Extracto
Meprin-α es una metaloproteasa sobreexpresados en las células cancerosas, lo que lleva a la acumulación de esta proteasa en un subconjunto de tumores de colon. El impacto de aumento de los niveles meprin-a en la progresión del tumor no se conoce. Investigamos el efecto de esta proteasa sobre la migración celular y la angiogénesis
in vitro
y estudiado la expresión de meprin-α mRNA, la proteína y la actividad proteolítica en los tumores primarios en etapas progresivas y en las metástasis hepáticas de pacientes con cáncer colorrectal, así como la actividad inhibitoria frente a meprin-α en el suero de paciente con cáncer en comparación con los controles sanos. Se encontró que el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) - inducida respuesta migratoria de las células epiteliales meprin transfectadas se incrementó en comparación con las células de tipo salvaje en presencia de plasminógeno, y que la respuesta angiogénica en explantes de aorta de rata de órganos cultivados fue realzada en el presencia de exógena humana meprin-α. En los pacientes, meprin-α mRNA se expresa en adenomas de colon, tumores primarios de la UICC (Unión Internacional Contra el Cáncer) en estadio I, II, III y IV, así como en las metástasis hepáticas. Por el contrario, la proteína correspondiente acumula sólo en tumores primarios y metástasis en el hígado, pero no en adenomas. Sin embargo, las metástasis hepáticas carecían de actividad meprin-α a pesar de aumento de la expresión de la proteína correspondiente, que se correlaciona con la activación de zimógeno ineficiente. Los sueros de pacientes con cáncer exhibió reduce la inhibición meprin-α en comparación con controles sanos. En conclusión, la actividad meprin-α se regula de manera diferente en los tumores primarios y metástasis, lo que lleva a una alta actividad proteolítica en tumores primarios y baja actividad en las metástasis hepáticas. En virtud de su pro-migratoria y la actividad pro-angiogénicos, meprin-α puede promover la progresión tumoral en el cáncer colorrectal
Visto:. Lottaz D, CA Maurer, Noël A, Blacher S, M Huguenin, Nievergelt A, et al. (2011) Actividad mejorada de Meprin-α, un Pro-migratorias y pro-angiogénicos proteasa, en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (11): e26450. doi: 10.1371 /journal.pone.0026450
Editor: Cuelgue Thi Thu Nguyen, Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Septiembre, 2010; Aceptado: 27 de septiembre de 2011; Publicado: 11 de noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Lottaz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Suiza (www.snf.ch, otorgar#3100A0-100772 a EES), la Liga de cáncer de Berna (www.bernischekrebsliga.ch, conceder a DL) y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de, DFG BE 4086 /1-1 a CB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
concertadas eventos proteolíticas extracelulares pueden promover la progresión tumoral mediante la interrupción de las barreras físicas tales como la membrana basal y de la transformación de la matriz, los factores de crecimiento y citocinas extracelulares en el estroma del tumor. Las proteasas afectan a la adhesión celular y el crecimiento celular, así como la migración celular individual y colectiva [1], [2]. Los profundos efectos de proteasas son controlados por la regulación de la actividad de la proteasa en múltiples niveles, incluyendo los niveles de expresión, la activación de las formas de zimógeno, inhibidor de los niveles, y la inactivación.
previamente identificados meprin-α, una proteasa metzincin de la astacina familia [3], como un nuevo componente de la red de la proteasa en el cáncer colorrectal [4]. Existen dos isoformas homólogas de meprin: meprin-α, codificadas por
MEP1A
en el cromosoma 6, y meprin-β, codificadas por
MEP1B
en el cromosoma 18 [5]. Meprin-α y β-meprin se co-expresan en el intestino delgado, mientras que sólo meprin-α se expresa en el colon [6]. Meprin-β se acumula en la superficie celular apical de los enterocitos en el intestino delgado, mientras que meprin-α es secretada a menos que se retiene en la superficie celular a través de asociación no covalente con meprin-β [6]. Las cadenas de polipéptidos individuales no son estables, ambas isoformas se forman los complejos de proteínas de dímeros meprin-β, meprin-a y tetrámeros meprin-ß, o complejos multiméricos de hasta diez subunidades meprin-α [7], [8]. Meprin-α se expresa en células epiteliales de la mucosa del colon sano, así como en el cáncer colorrectal [6]. Sin embargo, en contraste con las células epiteliales intestinales normales, que liberan la proteasa en la luz del intestino, las células cancerosas secretan la proteasa en una forma no polarizada, que conduce a su acumulación y la activación en el estroma del tumor [4]. escinde meprin-a una gama de diferentes sustratos
in vitro
[9], incluidos los componentes de la matriz extracelular de las membranas basales [9], [10] pero algunos sustratos han sido descritos
in vivo
[ ,,,0],11], [12], [13], [14], [15]. Se describen tres inhibidores endógenos meprin, lectina de unión a manano (MBL) [16], fetuina-A y cistatina C [17].
