Extracto
Antecedentes
Factores que influyen en las respuestas diferenciales de los tumores de próstata a los receptores de andrógenos (AR) eje- terapéuticos dirigidos, son poco conocidos, y se necesitan factores predictivos de la eficacia del tratamiento. La hipótesis de que la eficacia de la inhibición de la síntesis de DHT ligando asociaría con relaciones de andrógenos intra-tumorales indicativos de dependencia relativa de crecimiento mediado por DHT.
Métodos
Se caracterizaron dos xenoinjerto de cáncer de próstata andrógeno-sensibles modelos después de la supresión androgénica por la castración en combinación con el inhibidor de SRD5A, dutasterida, así como un panel de metástasis resistente a la castración obtenida a través de una rápida autopsia.
Resultados
en LuCaP35 tumores (T intratumoral : relación de DHT 2:01) dutasterida suprime la DHT a 0,02 ng /g de supervivencia y prolongada frente a la castración sola (337 vs.152 días, HR 2.8, p = 0,0015). En los tumores LuCaP96 (T: 10:01 DHT), la supervivencia no mejoró a pesar de la reducción de DHT similar (0,02 ng /g). LuCaP35 demostró una mayor expresión de las enzimas biosintéticas de esteroides que mantienen los niveles de DHT (5 veces mayor SRD5A1, 41 veces mayor, 99 veces mayor RL-HSD, p & lt; 0,0001 para ambos), la reconstitución de DHT intra-tumoral (a ~ 30% de los no tratados tumores), y ~ 2 veces mayor expresión de AR de larga duración. Por el contrario, LuCaP96 demostró niveles más altos de enzimas catabolizing esteroides (6,9 veces AKR1C2 superior, 3.000 veces mayor UGT2B15, p = 0,002 y p & lt; 0,0001, respectivamente), la supresión persistente de DHT intra-tumoral, y 6-8 veces de inducción de la plena longitud AR y la variante de empalme V7 AR ligando independiente. metástasis humanos demostraron los niveles de andrógenos bio-activos y la expresión longitud y AR empalme variante completa AR coherentes con el rango observado en xenoinjertos.
Conclusiones
diferencias intrínsecas en la esteroidogénesis basal, así como variable de expresión de longitud completa y empalme de la variante AR, asociado con la respuesta y resistencia a la pre-receptor de supresión de AR ligando. La expresión de las enzimas androgénica e isoformas AR puede servir como potenciales biomarcadores de la sensibilidad a la inhibición AR-eje potente y debe ser validado en modelos adicionales
Visto:. Mostaghel EA, Morgan A, Zhang X, Marck BT, Xia J , Hunter-Merrill R, et al. Características Cáncer (2014) de la próstata asociados con la respuesta a Pre-receptor de la Focalización del eje de andrógenos. PLoS ONE 9 (10): e111545. doi: 10.1371 /journal.pone.0111545
Editor: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Febrero, 2014; Aceptado: April 1, 2014; Publicado: 30 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Mostaghel et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El cáncer de próstata Premio de la Fundación de Desarrollo de Carrera (EAM) y el Premio Desafío (EAM, SP, RLV, AMM, GBR, PSN), Damon Runyon Genentech-Premio al Investigador clínico C-40-08 (EAM), NIH subvención 1K23 CA122820-01 (EAM), DOD Nueva Investigador Award W81XWH-10-1-0228 (EAM); GlaxoSmithKline (A.M. y P.S.N.); 1RC1 CA146849 (P.S.N.); PC093509 (P.S.N.); PO1 CA 85859 (J.X., R. G., R.V., P.S.N.); el NIH /NCI noroeste del Pacífico del cáncer de próstata SPORE P50CA97186 (J.X., R. H., R. G., P.S.N., R.V.); y el Departamento de Asuntos de Veteranos (B.T.M., los PM y A.M.M.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: A.M.M., R.B.M. y P.S.N. han consultado y recibido apoyo para investigación de GlaxoSmithKline. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
A pesar de que, inicialmente terapia de deprivación androgénica altamente eficaz para el cáncer de próstata está uniformemente marcada por la progresión de cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) durante un período de 18-36 meses, con una mediana de supervivencia subsiguiente de 1-2 años. [1] Mientras receptor de andrógenos (AR) la expresión de genes -regulated se suprime inicialmente, [2], [3] el programa transcripcional regulada por el AR se reactiva en CRPC a través de mecanismos que mantienen ambos ligando y receptor contribuciones mediadas a señalización AR. [4] - [6] Estos incluyen andrógenos intratumorales residuales a niveles suficientes para activar el programa AR, [7] - [9] y el aumento de la actividad de AR, ya sea a través de la amplificación o sobreexpresión (que resulta en una mayor sensibilidad a los bajos niveles de ligando) [10 ], [11] o por medio de la expresión descrita recientemente de variantes de corte y empalme AR independiente de ligando truncadas (AR
sv) que carece del dominio de unión a ligando (LBD). [12] - [17] En particular, los estudios de bloqueo máximo de andrógenos o combinados que utilizan antagonistas de AR esteroideos o no esteroideos que se dirigen a la AR LBD sólo han demostrado una pequeña, aunque estadísticamente significativa, mejora en las tasas de supervivencia a 5 años (27,6 vs. 24,7 %; p = 0,005). [18] La explicación más simple para la falta de una mayor eficacia es la incapacidad de estos antagonistas de AR a outcompete testosterona residual (T) y la dihidrotestosterona (DHT) (que han AR afinidades que exceden con mucho los de anti-andrógenos sintéticos de unión), [ ,,,0],19] o un fracaso para hacer frente eficazmente AR
sv que carecen de la LBD.
