Extracto
El aumento de los niveles de CCL5 son marcadores de un resultado desfavorable en pacientes con melanoma, mama, cuello de útero, de próstata, gástrico o pancreático cáncer. Aquí, hemos evaluado el papel que desempeñan las interacciones CCL5 /CCR5 en el desarrollo de cáncer de colon. Para ello, hemos examinado una serie de muestras clínicas de carcinoma colorrectal humano y se encontró CCL5 y sus receptores sobreexpresados en primaria, así como el hígado y metástasis pulmonares de los pacientes en comparación con los tejidos sanos. In vitro, CCL5 aumentó el crecimiento y la respuesta migratoria de las células de cáncer de colon de ambos orígenes humanos y de ratón. Además, el tratamiento sistémico de ratones con anticuerpos CCL5 dirigida redujo el grado de desarrollo de los tumores de colon subcutáneas, de metástasis hepáticas y de carcinosis peritoneal. Consistentemente, encontramos número de células CD45-inmunorreactiva aumentó dentro de la estroma de las lesiones restantes, así como en la interfaz con el tejido sano. Por el contrario, la orientación selectiva de CCR5 mediante la administración de TAK-779, un antagonista de CCR5, sólo se ve comprometida parcialmente la progresión del cáncer de colon. Por otra parte, la neutralización CCL5 rindió los tumores más sensibles a una estrategia dirigida PDGFRß en ratones, este régimen de combinación que ofrece la mayor protección contra las metástasis hepáticas y carcinomatosis peritoneal macroscópica supresión. En conjunto, nuestros datos demuestran la implicación de CCL5 en la patogénesis del carcinoma colorrectal y el punto de su valor potencial como diana terapéutica
Visto:. Cambien B, Richard-Fiardo P, Karimdjee BF, Martini V, B Ferrua , Pitard B, et al. (2011) CCL5 neutralización restringe el crecimiento del cáncer y potencia la focalización de PDGFRß en carcinoma colorrectal. PLoS ONE 6 (12): e28842. doi: 10.1371 /journal.pone.0028842
Editor: Vladislav V. Glinskii, Universidad de Missouri-Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: Junio 7, 2011; Aceptado: 16 de noviembre de 2011; Publicado: December 20, 2011
Derechos de Autor © 2011 Cambien et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale y por la Asociación para la Investigación sobre el cáncer (Grant 3707). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. Bruno Pitard posee acciones en In-Cell-Art Co., que desarrolla 704 para aplicaciones de vacunas. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
interacciones tumor-estroma son reconocidos como componentes críticos de la invasión tumoral y metástasis de cáncer de colon potencial carcinoma [1]. Del estroma, células inflamatorias y el cáncer se comunican entre sí directamente a través del contacto celular, sino también indirectamente a través de señales paracrinas [2], [3]. Tales señales favorecen el desarrollo de tumores en múltiples formas: actúan como factores de crecimiento, estimulan la angiogénesis, modular la matriz extracelular, induce el reclutamiento de células del estroma adicionales y tomar parte en los mecanismos de evasión inmune de cáncer. Como consecuencia, la identificación de factores promotores de tumores para la terapéutica del cáncer ha sido de gran interés para diseñar estrategias antitumorales para ser aplicados como tratamiento de agente único o como terapia combinada en caso de que los tumores no responden a la monoterapia. Varios factores han sido identificados hasta ahora como promotores de la progresión del cáncer de colon, más común de las cuales son la familia VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), el (factor de crecimiento de fibroblastos) de la familia FGF y el PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) de la familia, su la producción dentro de la neoplasia que se correlaciona con el grado del tumor y la supervivencia del paciente más corto [4] - [8]. Más recientemente, ha habido una creciente evidencia de varios estudios, incluyendo el nuestro, que las quimiocinas producidas en el microambiente tumoral también pueden desempeñar un papel crucial en la patogénesis de la CRC (carcinoma colorrectal) [9] - [12].