Meprin-α se secreta de las células epiteliales como un zimógeno [18].
In vitro
, el propéptido se puede eliminar usando tripsina, produciendo la enzima activa. Tripsina por lo tanto puede activar meprin-α en el intestino lumen
in vivo
. Un sistema de activación alternativa ha sido identificado en co-cultivos de la línea celular de carcinoma de colon Caco-2 y fibroblastos intestinales. Derivado de fibroblastos de tipo activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) convierte el plasminógeno en plasmina, que a su vez genera activo meprin-α [19]. En la piel de la peptidasa relacionados calicreína-5 podría ser identificado como un promeprin-α la enzima de conversión [20].
Aquí nos proporcionan evidencia de una actividad pro-angiogénico y pro-migratoria de meprin-α e investigamos la expresión , la activación y la inhibición de esta proteasa en tumores primarios, metástasis de hígado y el torrente sanguíneo en pacientes con cáncer colorrectal. Nuestros hallazgos muestran un patrón complejo de la regulación, que está de acuerdo con la proteasa estar implicados en la propagación de las células cancerosas de sitio primario.
Resultados
Meprin-α promueve la migración celular y la angiogénesis
in vitro
el efecto de meprin-α sobre la migración celular se investigó mediante la respuesta de dispersión bien caracterizado de células Madin-Darby de riñón canino (MDCK) en respuesta al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF ) [21]. La respuesta de las células meprin transfectadas y células MDCK parentales se registró utilizando videomicroscopy de lapso de tiempo y se cuantificó como se ha descrito anteriormente (Fig. 1A) [22]. Se comparó la migración de las células MDCK de los padres con células MDCK transfectadas con cualquiera de meprin-α solo, meprin-β solo, o co-transfectadas con ambos meprin-α y β-meprin. células MDCK parentales y meprin transfectadas no tratadas no migran y crecen como grupo de células que eventualmente forman una monocapa de células. A favor de la respuesta migratoria fue inducida por la adición de HGF. células meprin transfectadas y control de MDCK migraron de manera similar en presencia de HGF solo. Sólo después de la adición de plasminógeno como fuente para generar plasmina, que a su vez activa meprin-α [19], la velocidad de migración de las células co-transfectadas /ß meprin-alfa se incrementó en aproximadamente un 50% en comparación con células de tipo salvaje. Esta diferencia fue abolida por la adición del inhibidor de la actinonina meprin. En particular, la inmovilización de meprin-α a la superficie celular a través de meprin-β es esencial para mejorar esta respuesta pro-migratoria en presencia de HGF y del plasminógeno, como células MDCK transfectadas con cualquiera de meprin-α o meprin-β solo migrado de manera similar a los padres las células.