las respuestas clínicas a nuevos antagonistas potentes AR y nuevos inhibidores de la síntesis de esteroides, junto con la evidencia de la biosíntesis de andrógenos intracrina en cáncer de próstata sugieren que los conceptos del bloqueo androgénico completo debería ser revisado y perfeccionado. Un reciente estudio diseñado para atacar las múltiples pasos en la biosíntesis de andrógenos en los hombres que fallan ADT (usando hidrocortisona, el ketoconazol, un inhibidor CYP17A1, y el inhibidor de la esteroide 5-alfa-reductasa (SRD5A) dutasterida) producido disminuciones de PSA sustanciales en la mayoría de los pacientes y una duración mediana de respuesta de 20 meses. [20] Por lo tanto, la eficacia clínica puede no requerir un antagonista de AR en el contexto de la supresión más efectiva de "pre-receptor 'señalización a través de la reducción de ligandos de AR. Es importante destacar que la eficacia de la inhibición de la activación de la AR en los cánceres de próstata, ya sea a través de enfoques pre-receptor mejoradas o aquellos que se dirigen directamente a AR, varía sustancialmente entre los pacientes y los factores que contribuyen a estos resultados diferenciales son desconocidos. Por ejemplo, los ensayos de prevención que utilizan inhibidores SRD5A disminuyó significativamente la tasa de detección de cáncer de próstata localizado, pero es evidente que esta intervención no fue eficaz en la prevención de la progresión del cáncer o la detección en todos los hombres. [21], [22] Del mismo modo, han informado de los últimos ensayos clínicos de nuevos inhibidores de CYP17A1 y AR en hombres con CRPC sustanciales diferencias entre pacientes en las respuestas objetivas [23], [24].
En este estudio , hemos tratado de determinar las características específicas del tumor que influyen en la respuesta de los cánceres de próstata a la inhibición de la señalización del receptor de pre-AR, el uso de privación de andrógenos en combinación con la dutasterida inhibidor dual SRD5A. T y DHT son biológicamente ligandos de alta afinidad AR activos. Sin embargo, se requieren entre 3-10 veces mayores concentraciones de T para ejercer las mismas AR mediada por efectos transcripcionales de DHT. [25], [26] Por lo tanto, la reducción de los niveles de DHT mediante la inhibición de la conversión de T en DHT puede representar un método de pre-receptor eficaz para suprimir la magnitud total de la señalización de AR bioactivo. La hipótesis de que el efecto de la inhibición SRD5A sobre el crecimiento tumoral se asociaría con los niveles de andrógenos intra-tumorales y /o la expresión de enzimas biosintéticas de esteroides sugestivos de una dependencia relativa de crecimiento mediado por DHT. Los factores que determinan la respuesta relativa de los tumores de próstata comprobar la validez de los receptores de supresión androgénica con son desconocidos agentes tales como inhibidores SRD5A, pero podrían servir como indicadores de la eficacia de estos agentes en la prevención del cáncer de próstata, o como un componente de ADT en la enfermedad avanzada.