entre las quimiocinas se cree que la promoción de la carcinogénesis y fuertemente stromagenesis es CCL5 /RANTES (ligando de quimiocina CC 5 /regulado a la activación, expresado de células T normal y secretadas) que fue descrito inicialmente por su papel clave en las enfermedades inflamatorias. De hecho, la evidencia clínica ha revelado que niveles elevados de tejido o CCL5 plasma son marcadores de un resultado desfavorable en pacientes con cualquiera de melanoma, de mama, cervical, de próstata, cáncer gástrico o pancreático [13] - [20]. En el cáncer de mama,
in vivo
CCL5 neutralización o antagonismo CCR5, se mostró que se suprime la metástasis MSC inducida de células de cáncer que implican por lo tanto CCL5 /CCR5 como un eje clave en esta malignidad [21]. de identificación selectiva de la señalización CCR5 /CCL5 también condujo a un crecimiento tumoral reducido en el adenocarcinoma de páncreas experimental a través de la interrupción de reclutamiento CCR5 dependiente de células T reguladoras en tumores [22]. Anibamine, un nuevo antagonista de CCR5 también suprimió las propiedades invasivas y metastásicas de las células de cáncer de próstata en ratones [23]. Finalmente, el bloqueo CCL5 comprometida significativamente la progresión del cáncer gástrico [20]. Curiosamente, CCL5 Recientemente se ha informado que se expresa en el carcinoma colorrectal, predominantemente en la parte delantera invasivo de tumores primarios [24]. Sobre la base de las observaciones clínicas mencionadas anteriormente en varios tipos de cáncer, es tentador especular que CCL5 y sus receptores puede tener un papel importante en la progresión del CRC y por lo tanto puede representar un objetivo interesante para el tratamiento de esta patología. Hasta la fecha, sin embargo, ninguno de estos aspectos se han abordado
in vivo
.
El estudio descrito en el presente documento dirigido precisamente a obtener nuevos conocimientos sobre el papel desempeñado por las interacciones CCL5 /CCR5 en el desarrollo de El carcinoma colorrectal. Para ello, hemos examinado una serie de muestras clínicas humanas de cáncer de colon y se encontró CCL5 y sus receptores sobreexpresados en primaria, así como el hígado y metástasis pulmonares de pacientes con CCR en comparación con los tejidos sanos. Para evaluar la pertinencia de la neutralización CCL5 /CCR5 en el carcinoma de colon, hemos utilizado modelos experimentales de singénicos ortotópico (hígado) y (hipodermis) ectópico cáncer de colon en ratones inmunocompetentes. Hemos examinado el efecto de CCL5- o CCR5-bloqueantes administrados como agentes únicos o en combinación con un tratamiento de murino PDGFRß dirigida, esta estrategia siendo actualmente bajo evaluación clínica para el tratamiento de los cánceres de CRC. Este informe proporciona la primera evidencia preclínica para un papel de CCL5 en el carcinoma de colon y demuestra que el bloqueo CCL5 tiene el potencial de reducir la progresión del cáncer de colon y mejorar la respuesta terapéutica en régimen de múltiples fármacos.
Materiales y Métodos
reactivo
el siguiente reactivo (TAK-779) se obtuvo a través de los NIH SIDA Investigación y Programa de reactivos de referencia, División de SIDA, Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas, NIH.
Las líneas celulares tumorales y animales experimentales
células de carcinoma de colon HT29 humano y el ratón CT26 fueron adquiridos de ATCC y se mantuvieron en medio DMEM suplementado con FBS inactivado por calor al 10% como se ha descrito anteriormente [11]. Los ratones SCID hembra y BALB /c, de 6 a 8 semanas de edad, fueron adquiridos de Harlan (Gannat, Francia).
Ética
Diez conjuntos de tumores de cáncer de colon primarios y metastásicos tejidos de la misma pacientes, así como pares de biopsias de colon "sanos" se recogieron de pacientes con adenocarcinomas invasivos, que se sometieron a biopsias quirúrgicas o cirugía inicial en el Institut Paoli-Calmettes (IPC, Marsella, Francia) entre 1987 y 2007. Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito y el estudio fue aprobado por el IPC "Comité d'Orientación Stratégique". Todos los procedimientos con animales de laboratorio y su cuidado fueron aprobados por el comité de revisión institucional (número permitan#A06-088-14).