MDCK parental de tipo salvaje células (a) (en peso, columnas abiertas) y las células MDCK co-transfectadas con meprin-α y β-meprin (αβ, el panel izquierdo, lleno de columnas negras) o transfectadas con ya sea meprin-α (α) o meprin-β (β) solo (panel de la derecha, lleno de columnas grises) se cultivaron en placas de laminina 1 recubiertas con y se expuso a HGF (20 nM) para inducir la migración en ausencia o presencia de plasminógeno como indicado. la migración inducida por HGF fue rastreado durante 3-4 h usando videomicroscopy. Se muestra la velocidad media de migración (+/- SEM) de las células transfectadas meprin en relación con tratados idénticamente células de tipo salvaje. Los resultados son la media de tres a cuatro experimentos independientes para cada condición. En presencia de plasminógeno (100 nM), la migración de las células co-transfectadas /ß meprin-a HGF inducida fue significativamente mayor. Este efecto se revirtió en presencia del inhibidor de actinonina meprin (100 nM). La migración de las células transfectadas con cualquiera de meprin subunidad sola no era diferente de las células de tipo salvaje. (B) Meprin-α promueve la angiogénesis. Purificada activa meprin-α humano recombinante se complementó al medio de cultivo (0,7 g /ml) en el ensayo de anillo aórtico de rata y el crecimiento de los vasos en el gel de colágeno se cuantificó usando análisis de imagen (ver materiales y métodos). N
v: número de buques, N
b: número de ramificaciones, L
max: longitud máxima de los vasos. * P & lt; 0,05 en comparación con el cultivo de órganos sin tratar. Los resultados son de tres experimentos independientes con triplicados para cada condición.
recombinante purificada activa humano meprin-α promovió la respuesta angiogénica en el ensayo de anillo aórtico de rata [23] (Fig. 1B). análisis de imagen asistida por ordenador de los explantes aórticos de rata en 3 dimensiones de cultivo de gel de colágeno indicó que meprin-α mejoró la excrecencia de capilares en comparación con cultivos de control tanto en términos de la longitud (aumento de 44%, p & lt; 0,05) y el número de ramificaciones (aumento de 3 veces, p & lt; 0,05)
expresión meprin-α en el cáncer colorrectal en etapas progresivas tumorales
se encontraron niveles variables de un meprin-α ARNm único de 3,5 kb en. muestras de los pacientes en todas las etapas, incluyendo adenomas, que no se correlacionó significativamente con las fases del tumor (Fig. 2A, B). El empalme alternativo de meprin-β en el cáncer se ha informado anteriormente [24]. No se encontró evidencia de una isoforma ARNm empalmados alternativamente de meprin-α en los tumores. En inmunotransferencias proteína meprin-α fue detectable sólo débilmente o está ausente en los adenomas, mientras que un subconjunto de las muestras de cáncer, incluyendo las fases del tumor primario I a IV y metástasis hepáticas, contenía altas cantidades de proteínas meprin-α (Fig. 2C). membranas de borde en cepillo purificados a partir de intestino delgado humano, que contienen tanto meprin-α y β-meprin, se analizaron como un control positivo. Como se ha descrito anteriormente [4], las especies moleculares de meprin-α en los tumores eran de 10 a 25 kDa más pequeña que la proteína predominante 100-kDa a partir de membranas de borde en cepillo. La inmunotinción para meprin-α en los tumores y metástasis de hígado primario reveló grupos de células cancerosas con señales fuertes adyacentes a las células cancerosas negativos (Fig. 3). Todos los adenomas pero obtuvieron el valor mínimo 1 (Fig 4A.), Mientras que los tumores primarios y metástasis hepáticas puntuaron más alto (p & lt; 0,025 para las etapas de tumores primarios I a IV en comparación con metástasis hepáticas y adenomas).
(A ) de transferencia de Northern Representante para meprin-α en el ARN total (12 g) extraído de muestras tumorales de pacientes con estadios tumorales diferentes (a adenoma, tumores primarios etapas UICC UICC I a IV, metástasis hepáticas M). Normal de ARN de control de la mucosa del colon sano también se muestra (carril C). Se detectaron niveles que varían de una sola especie de ARNm de 3,5 kb. La cantidad de ARN cargado fue evaluada por reprobing la mancha de 7S ARN. (B) Cuantificación de los niveles de meprin-α relativa del mRNA de 7S ARN. la representación gráfica de frecuencias de los valores densitométricos obtenidos de transferencias Northern. La caja incluye cuartil inferior, la mediana y el cuartil superior, patillas indican 5-95 rango percentil (N = 12 en cada grupo). No se observaron diferencias significativas entre los diferentes grupos. (C) Western blot Representante para meprin-α en los extractos de proteínas de muestras de tumores (40 mg). Como control, también se analizaron las membranas de borde en cepillo humanos purificados a partir de intestino delgado (20 g) (BBM), donde meprin-α se asocia con transmembrana meprin-β en complejos de proteínas heterodiméricas. Meprin-α se detectó en un subconjunto de los tumores. Con el fin de revelar las señales débiles, la membrana se sobreexpuesta con respecto a muestras de tumor que mostraron una fuerte expresión.