Materiales y Métodos
LuCaP de próstata humano xenoinjertos de cáncer
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de salud. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Uso Animal Care Center Institucional Fred Hutchinson (archivo 1775). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con isofluorano, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Las líneas LuCaP35 y LuCaP96 son xenoinjertos derivadas del paciente que se establecieron como parte del banco de tejidos Universidad de Washington, como se describe anteriormente [27], [28] y fueron seleccionados para el análisis ya que ambas líneas demuestran un crecimiento sensible a la castración en ratones machos intactos. En pocas palabras, LuCaP35 se deriva de una metástasis de ganglios linfáticos obtenidos a partir de 66 años de edad de sexo masculino caucásico con el CRPC. LuCaP96 se derivó de una resección transuretral de la próstata Gleason 9 carcinoma primario obtenido en una de 61 años varón caucásico de un mes antes de la documentación de la enfermedad resistente a la castración. Tanto en xenoinjertos de la secuencia de ADN exonic AR es de tipo salvaje (datos no mostrados).
Varón CB-17 ratones SCID (Charles River Laboratories, Wilmington MA) se implantaron subcutáneamente con 30 mm
3 piezas tumorales . Cuando los tumores alcanzaron un promedio de 300 mm
3, los ratones (n = 62 LuCaP35; LuCaP96 n = 65) fueron castrados (Cx) y asignados al azar a tratamiento con terapia de dutasterida (DUT) o vehículo de más de 8 semanas. Se administró dutasterida (PEG monolaurato (Sigma 460133) /1% de Tween 80 (Sigma P4780)) por sonda oral 5 días por semana en un volumen de 200μl. El volumen del tumor se determinó por la siguiente fórmula (longitudes largas y cortas de eje en mm): largo x (Short∧2) /2. Los tumores de un subconjunto de los ratones en cada cohorte fueron cosechadas en los momentos iniciales de tratamiento (el tamaño del tumor de $ $ 500 mm
3; rango 7-21 días). Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 750 a 1000 mg en tamaño, los animales fueron sacrificados según el protocolo institucional y los xenoinjertos cosechadas y flash congelado para la determinación de los andrógenos de tejidos y la extracción de RNA total. El número medio de días de los ratones en los grupos Cx + DUT había estado fuera de tratamiento dutasterida en cuando aparecen los tumores fueron resecados fue de 211 días para LuCaP35, y 96 días para LuCaP96. Dutasterida fue generosamente proporcionado por GlaxoSmithKline.
Todos los procedimientos que involucran seres humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington Medical Center, y todos los sujetos firmaron el consentimiento informado por escrito. Los pacientes con cáncer de próstata metastásico sometidos a autopsias rápidas bajo los auspicios de la Universidad de Washington Programa de Autopsia del Donante de cáncer de próstata como se describe anteriormente [9], [27]. Las autopsias se realizaron dentro de 4-10 horas de la muerte. Las muestras de todos los sitios tumorales metastásicas brutos se obtuvieron bajo condiciones estériles y el sitio y el volumen de las metástasis óseas y no óseo se registraron. tejido fresco se congeló rápidamente en nitrógeno líquido inmediatamente después de la cosecha y se mantiene a -80 ° C.
Mediciones de esteroides
Los niveles de andrógenos en los tejidos de xenoinjerto se determinaron por espectrometría de masas (MS), utilizando métodos que tenemos descrito. [29] Este procedimiento dio como resultado un límite inferior de cuantificación de 1 pg por muestra para la testosterona y DHT. Intra-ensayo coeficientes de variación generados usando suero humano para muestras de alta, media y gama baja fueron 3,5, 3,1 y 3,8% para la testosterona y el 6,3, el 4,3 y el 15,8% de DHT, respectivamente.
Aislamiento de ARN, RT cuantitativa -PCR e inmunohistoquímica
Las muestras se utilizan para el aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y RT-PCR cuantitativa utilizando métodos y cebadores que hemos descrito anteriormente. [9], [30] La tinción inmunohistoquímica y de puntuación para la AR y PSA se llevó a cabo como se ha descrito previamente [31], utilizando un anticuerpo anti-PSA policlonal (Dako, Inc.), un anticuerpo anti-AR dirigida a la N terminal (F36.4.1 clon, Biogenex), y un anticuerpo anti-AR dirigida en el C terminal (C-19, Santa Cruz). inmunotinciones de control negativo, sustituyendo inmunoglobulina pre-inmune de la misma especie que aquel en el que se generó el anticuerpo, no mostraron ningún producto de reacción.