TaqMan en tiempo real PCR experimentos
El ARN total de colorrectal humano cáncer y colon sano, de ratón sano y tumorales tejidos, así como líneas de células de carcinoma de colon se extrajo utilizando RNeasy kit (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) y se transcribieron a ADNc usando la enzima SuperScript III (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia) como se describió previamente [11]. PCR en tiempo real se realizó en un ABI PRISM 7900HT y llevó a cabo utilizando TaqMan ensayos de expresión de genes de muestras humanas (hCCR1: Hs 00174298m1, hCCR3: Hs 00356601m1, hCCR5 Hs 00152917m1, hCCL5: Hs 00174575m1) (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Francia ), o SYBR® ensayos de expresión de genes de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystem). El primer secuencias de CCL5 ratón fueron: hacia adelante, 5'-TGCCCACGTCAAGGAGTATTTC-3 '; y revertir, 5'-AACCCACTTCTTCTCTGGGTTG-3 ', por CCR1 de ratón: adelante, 5'-AGGCCCAGTGGGAGTTCAC-3'; y revertir, 5'-TCTTCCACTGCTTCAGGCTCTT-3 ', para CCR3 ratón: adelante, 5'-AAGCTTTGAGACCACACCCTATG-3'; y revertir, 5'-GACCCCAGCTCTTTGATTCTGA-3 '; para CCR5 de ratón, hacia adelante 5'TTATCTCTCAGTGTTCTTCCGAAAAC-3 'y revertir, 5'-TTCTCCTGTGGATCGGGTATAGA-3'. Los niveles relativos de expresión de ARNm se determinaron usando? C
valores de T obtenidos restando C
control T (actina humano o de ratón) a partir de C
T del gen diana se mide en la misma preparación de ARN. nivel comparativo de la expresión del ARNm entre sanos (
X
) y tejidos metastásicos (
Y
) se calculó utilizando la fórmula Δ
C
T
Y
-
? C
T
X
y expresados como veces más saludable (2ΔΔ
C
T). Murino tejidos de colon sanos se utilizaron para analizar muestras de tumores de ratón y de colon humanos sanos fueron utilizados para analizar los tumores humanos y muestras HT-29.
in vitro Ensayo de proliferación
En pocas palabras
, células de cáncer de colon pretrataron o no con anticuerpos anti-CCL5 TAK-779 o (a las concentraciones indicadas) se sembraron a una densidad de 10
4 células /cm
2 y se incubaron ya sea en un medio de suero enriquecido o en medio de base (que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina) suplementado o no con varias concentraciones de CCL5 recombinante (Peprotech, Neuilly sur Seine, Francia) durante 5 días antes de la tripsina individual, recogido y enumerado como se describe anteriormente [11].
in vitro
ensayo de quimiotaxis de
respuestas quimiotácticas de las células de cáncer de colon fueron evaluados mediante el uso de cámaras de quimiotaxis de 24 pocillos y polietileno tereftalato inserta con 8 micras poros (Becton Dickinson, San Jose, CA ) recubiertas con 6,5 mg /ml de fibronectina (Sigma, Lyon, Francia) o con colágeno /ml 50 g (Becton Dickinson) para las células CT26 o las células HT29, respectivamente [11]. células de cáncer de colon, pretratadas o no con anticuerpos anti-CCL5 TAK-779 o (a las concentraciones indicadas), se colocaron en el pocillo superior (5 × 10
4 células) se añadieron y diversas concentraciones de CCL5 recombinante (Peprotech) a los pocillos inferiores. Después de la incubación de las placas durante 18 horas (células CT26) o durante 40 horas (células HT29) a 37 ° C en 5% de CO
2 ambiente, las células no migradas fueron retirados de la cavidad superior y las células migradas recogió en el lado inferior del inserto se tiñeron con el colorante cristal violeta y enumeró. índice de migración se calculó como la relación del número de células migradas en los pozos que contiene quimioatrayentes-dividido por el número de células que migraron a la base medio solo.
PDGFRß gen vector de expresión
ADN que codifica mPDGFRβ se clonó y se insertó en el vector de expresión eucariota pTOPO-cDNA3 (Invitrogen). Las identidades de los sentidos (pcDNA3-PDGFRß) y antisentido (control de vector) los productos se confirmaron por secuenciación.