inmunotinción para meprin-α en secciones de tejido de fijado con formalina y muestras de tejido colorrectal embebidos en parafina utilizando un conejo policlonal anticuerpo primario junto con un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa y diaminobencidina como sustrato cromogénico. Contador mancha: hematoxilina. Aumento del objetivo: 40 ×. Bar = 50 micras. (A) En normal de la mucosa del colon meprin-α es apenas detectable. De vez en cuando, se detectaron señales en la base de las regiones de las criptas en el citosol de células con núcleos apicalmente localizadas (asteriscos). La especificidad de estas señales y la identidad de las células no se investigó adicionalmente. (B) Muestra representativa de una etapa del tumor primario positivo meprin-α III. Los tumores exhiben un patrón de expresión de mosaico. En las agrupaciones de células de cáncer, las células con señales fuertes para meprin-α (flechas) se entremezclan con las células que muestran señales débiles o ninguna señal en absoluto. Las células en el estroma no expresan meprin-α (C) Muestra representativa de meprin-α positivo etapa IV tumor primario que muestra grupos de meprin-a células cancerosas positivas (flechas). células (D) Cáncer expresan meprin-α (flechas) en las metástasis hepáticas (Met). El tejido hepático normal circundante (HEP) está sólo débilmente teñidas.
(A) evaluación semi-cuantitativa de la expresión meprin-α en los carcinomas colorrectales utilizando una puntuación de inmunohistoquímica (puntuación mínima 1, puntuación máxima 16) . + = Valores de la mediana. (B) Aumento de la actividad proteolítica de meprin-α en las etapas de los tumores primarios I a IV, en comparación con adenomas y metástasis. La actividad proteolítica de meprin-α se midió usando el sustrato artificial N-benzoil-L-tirosil p-amino-benzoico (PABA-péptido). El valor umbral de la /h /g de proteína 2,5 mol corresponde a dos desviaciones estándar por encima del valor medio en el grupo de adenoma. Un aumento de las actividades proteolíticas por encima del umbral se encontró en 36%, 40%, 44% y 33% de las muestras de tumor primario en etapas UICC I, II, III y IV, respectivamente, pero no en las metástasis hepáticas. Se realizó un análisis estadístico entre las etapas I a tumores primarios UICC IV como un grupo y adenomas, o metástasis (unilateral de Wilcoxon de suma de rangos de prueba de muestras independientes). + = Valores de la mediana.
actividad Meprin-α, la activación de zimógeno y la inhibición
actividad
Meprin-α se midió específicamente en los extractos de proteínas de las muestras de tejido en presencia de una amplia gama inhibidor de la proteasa de orientación todas las clases de la proteasa, excepto las metaloproteasas. actividad Meprin-α fue baja en adenomas, mientras que la actividad significativamente mejorada se midió en un subconjunto (33 a 44%) de los tumores primarios de las etapas I a IV (Fig 4B, p & lt;. 0,01 para las etapas I a IV en comparación con adenomas). En las metástasis hepáticas, de forma inesperada, los niveles de actividad meprin-alfa fueron tan bajos como los de los adenomas, a pesar de la expresión significativa de la proteína (p & lt; 0,01 en comparación con etapas tumores primarios I a IV)
La aparente discrepancia entre la baja. los niveles de actividad y los altos niveles de proteína meprin-α en las metástasis hepáticas (Fig. 2C y 3) podría ser debido a la falta de activación de zimógeno meprin-α, o un inhibidor específicamente presente en metástasis hepáticas. Para determinar el grado de activación de zimógeno en muestras de tumores que primero immunoprecipitated zimógeno y formas activas de meprin-α y actividad medida directamente sobre las perlas. Este valor, que representa la piscina proteasa endógena activada, se comparó con la actividad en los inmunoprecipitados después de la activación máxima zimógeno por tratamiento con tripsina limitada [18]. La forma de zimógeno meprin-α predominó en todas las muestras. Sin embargo, la activación endógena de meprin-α fue significativamente mayor en los tumores primarios que las metástasis hepáticas (Fig. 5A). En tumores primarios I-IV, tanto como 20% del total meprin-α fue activada de manera endógena, y todos menos uno de la muestra está representada activación endógena por encima de 5%. Por el contrario, la activación endógena estaba por debajo de 5% en todos menos dos muestras de metástasis hepáticas. En conclusión, el aumento de la activación de zimógeno puede contribuir a la actividad meprin-α aumento en los sitios de tumor primario en comparación con los sitios de metástasis en el hígado.