Análisis estadísticos
Para evaluar las diferencias en la trayectoria del volumen del tumor, primero se determinó puntos de cambio en las curvas de crecimiento tumoral utilizando pruebas t para comparar los volúmenes tumorales secuencialmente cada dos días. Después de la segmentación de las curvas, se aplicó un modelo lineal mixto para cuantificar el efecto del tratamiento sobre el crecimiento del tumor para cada período lineal mediante la regresión del volumen del tumor de registro en días de medición, en el grupo de tratamiento, y de una interacción entre días y tratamiento mientras que la contabilidad de la variabilidad en volumen inicial del tumor a través de los ratones. Supervivencia libre de progresión en la castración frente a los ratones tratados con dutasterida + castración (definido como el tamaño tumoral & lt; 750 mm
3) se determinó mediante el análisis de Kaplan-Meier con la comparación de las curvas utilizando el rango logarítmico de Mantel-Haenszel prueba. Para predecir el tamaño aproximado de la muestra en cada grupo de tratamiento que podrían ser necesarias para detectar un efecto estadísticamente significativo de la castración más dutasteride frente a la castración solo, se utilizó caso completo remuestreo para una gama de tamaños de la muestra n = 10, 20, ..., 200 sobre 500 repeticiones de arranque. Para cada tamaño de la muestra y la réplica de arranque, nos ajustamos un modelo de riesgos proporcionales de Cox y se registró el índice de riesgo estimado y el valor p.
Para el análisis de los datos de QRT-PCR, el umbral de ciclo media (Ct) para cada gen se normalizó a la expresión de la RPL13A limpieza de genes en la misma muestra (delta Ct). La expresión media de RPL13A fue de 15,6 +/- 0,5 (media +/- SD) y 14,1 +/- 0,8 en los tumores LuCaP35 y LuCap96 respectivamente. dos pruebas t de muestras de Welch se utilizaron para comparar las diferencias en los niveles de andrógenos y las diferencias en los valores medios de delta Ct de cada gen entre los grupos de tratamiento sin corrección de múltiples ensayos. los valores & lt; P 0,05 se consideraron significativos. El cambio veces se calculó por el método Ct delta-delta (fold = 2
ΔΔCt). La prima de DCT, DDCT y doblar de cambios se presentan en los datos suplementarios.
Resultados
Los cánceres de próstata que responden a la supresión androgénica demuestran diferencias intrínsecas en los niveles basales de andrógenos intratumoral y expresión de genes androgénica
para evaluar las características del tumor asociados con la respuesta y resistencia a la terapia dirigida al AR vía, primero se determinó andrógenos intratumoral y expresión génica androgénica en xenoinjertos derivados de los pacientes de cáncer de próstata, dos LuCaP35 y LuCaP96. Estas líneas expresan AR y PSA, (Figura 1A) y responden a la castración con la regresión del tumor y la prolongación de la supervivencia libre de progresión (SLP), pero en última instancia progresan a un crecimiento resistente a la castración (p & lt; 0,0001 para ambos; Figura 1B, 1C). Notablemente, los tumores LuCaP35 y LuCaP96 resecados de ratones con función gonadal intacta mostrado una marcada diferencias en los niveles basales de andrógenos intratumorales (Figura 1D): tumores LuCaP96 tienen mayores niveles de T y niveles similares de DHT, y por lo tanto una proporción más alta de T intratumoral: DHT en comparación con los tumores LuCaP35, a 10:01 y 02:01, respectivamente (LuCaP96 T = 10,2 ± 6,5 ng /g; DHT = 0,9 ± 0,4 ng /g; LuCaP35 T = 2,6 ± 2,0 ng /g; DHT = 1,4 ± 0,8 ng /g, la Tabla S1)
(a) las muestras representativas FFPE de cada xenoinjerto se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp;. e) y para la expresión del receptor de andrógenos (AR) y PSA como se indica. La barra de escala (representado en las figuras de PSA para facilitar la visualización) son 50 micras. gráficos de Kaplan-Meier de supervivencia libre de progresión (que se define como el tamaño tumoral & lt; 750 mm
3) en ratones portadores de LuCaP35 (B) o LuCaP96 xenoinjertos (C). Los ratones SCID machos intactos se implantaron subcutáneamente con 30 mm
3 pedazos de los xenoinjertos indicados. Cuando los tumores alcanzaron ~ 300 mm