preparación de plásmido y la formulación
El plásmido de vacuna de ADN (pcDNA3-PDGFRß) y el correspondiente vector de control se utilizaron como antígenos. Todos los plásmidos se purificaron utilizando columnas de purificación de plásmidos EndoFree (Qiagen) y se confirmó que eran libres de contaminación por endotoxinas (endotoxina & lt; 0,1 plásmido ADN /mg UE) por el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (Lonza, Le Perray-en-Yvelines, Francia). El copolímero de bloque anfífilo tetrafunctionalized 704 (MW 5500) fue suministrada por In-Cell-Art (Nantes, Francia). Las soluciones madre se prepararon a 20% (w /v) en agua y se almacenó a 4 ° C. Las formulaciones de ADN con 704 (concentración final 0,3%) se prepararon inmediatamente antes de la inyección intramuscular de mezcla de copolímeros equivolumetric en agua con una solución de plásmido de ADN como se describe anteriormente [25], [26]. dosis de ADN administradas se indican a lo largo del estudio.
transfección con PDGFRß vector de expresión génica
La expresión correcta de mPDGFRβ se verificó mediante transfección transitoria de células CHO con el vector de control y el plásmido de vacuna de ADN ( pcDNA3-PDGFRß) utilizando AMAXA Biosystems (Lonza). Veinticuatro horas después de la transfección, lisados de células a partir de células CHO se prepararon como se describe anteriormente [27] antes de ser sometidas a SDS-PAGE. Western Blot se realizó ya sea con anticuerpos de cabra anti-ratón PDGFRß (Santa Cruz Biotechnology, Le Perray-en-Yvelines, Francia) o con suero diluido obtenida de los ratones PDGFRß-vaccinated-. La detección se realiza ya sea por conejo anti-cabra ABS- o por el ratón de cabra anti ABS- conjugado con peroxidasa de rábano (Dako, Trappes, Francia). Las bandas se visualizaron por reacción de quimioluminiscencia mejorada (Amersham, Les Ulis, Francia).
modelos de ratón y modelos
subcutáneo, hígado y metástasis pulmonar.
Para la inducción de la subcutánea y tumores hepáticos, células CT26 (5 × 10
4) o células HT29 (3 × 10
6) se inyectaron en el costado o debajo de la cápsula del hígado de ratones BALB /c o ratones SCID, respectivamente. Para la inducción de la metástasis pulmonar, células CT26 (3 × 10
4) o células HT29 (2 × 10
6) fueron entregados por inyección intravenosa en la cola BALB /c o ratones SCID, respectivamente. En el sacrificio, se realizaron exámenes completos post mortem. Subcutáneo y los tumores hepáticos se extirparon, se pesaron y midieron con calibradores en los dos ejes perpendiculares (
a
y
b
). El volumen del tumor se calculó según la fórmula
ab
2π /6.
ADN intramuscular vacunación.
Después de una configuración profiláctica, los ratones anestesiados fueron vacunados 3 veces al intervalo de 3 semanas (días 0, 21 y 42) por medio de inyecciones intramusculares de formulaciones de ADN-polímero en ambos
músculos tibial anterior
como se describe anteriormente [25], [26]. Tres semanas después de la última inmunización (día 66), los ratones fueron desafiados por inyección de 5 × 10
4 células de carcinoma de colon CT26 murino bajo la cápsula hepática.
tratamientos de ratón.
Anti -CCL5 o de control de anticuerpos de isotipo IgG (32 g por ratón, Peprotech) fueron inyectados en el peritoneo de ratones BALB /c 72 h después de la implantación del tumor y dos veces por semana durante la duración de los experimentos (desde el día 69 a 87). TAK-779, la pequeña molécula de quimioquinas CC receptor 5 (CCR5) inhibidor de [28], [29] se inyectó en los ratones (150 g /ratón) 72 h después de las células tumorales de la inoculación y diariamente a partir de entonces hasta el sacrificio (de día 69-87 ).
En el sacrificio (día 87), los tumores hepáticos se extrajeron y se pesaron. Incidencia de carcinosis peritoneal en ratones se expresó como por ciento de los animales carcinosis-cojinete en cada grupo.
Determinación de los niveles séricos de Abs mPDGFRβ-específica por ELISA
El suero se recogió por sangrados retro-orbitales en diferentes puntos temporales después de la vacunación de ratones inmunizados. Las placas de ELISA se recubrieron con 2 mg de anticuerpos anti-ratón PDGFRß /ml (Santa Cruz) en 100 l de PBS durante la noche a 4 ° C. A la mañana siguiente, las placas se lavaron dos veces con PBS /Tween 20 (PBST), saturado durante 30 minutos con tampón de fosfato que contiene 1% de leche desnatada y 0,12% de Triton X-100 (tampón de ensayo), se lavó de nuevo dos veces antes de ser incubadas durante 18 h a temperatura ambiente con PDGFRß recombinante de ratón. Después de lavados repetidos, se añadieron diluciones seriadas de muestras de suero de ratones inmunizados con el bienestar en los duplicados. Las placas se incubaron adicionalmente durante 2 h, se lavó cuatro veces con PBST, y la actividad ligada-enzima se reveló con una solución de sustrato OPD cromogénico y se midió a 490 nm.