Meprin-α se inmunoprecipitó a partir de muestras tumorales, dividido en dos partes alícuotas para derivar endógeno y actividad total, como se describe en Materiales y Métodos. (A) Relación de la actividad meprin-α endógena frente a la actividad total en tumores primarios (P, N = 7) y metástasis hepáticas (M, N = 10). activación de zimógeno se mejora de manera significativa en tumores primarios en comparación con metástasis hepáticas. muestras (B) de suero de pacientes con cáncer colorrectal exhiben bajas actividades inhibidoras contra meprin-α. La actividad proteolítica de purificado meprin-α humano recombinante (800 ng /ml) se ensayó en presencia de suero humano 20%. Actividades se muestran en relación con el ensayo de referencia con de tamponada con fosfato 20% de solución salina pH 7,3 (= 1). N: controles sanos normales (N = 19), Carolina del Norte: pacientes sin cáncer grupo, que incluye muestras de 22 inviduals con trastornos inflamatorios del intestino, CRCI-III: Etapas de pacientes con cáncer colorrectal (n = 15) I-III. CRCIV: pacientes con cáncer colorrectal (N = 9) en la etapa IV. Se ha reducido significativamente la inhibición de la meprin-α en el suero de pacientes con cáncer colorrectal.
inhibición reducida de meprin-α en el suero de pacientes con cáncer colorrectal
Las células circulantes de cáncer podrían encontrar factores en la sangre que modulan la actividad meprin-α. De hecho, un ensayo de actividad de recombinante meprin-α en presencia de suero humano 20% de los controles sanos y un grupo de pacientes con trastornos inflamatorios intestinales indica la inhibición por 35% (rango 5-50%) y 22% (intervalo 0-59 %), respectivamente. En contraste, los sueros de pacientes con cáncer colorrectal (estadios I-IV) inhibió meprin-α en un grado significativamente menor (12% en promedio, 0-37%, p = 2,8 * 10
-6 comparación con los controles sanos, p = 0,013 en comparación con los pacientes con trastornos inflamatorios) (Fig. 5B). Los sueros de los pacientes en las etapas I-III mostró una capacidad inhibidora reducida en comparación con los pacientes normales que no fue significativamente diferente de los pacientes en la fase IV. La inhibición en el suero fue independiente de la MBL, como las concentraciones séricas de MBL no difirieron significativamente entre los grupos de estudio y no se correlacionaron con la inhibición meprin-α (no se muestra). Además, MBL recombinante no inhibió humanos, de ratón y de rata meprin en el ácido benzoico (PABA-péptido) ensayo de N-benzoil-L-tirosil-p-amino (Tabla S1).
En resumen, hay es un patrón de regulación dinámico y complejo para la actividad de meprin-α en el cáncer colorrectal. El aumento de la activación de zimógeno puede contribuir a una mayor actividad proteolítica en etapas tumores primarios I a IV, y la actividad inhibitoria contra meprin-α se reduce en la sangre en pacientes con cáncer colorrectal.