3, los ratones fueron reclutados aleatoriamente en las cohortes que se dejaron intactos (n Cx) o castrados (Cx). P-valores para las comparaciones de curvas se generaron mediante la prueba del rango logarítmico de Mantel-Haenszel. (D) Media y desviación estándar de testosterona tejido (T, barra de color negro) y DHT (barra gris) niveles medidos mediante espectrometría de masas en los tumores del xenotrasplante indicada (a pases en ratones intactos). (E) Expresión relativa de las transcripciones de los genes indicados androgénica, se calculó utilizando el método dCt delta (cambio = 2∧ddCt). Genes expresados diferencialmente en LuCaP35 vs. LuCaP96 dentro de un orden de magnitud se indican dentro de las líneas grises. Diferencias significativas (por el test t de Welch; p & lt; 0,05) se indican mediante círculos negros; círculos blancos indican los genes que no fueron significativamente diferentes entre los LuCaP35 y LuCaP96 (todos los valores dados en los datos adicionales 2) triángulos .Upward indicar expresado diferencialmente los genes altamente conducen específicamente a un aumento de T (AKR1C3, 40 veces) o el aumento de los niveles de DHT (SRD5A1, 5,0 veces ; 17BHSD10 4,8 veces; RLHSD, 99 veces). triángulos invertidos indican expresado diferencialmente los genes que median altamente específica DHT catabolismo (AKR1C2, 7 de plegado; UGT2B15, 3000 veces).
Para identificar los mecanismos que contribuyen a las diferencias basales en T intra-tumoral y las concentraciones de DHT, que evalúan la expresión específica de tumor de las transcripciones que codifican las enzimas primarias involucradas en la síntesis de esteroides y la degradación (Figura S1). Mientras que muchos genes androgénica se expresaron en LuCaP35 dentro de un orden de magnitud de su expresión en LuCaP96 (Figura 1E), varias diferencias consistentes con los diferentes perfiles de andrógenos de tumores estaban presentes. En particular, la expresión génica en LuCaP35 fue consistente con la producción de andrógenos y el mantenimiento de los niveles de DHT, lo que demuestra niveles más altos de genes de biosíntesis de esteroides tales como STAR (10 veces) y hsd3b1 (10 veces), una mayor expresión de genes que median en la producción de DHT (SRD5A1 , 5 veces; 17BHSD10 4,8 veces, RLHSD, 99 veces), y la menor expresión de los genes que median la DHT catabolismo (AKR1C2, 7 veces menores; UGT2B17, 3000 veces menor). Por el contrario, la expresión génica en LuCaP96 fue consistente con la producción y el mantenimiento de T, con niveles significativamente más altos de AKR1C3 (40 veces; en consonancia con un aumento en la producción de T de androstenediona), en combinación con niveles más bajos de SRD5A1 (la principal enzima responsable para la conversión de T en DHT en el tejido prostático neoplásica) [32] y los niveles más altos de las enzimas del catabolismo de DHT AKR1C2 y UGT2B17. (Umbrales el ciclo y doble cambios para todos los genes en la figura 1E se presentan en la Tabla S2). Dado que estos tumores se propagaron en anfitriones murinos genéticamente idénticos, estos datos identifican la variación específica del tumor intrínseco en los programas de andrógenos metabólicos que culminó con marcadas diferencias en las concentraciones intratumorales AR ligando.
Pre-receptor de supresión de andrógenos vía con la castración, más SRD5A la inhibición demuestra un impacto específico de tumor en el retraso de la progresión a la CRPC
Teniendo en cuenta la potencia de 5-10 veces más altos de DHT en la participación y la activación de AR en comparación con T, [25], [26] las estrategias dirigidas a la reducción de DHT inhibiendo metabolismo de T en DHT puede representar un método de pre-receptor eficaz para suprimir la magnitud total de la señalización de AR. Para determinar si las diferencias específicas de tumor en la relación basal de T intratumoral: DHT podría influir en la respuesta clínica a agentes de direccionamiento conversión de T en DHT, se trataron cohortes de ratones portadores de tumores LuCaP35 y LuCaP96 con la castración sola, o la castración más el inhibidor dual de SRD5A dutasterida. Los ratones SCID machos intactos se implantaron subcutáneamente con 30 mm
3 piezas de tumores LuCaP35 o LuCaP96. Después de un crecimiento de ~ 300 mm
3, los ratones fueron castrados y aleatorizados para vehículo o dutasterida se administra por sonda oral durante 8 semanas.