Histología /Inmunohistoquímica
formalina -fixed, secciones en parafina de tejidos de cáncer de colon metastásico fueron teñidas con hematoxilina /eosina para la evaluación morfológica. La inmunotinción de CD45 se realizó con anti-ratón CD45 mAb (BD Pharmingen, Le Pont de Claix, Francia) por el método de inmunoperoxidasa complejo avidina-biotina siguiendo la recuperación de antígenos de microondas. El anticuerpo primario fue reemplazado con anticuerpos isotipo en secciones de tejido adyacentes, como control negativo. La expresión de CD45 en el bazo del ratón se utilizó como control positivo.
El análisis estadístico
Los resultados se expresan como media ± s.e.m. y se analizaron utilizando
t
test de Student no pareada o la prueba de Kruskal-Wallis para comparaciones múltiples.
Resultados
La expresión de CCL5 y sus receptores afines en las muestras de carcinoma colorrectal resecado
Se analizaron por RT-PCR cuantitativa (tiempo-cuantitativa reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa real) los niveles de expresión de CCL5 humana y sus receptores CCR1, CCR3 y CCR5 en piezas de resección quirúrgica de tumores primarios de colon humanos, de emparejado hepática y pulmonar metástasis de cáncer colorrectal y de los tejidos sanos recogidas de los mismos pacientes correspondientes. Hemos observado niveles de expresión de CCL5 incrementamos en los tumores colorrectales (6 veces, P & lt; 0,05), las metástasis hepáticas (8,5 veces, P & lt; 0,05) y las metástasis pulmonares (4 veces, P & lt; 0,05) en comparación con los especímenes sanos (Figura 1, Tabla S1 ). Debido CCL5 actúa a través de receptores específicos, también se fijó para este tipo de receptores que se expresan dentro del tumor y muestras metastásicas. Distintos patrones de expresión de CCR se midieron de acuerdo con el órgano diana. Considerando CCR1 y CCR5 fueron ambos se encuentran que se sobreexpresa significativamente en los tejidos malignos de hígado y de pulmón en comparación con las biopsias de control correspondientes (P & lt; 0,01 en el hígado, P & lt; 0,05 en los pulmones), CCR3 sólo se encontró sobreexpresado de manera significativa dentro de los tumores primarios de colon en comparación con los órganos sanos (P & lt; 0,05) (Figura 1A, Tabla S1)
Análisis de niveles de expresión de los objetivos (m) de ratón humano (h) o se realizó por RT-PCR cuantitativa en piezas de resección quirúrgica de carcinoma colorrectal humano. (n = 10) (a), en los tumores subcutáneos experimentales (n = 6), el hígado (n = 6) y metástasis de pulmón (n = 6) derivados de ratón CT26 células (B) o derivados de las células HT29 humanas (C) en comparación con los correspondientes tejidos sanos (humano normal, n = 10, y de colon normal de ratón, n = 6, respectivamente). Los niveles relativos de expresión se calcularon usando las curvas de calibración y se expresaron como 1 /Ct. valores de Ct se calcularon restando Ct de normalizar gen de Ct del gen diana, medida en la misma preparación de ARN. nivel comparativo de la expresión del ARNm entre sanos (
X
) y tejidos metastásicos (
Y
) se calculó utilizando la fórmula Δ
C
T
Y
- Δ
C
T
X
y expresados como veces más saludable (2ΔΔ
C
T). Las barras negras: los tumores primarios de colon o subcutánea; barras sombreadas: metástasis hepáticas; barras punteadas: metástasis pulmonares. * P & lt; 0,05, ** p & lt;.