Discusión
Este estudio implica que meprin-α es activa en la transición del crecimiento benigno (adenomas) para tumores primarios malignos. actividad PABA-péptido en el tejido canceroso es específico para meprin en nuestro ensayo, como nos ocupamos de reprimir cualquier actividad inespecífica completando el ensayo con un amplio rango de cóctel inhibidor de la proteasa. En particular, las proteasas de tipo quimotripsina, que son las enzimas sólo se conoce capaz de escindir paba-péptido aparte de meprin [25], se inhiben en estas condiciones. proteína y la actividad Meprin-α aumentaron en el último grupo a pesar de que no hubo una diferencia significativa de los niveles de ARNm correspondiente entre los diferentes grupos. Adenomas, por definición, se caracterizan por un aumento de la tasa de crecimiento de las células con diferenciación normal y polarización de las células [26]. Por lo tanto, similar a la mucosa normal del colon, meprin-α puede secretarse y, posteriormente, perdido en la luz intestinal, mientras que la proteasa se retiene dentro del tejido tumoral en el cáncer colorrectal debido a la secreción no polarizado aberrante, un mecanismo descrito por nosotros previamente [ ,,,0],4]. Además, existe evidencia de una regulación postranscripcional de meprin-α a partir de un estudio previo, como meprin-α mRNA fue detectable por
In situ
hibridación en ambas regiones de las criptas y vellosidades, mientras que la proteína detectada por inmunotinción fue sólo está presente en los enterocitos de las vellosidades [6].
en el cáncer colorrectal, tumores primarios contenían una mayor actividad meprin-α y con frecuencia albergado una subpoblación de células de cáncer con expresión de la proteína α-meprin fuerte, en particular en los estadios III y la UICC IV, es decir, después de la progresión de la metástasis a los ganglios linfáticos y los sitios distantes (Fig. 2 y 3). La diseminación de las células cancerosas por lo tanto se correlaciona con un aumento de la proteína y la actividad meprin-α. Sin embargo, observamos que la correlación entre las señales de inmunotransferencia, las puntuaciones y los niveles de inmunotinción meprin-α-actividad en los grupos de tumores primarios no está apretado. La puntuación inmunotinción ¿considera la frecuencia y la intensidad de las señales meprin-alfa entre las células cancerosas sólo dentro de un área restringida localmente de la muestra, mientras que la señal de inmunotransferencia es un promedio de toda la muestra incluyendo secretada meprin-α que se acumula en el estroma del tumor [4] . El nivel de actividad meprin-α es, además, afectada por zimógeno de activación y la presencia de inhibidores.
Los sueros de pacientes con cáncer colorrectal que se muestran actividad inhibidora significativamente menor hacia meprin-α que los controles sanos y los pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales, lo que indica que la emigración de hacer circular meprin-α expresando células cancerosas fuera de los vasos sanguíneos puede ser facilitada. La actividad inhibidora en el suero no se debió a manano-unión de lectina, un inhibidor endógeno meprin informó anteriormente [16], y por lo tanto es aportado por uno o varios inhibidor (s) adicional. En un informe reciente, fetuina-A y la cistatina C han sido reportados como tales inhibidores endógenos meprin [17]. De hecho, el uso de MBL humana recombinante, hemos encontrado ninguna inhibición de meprin (Tabla S1). Este hallazgo está en contraste con el informe por Hirano et al. [dieciséis]. Sin embargo, nuestros datos están de acuerdo con la falta de una correlación entre la inhibición por sueros de los pacientes y la concentración de MBL. En segundo lugar, como Hirano et al. usada MBL purificada a partir de suero humano por sus ensayos de inhibición meprin, se especula que la discrepancia entre nuestro y sus datos se debe a factores contaminantes del suero humano, como fetuina-A y /o cistatina C
es un patrón de regulación dinámica y compleja de la actividad de meprin-α en el cáncer colorrectal. El aumento de la activación de zimógeno contribuye a una mayor actividad proteolítica en las etapas de tumores primarios I a IV (Fig. 5A), y la actividad inhibidora frente a meprin-α se reduce en la sangre en pacientes con cáncer colorrectal (Fig. 5B). La activación ineficiente en metástasis hepáticas es de acuerdo con la observación anterior de que el uPA sistema, un activador meprin-α, es inactivo en las metástasis hepáticas, debido a la falta de activación de uPA y la expresión más del inhibidor del activador del plasminógeno [27] , [28]. A pesar de que se conocen muchas metaloproteasas de la matriz (MMPs) que aumentarse en tumores primarios invasivos en el cáncer colorrectal [29], hay pocos análisis que incluyen metástasis hepáticas. En uno de estos estudios, se demostró que MMP-9 que aumentarse en tumores primarios pero no metástasis en el hígado [30]. Ese estudio y nuestro punto de datos a las diferencias significativas entre las redes de la proteasa en tumores y metástasis de hígado primario, que es relevante para los enfoques terapéuticos que utilizan inhibidores de la proteasa.