La media de los volúmenes tumorales en tumores LuCaP35 fueron notablemente reprimida por la combinación de la castración, más dutasterida vs. castración sola (Figura 2A). El crecimiento del tumor se produjo en tres etapas distintas tras el inicio del tratamiento: un breve período de crecimiento continuo (0-14 días), una fase prolongada de la regresión del tumor o la estabilidad (días 14-75), y una fase final de la re-crecimiento del tumor ( días 75-200). Para cuantificar mejor el impacto de la dutasterida, se compararon las trayectorias volumen del tumor en la castración o uso de grupos de castración además dutasterida usando un modelo mixto lineal aplicada a cada fase de post-tratamiento. Dutasterida más castración disminuyó significativamente el porcentaje de aumento en el volumen del tumor por día en comparación con la castración solo en la etapa inicial 'en tratamiento' (de 3,2% [95% CI 2.7 a 3.7] a 0,9% [IC 95% 0,2 a 2,0]; p & lt ; 0,0001), y el aumento del porcentaje de la regresión del tumor por día en la fase siguiente (de 1,2% [IC 95% 0,5 a 1,8] a 3,6% [IC 95% 2,0 a 5,3]; p & lt; 0,0001). Sin embargo, después de la discontinuación de la terapia, los tumores tratados con dutasterida mostraron de manera más rápida ciento re-crecimiento por día (desde el 1,1% [IC 95% 0,9-1,3] al 2,3% [IC 95% 1,8-2,9]; p & lt; 0,0001), lo que sugiere sería necesaria una terapia continuada para mantener la eficacia terapéutica.
media volúmenes tumorales en ratones portadores de LuCaP35 (a) y LuCaP96 xenoinjertos (B). Los ratones SCID machos intactos se implantaron subcutáneamente con 30 mm
3 piezas del xenoinjerto indicada. Cuando los tumores alcanzaron ~300mm
3, los ratones fueron castrados y matriculados aleatoriamente en cohortes tratadas con vehículo (Cx) o dutasterida (Cx + Dut) durante 8 semanas (indicado por línea de negro por encima del eje x). La media de los volúmenes tumorales se representan para cada grupo de tratamiento en los días indicados después de la inclusión (Cx, cuadrados negros; Cx + DUT, círculos blancos).
Por el contrario, los volúmenes tumorales en tumores LuCaP96 no fueron suprimidos por Además de dutasterida a la castración (Figura 2B), sin ningún cambio en la razón de riesgo (HR) para la SLP (HR 0,9, p = 0,97; no se muestra). Para examinar hasta qué punto la diferencia no significativa se debió a que el número de animales, que Bootstrapped partir de los datos originales 500 veces y nos pareció que incluso con n = 170 ratones por grupo de tratamiento, un modesto (HR 1.4) pero la mejoría estadísticamente significativa en la supervivencia se observó en sólo el 50% de iteraciones, lo que sugiere la probabilidad de detectar un efecto del tratamiento clínicamente significativa en un estudio más grande fue baja. En general, estas observaciones demuestran que pre-receptor de supresión de la vía de andrógenos con la castración más SRD5A inhibición puede retrasar la progresión de crecimiento resistentes a la castración. Sin embargo, esta respuesta no es universal, sino más bien parece ser específica del tipo de tumor, y se asocia con aquellos tumores que exhiben un perfil de la enzima metabólica de andrógenos dirigida a mantener los niveles de DHT intratumorales como LuCaP35, en lugar de un tumor T-predominante como LuCaP96.