0,01
Con el fin de evaluar más a fondo el papel de la CCL5 /receptores eje en el cáncer de colon, hemos buscado un modelo de carcinoma de colon de ratón relevante. Para ello, se han analizado por RT-PCR cuantitativa el nivel de expresión de CCL5 /CCR en el HT29 humano y en las células de cáncer de colon CT26 de ratón crecer en cultivo. Hemos observado CCL5 y la expresión de CCR5 por ambas líneas celulares in vitro (Tabla S1). Ninguno de los otros dos receptores de CCL5 (CCR1 y CCR3) se detectaron en las células HT29 mientras que la expresión de CCR1 se encontró en las células CT26. Para analizar si los patrones de expresión de CCL5 /receptores en los tejidos malignos estaban de acuerdo con los observados en biopsias humanas, el próximo desarrollado modelos experimentales de ortotópico (hipodermis) cáncer de colon ectópico (hígado y metástasis de pulmón) y en ratones inmunocompetentes y inmunodeficientes. células de cáncer de colon de ratón (CT26) o orígenes (HT29) humanos se inocularon en los ratones por vía subcutánea, bajo la cápsula del hígado o a través de inyección en la vena de la cola para generar metástasis pulmonares. En el sacrificio, los niveles de quimiocinas /receptores dentro de los órganos diana distintas fueron evaluados por PCR en tiempo real cuantitativa usando cebadores murinos para los tmors derivados-CT-26 y los cebadores humanos para los xenoinjertos de HT-29 (Figura 1B y C). Se detectaron niveles elevados de expresión de CCL5 en todos los modelos de tumores (subcutánea, hepáticas y pulmonares) desarrollados con células CT26 de ratón y con células HT29 humanas, excepto en las lesiones pulmonares derivadas de células CT26. En contraste, los patrones de expresión de los receptores de CCL5 eran complejos y cambian cuando se cultivaron las células in vivo en comparación con las condiciones de cultivo. Ninguno de los dos modelos de tumores (CT26 y HT29) refleja exactamente el patrón de receptores de quimioquinas expresión observada en las biopsias humanas. Por lo tanto, basado en el hecho de que los tres tipos de tumores CT26 (subcutánea, hígado y pulmón) expresaron tanto CCL5 y CCR5 in vivo, mientras que HT29 xenoinjertos mostraron niveles de CCR5 por debajo del umbral de detección de la técnica de PCR, se ha encontrado más apropiado trabajar con los modelos CT26 para evaluar el papel desempeñado por la interacción CCL5 /CCR5 en el carcinoma colorrectal. Además, el modelo singénico CT26 que se desarrolla en ratones inmunocompetentes también apareció el más apropiado para tener en cuenta los mecanismos inmunes CCL5 /CCR5 dependiente sobre todo teniendo en cuenta que nuestro objetivo final era combinar el bloqueo CCL5 con una estrategia de vacuna.
CCL5 aumenta la proliferación celular y la migración CRC
in vitro
la expresión de los receptores CCL5 por las células de carcinoma de colon humanos y murinos nos ha llevado a determinar la capacidad de su CCL5 ligando común para estimular su proliferación y la migración
in vitro
. Con este fin, se analizó y cuantificó el crecimiento celular después de la siembra de células CT26 y HT29 durante 5 días a baja densidad en medio base solo o complementado con diversas concentraciones de CCL5. Dentro de los 5 días de privación de suero, se observó que las células de CRC de ambos orígenes proliferan en respuesta al tratamiento CCL5 de una manera dependiente de la dosis (Figura 2A y C). El crecimiento máximo se observó en respuesta a 50 CCL5 ng /ml. A continuación se evaluó la capacidad de las células de CRC para migrar en respuesta a CCL5. se recogieron las células CT26 y HT29, se colocaron en cámaras de Boyden modificadas y se dejó migrar hacia varias concentraciones de CCL5. Figura 2B y D muestra que las células migran a la CRC de quimioquinas en comparación con el medio de base solo. Dado el papel clave desempeñado por CCR5 en la mediación de las acciones CCL5 en varias células cancerosas, el próximo tratado de distorsionar la acción CCL5 /CCR5 utilizando TAK-779, un antagonista de CCR5 no peptídico descrito anteriormente para poner en peligro el desarrollo de tumores en el cáncer de páncreas [22]. dosis crecientes de TAK-779 (que van de 10 a 500 nM) se probaron en las células CT26 de acuerdo con los valores de IC50 que se describen en el intervalo nM bajo [28], [29]. Se observó un efecto dependiente de la dosis de TAK-779 tanto en el crecimiento y las respuestas migratorias de las células de CRC, como se representa en la figura 2E y F. La inhibición más fuerte se obtuvo con 200 nM TAK-779, dosis más altas conducen a efectos citotóxicos sobre las células. Sin embargo, sólo 28% de las respuestas de CRC fueron abrogadas por el bloqueo de CCR5, lo que sugiere la implicación de mecanismos de CCR5-independiente en ambos procesos celulares. Diversas concentraciones de anticuerpos anti-CCL5, que van desde 3 a 30 g /ml, se aplicaron a las células CT26 entonces. Como se muestra en la figura 2G y H, la neutralización CCL5 obtenido con la dosis de 10 mg /ml de anticuerpos de células de CRC totalmente deteriorados migratorias y respuestas de crecimiento a la quimiocina. En conjunto, estos datos sugieren que la activación de los receptores /CCL5 aparece como una característica común de las células CRC de distintos orígenes y que podría mediar en las propiedades relacionadas con la malignidad de las células de cáncer de colon.