Se estudió la migración celular en las células MDCK que expresan meprin-α en la superficie celular atado en los complejos de proteínas heterodiméricas transmembrana con meprin-β [31]. las células que expresan meprin migran significativamente más rápido en laminina-1 placas revestidas en presencia de plasminógeno y HGF. Meprin-α puede ser activada en la superficie celular por la plasmina, generada a partir de plasminógeno por medio de la actividad del activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) unido a su receptor (u-PAR), que ambos son conocidos por ser hasta reguladas por HGF en células MDCK [32]. Este sistema, muy probablemente también contribuye a la activación de meprin-α en los tumores
in vivo
, como u-PA y u-PAR se regulan-up en el cáncer colorrectal [33], [34], [35] , [36]. En nuestro ensayo de migración, el efecto pro-migratorio es de hecho debido a meprin-α, como la plasmina activa meprin-α pero no meprin-β [7] y porque actinonina, que invierte el efecto pro-migratorio, hace inhibir meprin-α con aproximadamente 100 veces mayor potencia (K
2 i * 10
-8 M) que meprin-β (K
2 i * 10
-6 M) [10].
Tanto laminina-1 y laminina-5 se escinden por meprin-α
in vitro
[37], y se especula que meprin-α podría exponer epítopos crípticos pro-migratorias de una manera similar como se ha hecho anteriormente se muestra con laminina-5 y laminina-1 para MT1-MMP [38] y elastasa [39], respectivamente. El sistema UPA-plasminógeno también es de importancia crucial en la angiogénesis [23], [40], y la plasmina a su vez podría activar meprin-α como un efector aguas abajo angiogénicos en el cáncer colorrectal. De acuerdo con nuestros datos, un efecto pro-angiogénicos de meprin-α también se ha observado en una caída morfolino en el pez cebra [14].
La actividad pro-angiogénico era evidente con extracelular soluble meprin-α, mientras su efecto pro-migratoria fue evidente en las células con meprin-α en su superficie celular. Por lo tanto, el efecto pro-angiogénico de meprin-α liberado por las células cancerosas puede ser promovida por su actividad proteolítica fuera y lejos de las células vasculogenic /pro-angiogénicos. Secretada meprin-α puede así acondicionar el ambiente del tumor para promover la angiogénesis mejorada junto con otros factores pro-angiogénicos, mientras que meprin-α atado en la superficie celular puede promover la migración de células de cáncer de los propios. Se espera que ambos procesos meprin dependiente para promover conjuntamente la progresión del tumor.
En conclusión, este estudio revela un patrón de regulación compleja y dinámica de meprin-α en la progresión tumoral. La transición a etapas malignas en los tumores colorrectales se correlaciona con aumento de la actividad meprinα en los sitios de tumor primario, consistente con un papel en la invasión y la diseminación metastásica de las células cancerosas. Un papel para meprin-α en este proceso se ve apoyado por su actividad pro-angiogénicos y pro-migratoria. Nuestros datos también muestran que la promoción de la migración depende de la expresión de simultanous meprin-β tethering meprin-α en la superficie celular. La falta de mRNA meprin-β detectable en todo el tumor no excluye su inducción en una subpoblación de células cancerosas. Nuestros datos están de acuerdo con la opinión de que las células cancerosas meprin-α /β co-expresan son propensos a emigrar lejos de la masa tumoral. Hemos descrito previamente que meprin-β debilita uniones intercelulares [41]. Los estudios futuros deberían centrarse en el análisis del papel de meprins de la emigración de estas células cancerosas. La actividad inhibidora hacia meprin-α es menor en el suero de pacientes con cáncer colorrectal, que puede facilitar la difusión de las células cancerosas que expresan meprin. Los enfoques terapéuticos con inhibidores de la proteasa de segmentación meprin-α en tumores primarios y en el torrente sanguíneo pueden contrarrestar la progresión del tumor. Por otra parte, la actividad meprin-α es baja en las metástasis hepáticas, y por lo tanto no se espera que la inhibición de esta proteasa en este sitio para ser un tratamiento efectivo.