el tamaño del tumor al inicio del tratamiento influye en la respuesta a largo plazo a la supresión de andrógeno más SRD5A inhibición
para examinar más a fondo las características del tumor asociados con la respuesta a pre-receptor de inhibición vía AR, determinamos si la respuesta al tratamiento estaba relacionada con el tamaño del tumor al inicio del tratamiento. Aunque el estudio fue diseñado para comenzar el tratamiento a un volumen tumoral de ~ 300 mm
3, la logística de los experimentos con animales dieron lugar a una variación medible en el tamaño del tumor al inicio del estudio. Arbitrariamente agruparon los tumores en cohortes de & lt; 250 mm
3, 250-400 mm
3, y & gt; 400 mm
3 en la inscripción y comparó el efecto de la castración frente a la castración, más dutasterida dentro de cada grupo . En particular, la mejora significativa en la supervivencia media impartida por dutasterida en toda la cohorte LuCaP35 (de 152 a 337 días, HR para la progresión 2,8 [95% CI 1.4 a 4.6], p = 0,0015; Figura 3A), apareció predominantemente causa de un impacto en tumores que eran más pequeño (& lt; 250 mm
3) en el momento de la inscripción (CRI de evolución de 7,3 [IC del 95%: 2,2 a 30], p & lt; 0,0015, frente a la castración solo; Figura 3B). Por el contrario, la combinación de la castración, más de 8 semanas de dutasterida hicieron impacto no estadísticamente SLP en tumores de 250-400 mm
3 o & gt; 400 mm
3 en la inscripción (no se muestra); Sin embargo, esto puede reflejar la disminución del poder asociado con el post-hoc sub-clasificación de los grupos
gráficos de Kaplan-Meier de supervivencia libre de progresión. (definido como el tamaño tumoral & lt; 750 mm3) en todos los tumores tratados con LuCaP35 la castración sola (Cx) frente a la castración + dutasterida (Cx + Dut) (a), y en los tumores matriculados en el tratamiento cuando los tumores eran & lt; 250 mm
3 (B). P-valores para las comparaciones de curvas se generaron mediante la prueba del rango logarítmico de Mantel-Haenszel. La media de las curvas de crecimiento del volumen del tumor en los días indicados después de la inclusión en los tumores LuCaP35 matriculados en el tratamiento cuando los tumores eran & lt; 250 mm
3 (C), entre 250-400 mm
3 (D), y & gt; 400 mm
3 (E). el tratamiento con dutasterida se continuó durante 8 semanas (indicado por la línea de negro por encima del eje x) en el grupo de la castración + dutasterida.
La inspección de las curvas de volumen del tumor sugiere un efecto supresor de dutasterida se mantuvo incluso después de la interrupción del La terapia para los tumores & lt; 250 mm
3 en la inscripción (Figura 3C). Por el contrario, el crecimiento tumoral se suprimió en relación con la castración en los tumores & gt; 250 mm
3 en la inscripción (Figura 3D, 3E), pero sólo mientras que los tumores estaban bajo terapia. Después de la interrupción, el tamaño del tumor en estas cohortes alcanzó a los tumores tratados con castración solo, de modo que en última instancia se observó ninguna diferencia en la supervivencia. El volumen del tumor de partida no se asoció con la supervivencia en tumores tratados con dutasterida LuCaP96 (no se muestra).
supresión androgénica sistémica además la inhibición SRD5A disminuye significativamente los niveles de DHT tumoral en comparación con la supresión androgénica solo
Para determinar si el impacto diferencial de la inhibición SRD5A sobre el crecimiento tumoral refleja una diferencia en la supresión de andrógenos intratumorales, que mide los niveles de T y DHT en los tumores resecados después del tratamiento. En ambos tipos de tumores y LuCaP35 LuCaP96, los niveles de DHT tumor medido en 3-21 días (indicado por las flechas de dos cabezas en la figura 4A y 4B) eran sustancialmente más bajos en la castración, más dutasterida versus los grupos de castración por sí solos, con valores en LuCaP35 suprimidas de 0,40 ± 0,56 ng /g a 0,02 ± 0,04, p = 0,007, y en LuCaP96 de 0,10 ± 0,08 ng /g a 0,02 ± 0,01, p = 0,005 (que se resumen en la Tabla S1).