(A, C, E, G) la proliferación de las células CT26 y HT29 se evaluó en respuesta a un tratamiento de 5 días con medio de base solo (BSA, barras blancas), con medio de suero enriquecido (FBS, barras rayadas) o con las concentraciones indicadas de CCL5 recombinante ( barras rellenas), en presencia o en ausencia de anticuerpos anti-CCL5 TAK-779 o (a las concentraciones indicadas). (B, D, F, H) se ensayaron células de CRC de la quimiotaxis en respuesta a basar medio solo (BSA, barras abiertas), a un medio de suero enriquecido (FBS, barras rayadas) o a las concentraciones indicadas de CCL5 recombinante (barras rellenas ), en presencia o en ausencia de anticuerpos TAK-779 o anti-CCL5. Los resultados representan la media ± E.E.M. de seis determinaciones. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001
interacciones CCL5-CCRs están involucrados en el desarrollo del cáncer de colon
Para probar si la malignidad relacionada. propiedades de CCL5 ejercida sobre las células del cáncer de colon
in vitro
también tienen una relevancia
in vivo
, se evaluó el impacto de la neutralización CCL5 en el desarrollo de los tumores de colon CT26 implantados subcutáneamente en inmunocompetentes Balb /c ratones. Al día 0, los ratones fueron desafiados con una inyección subcutánea de células CT26 debajo de la piel. Los animales fueron tratados a continuación en los días +7, +10, +14 y +18 con las administraciones intratumorales de anti-CCL5 o control de isotipo de anticuerpos IgG. En el sacrificio, el grado de desarrollo del tumor se evaluó midiendo las cargas tumorales. ratones estimulados-CT26 desarrollan dentro de los 7 días de tumor palpable con un promedio de 20 mm
3 que crecieron hasta un tamaño de ~336 mm
3 en el día 21 (Figura 3A). En contraste, los ratones anti-CCL5 tratados desarrollaron tumores que crecían con una velocidad reducida en comparación con el control de tumores, esta reducción es claramente detectable después del tercer tratamiento anti-CCL5 (reducción de 40%, P & lt; 0,01). En el sacrificio, su volumen alcanza un tamaño medio de 202 mm
3, que corresponde a una reducción del 40% en comparación con el control de cargas (P & lt; 0,05).
Ratones (A) por vía subcutánea-desafiados con células CT26 recibidos cuatro inyecciones intratumorales de anti-CCL5 (puntos abiertos) o anticuerpos del mismo isotipo (puntos negros) en los tiempos indicados. Tras el sacrificio, el grado de desarrollo del tumor se evaluó midiendo las cargas tumorales. (B) la incidencia y el alcance del desarrollo de tumores en hígados de ratones estimulados-CT26 tratadas con anti-CCL5- o anticuerpos del mismo isotipo. (C) Incidencia de carcinosis peritoneal expresan como porcentaje de ratones portadores de carcinosis. (N = 5 /grupo). * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0.01
Dado que el hígado es un importante órgano diana en el tumor maligno CRC y que los niveles más altos de expresión de CCL5, CCR1 y CCR5 se encuentra dentro de las metástasis hepáticas de pacientes con cáncer de colon humano, el próximo tratado de evaluar el potencial protector del tratamiento anti-CCL5 en el desarrollo de las metástasis hepáticas experimentales en ratones inmunocompetentes. Los animales fueron por lo tanto desafiados con una inyección de células CT26 bajo la cápsula del hígado antes de ser tratadas 72 horas después de la inoculación y dos veces por semana durante la duración del experimento con las administraciones intraperitoneales de anticuerpos anti-CCL5 a la dosis previamente demostrado ser eficaces [20], [21]. Aunque 100% de los ratones de ambos grupos desarrolló tumores en el hígado, había una reducción significativa (30%) en la carga total de tumor en el hígado de los ratones anti-CCL5 tratados en comparación con el grupo control, tal como se evaluó mediante la medición de peso del hígado (1,24 vs 1,78, P & lt; 0,05). (Figura 3B)
además de los tumores del hígado, también se observó diferencias en el grado de carcinomatosis peritoneal macrospcopic entre los dos grupos de tratamientos (Figura 3C). Considerando que la difusión peritoneal se encontró en 100% de los ratones de control, sólo se observó en 40% de los tratados con los anticuerpos anti-CCL5.