Materiales y Métodos
recombinante humana meprin
recombinante activa meprin-α y β-meprin se purificó a partir de células de insectos como se describe anteriormente [7], [42]. No actividad de la tripsina residual fue detectable en los meprins recombinantes purificadas.
La migración de la célula de ensayo
células
Madin-Darby de riñón canino (MDCK) se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 5% de FCS , 100 U /ml de penicilina y 100 g /ml de estreptomicina (medio de cultivo de células y los suplementos de Invitrogen, Basilea, Suiza). meprin células MDCK transfectadas [31] y células MDCK parental de tipo salvaje fueron sembradas en placas de 12 pocillos recubiertos de laminina-1 a una densidad de 10000 células /pocillo (placas de 12 pocillos de Costar, Cambridge, MA, EE.UU., laminina-1 purificada a partir de sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm ratón, Sigma, St. Louis, MO, US a) y se incubaron durante la noche en MEM con 5% de FCS. Después de una preincubación de 48 h en medio libre de suero (DMEM avanzada, Invitrogen) que contiene 20 nM de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), células que migran se registraron utilizando videomicroscopy lapso de tiempo de 3-4 h. El plasminógeno (American Diagnostica, Pfungstadt, Alemania) y actinonina (Sigma) se añadieron ambos en 100 nM. pistas de migración se evaluaron como se informó anteriormente [22]. la migración inducida por HGF de células MDCK a velocidades de entre 27 y 84 micras /h. En ausencia de HGF, las células MDCK crecen en racimos y no migran. Debido a la limitación técnica de la configuración experimental utilizada, múltiples experimentos de migración tuvieron que ser llevado a cabo secuencialmente en diferentes días. A medida que las velocidades medias de migración variaron sustancialmente entre sesiones experimentales con independencia de las condiciones evaluadas. las mediciones se normalizaron a la migración de las células de tipo salvaje observados en cada sesión experimental.
ensayo de angiogénesis (ensayo del anillo aórtico)
anillos de aorta torácica de rata (1 mm de longitud) se cultivaron en geles de colágeno 3 dimensiones (cola de gel de colágeno intersticial rata, 1,5 mg /ml, Serva, Heidelberg, Alemania) [23]. Los cultivos se mantuvieron durante 9 días a 37 ° C en 6 ml MCDB 131 (Invitrogen) con NaHCO3 25 mM, 1% de glutamina, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina en presencia o ausencia de 0,7 mg /ml purificada activo meprin-α humano recombinante. La respuesta angiogénica se cuantificó mediante análisis de imágenes con el software Aphelion 3.2 (ADCIS) en tres experimentos independientes (cada uno por triplicado). Se determinaron los siguientes parámetros geométricos y morfológicos:. número de microvasos (NV), la longitud máxima de los microvasos (Lmax) y el número total de sucursales en microvasos (Nb) [43]
Los pacientes
Colección de las muestras de tumor durante las intervenciones quirúrgicas fue aprobado por el Comité ético de la Facultad de Medicina, Universidad de Berna, Suiza. Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. Los carcinomas se organizaron de acuerdo con la nomenclatura de la UICC. El estudio incluyó a 72 pacientes (49/23 macho /hembra, la mediana de 64,5 años, rango 20-90 años), con 12 pacientes en cada uno de los siguientes seis grupos: Los adenomas (5/7 h /m, mediana de 68,5 años, rango 20 -89 años), los tumores primarios etapa I (7/5 m /f, la mediana de 72,5 años, rango 60-90 años), la etapa II (7/5 m /f, la mediana de 73 años, rango 50-82 años), etapa III (10/2 hombre /mujer, la mediana de 64 años, rango 48-84 años), en estadio IV (9/3 m /f, la mediana de 60,5 años, rango 43-84 años) y las metástasis hepáticas (11/1 m /f , la mediana de 57,5 años, rango 31-84 años). Las muestras de este grupo de estudio se han analizado mediante transferencia de Northern y Western, inmunohistoquímica y se sometieron a ensayos de actividad meprin. Los experimentos mostrados en la Fig.