promotor SIGP antes de la activación a través de HDACi, y los niveles de esta disminución modificación de las histonas después de la activación [39], [40]. Estos resultados verifican que HDACi causa provoca remodelación de la cromatina a través de modificaciones de las histonas después de la traducción en los alrededores de la región promotora de los genes examinados indica que es elemento activo en la regulación de estas quimiocinas y sus receptores.
ADN CpG metilación es también un componente importante en la regulación epigenética de la expresión génica. ADN hypermethylated se encuentra a menudo en las regiones promotoras de genes supresores de tumores en los cánceres, en particular en el cáncer de pulmón [30]. Los tratamientos con el DNMTi DAC reactivaron la expresión de
CXCR1 Hoteles en la línea A549 (Figura 5B) celular y
CXCR2 Hoteles en SKMES-1 (Figura 5B).