testosterona tisular (t , barras negras) y los niveles de DHT (barras grises) se midieron por espectrometría de masas en LuCaP35 (a) y LuCap96 (B) los tumores resecados de ratones intactos (No Cx), y de ratones tratados con castración solo (Cx) o castración + dutasteride (Cx + Dut) en puntos de tiempo tempranos (d3-21, mientras que todavía en la terapia, indicada por flechas de doble punta), o al re-crecimiento resistente a la castración (definido como & gt; 750 mm
3). Los valores de p calculado a partir de la prueba t de dos muestras de Welch (p & lt; 0,05 se consideraron significativos). estrellas individuales indican una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de DHT entre Cx Cx vs + Dut muestras tratadas en d3-21 del tratamiento. las estrellas dobles indican una diferencia significativa en los niveles de DHT entre las muestras Cx Cx vs + Dut tratados, incluso después de re-crecimiento castración recurrente. No hay otras comparaciones entre los grupos tratados en comparación con Cx Cx + DUT fueron significativas. Expresión de longitud completa AR (FL) y la AR variante 7 (ARV7) variante de empalme truncada se midió en LuCaP35 (C) y LuCaP96 (D) en el momento de re-crecimiento del tumor a 750 mm
3. transcripción de expresión se midió por qRT-PCR y se normalizó a la expresión de la RPL13A limpieza de genes dentro de cada muestra para obtener el umbral de ciclo delta (DCT). La diferencia relativa en la expresión entre los grupos de tratamiento indicados se calculó utilizando el método dCt delta (cambio = 2∧ddCt). Los valores de p calculados a partir de la prueba t de dos muestras de Welch (p & lt; 0,05 se consideró significativo) guía empresas
Curiosamente, mientras que los niveles de testosterona en los tumores LuCaP35 permaneció suprimida en los grupos de tratamiento (Figura 4A, barras negras), la DHT. niveles en los tumores recurrentes LuCaP35 después de la terapia combinada (un promedio de 211 días después de la interrupción de dutasterida) fueron similares a los tumores recurrentes después de la castración sola (0,54 ± 0,46 ng /g y 0,61 ± 0,63 ng /g, respectivamente; barras grises). Por el contrario, los niveles de DHT en Lucap 96 tumores recurrentes terapia después combinado (promedio de 96 días después de la interrupción de dutasterida) permaneció suprimida meses después del cese de la dutasterida (Figura 4B, 0.04 ± 0.04 ng /g en comparación con 0,53 ± 0,46 ng /g para la castración sola ), mientras que los niveles de T mostraron la reconstitución significativa después de la castración, ya sea solo o después de la terapia combinada (1,34 ± 0,89 ng /g y 0,79 ± 0,71 ng /g, respectivamente, y el cuadro S1). De la nota, la vida media de dutasterida en ratones es de menos de 2 días, [33] que excluyen un efecto residual de la inhibición SRD5A en las concentraciones de esteroides en 96 frente a 35 tumores en el momento de la resección. los niveles de andrógenos tumoral en tumores LuCaP35 en el momento de re-crecimiento no se asociaron con el tamaño del tumor al inicio del estudio (datos no mostrados).
La tendencia a la reconstitución de los niveles de DHT en LuCaP35 y de T en LuCaP96 es consistente con la variación intrínseca en los programas de andrógenos metabólicos que favorecen DHT vs. T identificados en los tumores no tratados (Figura 1E). Además, la expresión relativa de genes androgénica en LuCaP35 contra tumores LuCaP96 recurrentes después de la castración vs. castración más dutasteride era muy similar a los patrones de expresión observados en los tumores no tratados (Figura S2). En conjunto, estos datos muestran que la dutasterida inhibe eficazmente la producción de DHT en ambos tipos de tumores, y que el crecimiento tumoral LuCaP35 es susceptible a la mayor supresión de pre-receptor de DHT logrado con la combinación de castración más SRD5A inhibición, mientras que LuCaP96 no lo es.
supresión androgénica sistémica además de la inhibición SRD5A se asocia con diferencias específicas del tipo de tumor en la inducción de la AR longitud completa y empalme AR variantes
tumores de próstata resistente a la castración se caracterizan frecuentemente por aumento de la expresión de larga duración AR ( AR
FL), y como informó recientemente, por el aumento de expresión de AR
sv que carecen de los LBD y, en consecuencia conferir actividad AR independiente de ligando constitutiva. Las diferencias en la AR
FL y AR
sv niveles pueden contribuir a la variación en las respuestas de crecimiento tumoral tras la supresión de ligando pre-receptor. Por lo tanto, se evaluó la expresión de AR
FL y el AR prevalente
sv identificado en muestras CRPC humanos, AR
V7 (que codifica la misma proteína que AR
V3) en tumores LuCaP35 y LuCaP96 recurrente después de ADT y dutasterida [13], [14], [16], [17], [34].
en comparación con los tumores extirpados de los ratones intactos, tumores recurrentes después de la castración LuCaP35 o después de la castración, más dutasterida demostraron una aumento de 2.0 veces en la expresión de AR
FL, y sin aumento de AR
V7 (Figura 4C, y la Tabla S3). Por el contrario, mientras que los tumores LuCaP96 recurrente después de la castración sola demostró una 1,9 veces similares aumento de expresión de AR
FL, sino que también mostró un aumento de 10 veces sustancial en la expresión de AR
V7 (Figura 4D).