vacunación mPDGFRβ reduce el crecimiento de metástasis de carcinoma de colon CT26
Dado que la estrategia contra la CCL5 sólo podía conducir a un efecto terapéutico moderada contra el cáncer de colon, el próximo tratado de evaluar el potencial de bloqueo CCL5 se administra en combinación con una estrategia anti-PDGFR. De hecho, la interacción de PDGF /PDGFR se sabe que juega un papel clave en la promoción de varios tumores malignos, incluyendo carcinoma colorrectal. En particular, Wehler et al [30], han demostrado que la expresión PDGFRß correlacionada con la diseminación linfática en el cáncer colorrectal humano. Trabajando en 99 biopsias de CRC humanos, los autores reportados por inmunohistoquímica y RT-PCR que PDGFRß expresión ocurrieron en 60% de los pacientes. Del mismo modo, se detectó la expresión PDGFRß en cuatro líneas celulares humanas: CRC Caco-2, HT29, SW480 y SW620. En consonancia con esto, se observó un alto nivel de expresión de mPDGFRβ en metástasis hepáticas CT26 derivados (Figura 4A). Como consecuencia de ello, hemos creado una vacuna de ADN que codifica mPDGFRβ y verificó la correcta expresión de mPDGFRβ por análisis de Western Blot después de la transfección transitoria de células CHO (Figura 4B). A continuación, preparados formulaciones de plásmidos de vacuna de ADN con 704, un copolímero de bloques anfifílico tetrafunctionalized que ha sido previamente demostrado para mejorar la vacunación de ADN intramuscular, aumentando al mismo tiempo la expresión del transgén y la activación de la inmunidad [25], [26]. La potencia de la vacuna de ADN plásmido 704 formulado para permitir la entrega de genes en
tibial anterior
músculos de ratones /c de 6 semanas de edad Balb se evaluó mediante Western Blot (Figura 4C) y se confirmó la expresión de la proteína muscular de la continuación de la administración de ADN de dosis baja (25 mg). De acuerdo con un protocolo de inmunización previamente optimizado [25], [26], los ratones se expusieron en día 0, y se volvieron a estimular en el día 21, y día 42 con la vacuna de ADN (50 g) o el vector de control formulado con polímero 0,3% 704. dos semanas después de la inmunización de sensibilización-refuerzo, los sueros de ambos grupos de animales fueron analizados para determinar la presencia de anticuerpos específicos mPDGFRβ. Como se muestra en la Figura 4D, los ratones inmunizados mostraron una respuesta humoral a la proteína mPDGFRβ detectada por ELISA (P = 0,005). La presencia de anticuerpos mPDGFRβ específicos en sus sueros se confirmó ensayando su capacidad para reaccionar con la banda del antígeno purificado a partir de las células CHO transfectadas con mPDGFRβ por análisis de transferencia Western (Figura 4E) y por reprobing la transferencia con un anticuerpo comercial específico a mPDGFRβ. La capacidad de nuestra vacuna basada en ADN para inducir una respuesta inmune adaptativa-mPDGFRβ específica nos llevó a examinar si este enfoque podría proteger a los ratones estimulados-CT26. Tras un entorno profiláctico, se administró la vacuna mPDGFRβ acuerdo con el régimen de inducción y refuerzo descrito anteriormente antes de la inoculación de las células CT26 bajo la cápsula del hígado (Figura 5A). Veintiún días después de la exposición de las células tumorales, se comparó el grado de desarrollo del tumor en el hígado, tanto de la inmunizado y los animales de control.