Extracto
MITOSTATIN
, un nuevo gen supresor tumoral putativo inducida por la sobreexpresión decorina, se expresa en la mayoría de los tejidos humanos normales, pero es notablemente las reguladas en etapas avanzadas de la vejiga carcinomas mamarios y . Mitostatin afecta negativamente el crecimiento celular, induce la muerte celular y regula la expresión y activación de los niveles de Hsp27. En este estudio, hemos demostrado que la expresión ectópica de Mitostatin en PC3, las células de cáncer de próstata DU145, LNCaP y no sólo indujo una reducción significativa en el crecimiento celular, sino que también inhibe la migración y la invasión. Por otra parte, Mitostatin inhibió la formación de colonias en agar blando de PC3 y las células LNCaP así como tumorigenicidad de células LNCaP en ratones desnudos. Por el contrario, la orientación Mitostatin endógena de siRNA y las estrategias anti-sentido en PC3 y DU145 células de cáncer de próstata mejora del fenotipo maligno en ambas líneas celulares. De acuerdo de estas funciones anti-oncogénicos, descubrimos que Mitostatin estaba ausente en ~ 35% (
n
= 124) de las muestras de tumor de próstata y su reducción global se asoció con estadios avanzados de cáncer. En conjunto, nuestros resultados indican que
MITOSTATIN
pueden actúa como un gen supresor tumoral en el cáncer de próstata y proporcionar un mecanismo celular y molecular novela debe ser más explotado y descifrado en nuestra comprensión de la progresión del cáncer de próstata.
Visto: Fassan M, D'Arca D, J Letko, Vecchione A, Gardiman MP, McCue P, et al. (2011) Mitostatin es el regulado en el cáncer de próstata humano y suprime el fenotipo de las células invasiva del cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (5): e19771. doi: 10.1371 /journal.pone.0019771
Editor: Hava Karsenty Avraham, el Beth Israel Deaconess Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 31 Enero, 2011; Aceptado: 4 Abril 2011; Publicado: 6 Mayo 2011
Derechos de Autor © 2011 Fassan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Sidney Kimmel para la Investigación del cáncer, el fondo del cáncer de vejiga Perkins Benjamin y el Fondo Greitzer Martin (RB), los Institutos nacionales de Salud subvenciones RO1 CA39481, RO1 CA47282 y RO1 CA120975 (para RVI), SR1 DK068419 (AM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la principal causa de muerte por cáncer en hombres en los países más desarrollados, y la neoplasia maligna más común en los hombres estadounidenses. En los Estados Unidos, uno más de ocho hombres desarrollará cáncer de próstata durante su vida y se espera que más de 27.360 hombres morirán de la enfermedad este año [1].
mutaciones estudios de genética molecular del cáncer de próstata han identificado, supresiones o la pérdida de genes supresores de tumor expresión en subconjuntos de pacientes con cáncer de próstata [2]. Sin embargo, debido a la heterogeneidad de sí mismo y de la naturaleza focal de las alteraciones de genes supresores de oncogén /tumor de cáncer de próstata, el papel de estos genes en la aparición del cáncer de próstata y el valor diagnóstico y /o pronóstico de tales alteraciones de los genes sigue siendo incierto [2].
la pérdida de heterocigosidad (LOH) señala la presencia de genes supresores en regiones cromosómicas específicas en los tumores. Varios estudios informaron allelotyping la porción telomérica del cromosoma 12 se va a eliminar en una variedad de tumores sólidos [3] -. [11], incluyendo el cáncer de próstata [12]
MITOSTATIN
es una novela putativo gen supresor de tumor localizado en 12q24.1 [13] - [15] recientemente caracterizado en nuestro laboratorio [13]. Hemos demostrado previamente que esta proteína decorina inducida por 62-kDa se expresa en la mayoría de los tejidos humanos; que afecta el crecimiento de células de cáncer de próstata y la muerte celular mediante la regulación del nivel y la activación de Hsp27 [13]. También hemos analizado mediante técnicas de inmunohistoquímica la expresión de Mitostatin en una serie de tumores de vejiga y mama primarios, y se observó una reducción de los niveles de proteína Mitostatin en etapas avanzadas del tumor. Además, Kim y sus colegas han identificado recientemente una mutación de desplazamiento de marco de
MITOSTATIN
gen en un carcinoma gástrico con la inestabilidad de microsatélites [14].
Aunque la función biológica de Mitostatin en los cánceres de próstata no es todavía caracterizado, su relación con decorina y Hsp27 sugiere un papel para Mitostatin en el desarrollo del cáncer. Para estudiar la función supresora de tumores de Mitostatin en cáncer de próstata, que sobreexpresado y empobrecidos, la proteína endógena Mitostatin por las estrategias antisentido y siRNA en líneas celulares de cáncer de próstata derivados.
En este estudio, nos proporcionan la primera evidencia de un papel de Mitostatin en la inhibición de la migración celular, la invasión y la tumorigenicidad de células de cáncer de próstata. Además, nuestros datos indican que Mitostatin es el regulado en los cánceres de próstata humana en etapa avanzada. Por lo tanto, Mitostatin podría actuar como un gen supresor tumoral clásico y el análisis de su expresión puede resultar un marcador clínico útil para el diagnóstico y el pronóstico de este tipo de cáncer humano común.
Resultados
Mitostatin de expresión en Las células del cáncer de próstata Inhibe la formación de colonias
Como una primera aproximación para establecer la expresión Mitostatin en la próstata se utilizó extractos celulares a partir de células de la próstata catorce derivado diferentes, incluyendo tanto las células prostáticas normales y malignas. Uso de inmunotransferencia con un anticuerpo específico Mitostatin-[13], descubrimos que todas las líneas celulares analizadas, pero uno (
es decir
:. 1542CP
3TX), expresada proteína Mitostatin a diversos niveles (Figura 1A). En particular, las células LNCaP muestran la expresión más alta y 1532CP
2TX mostraron un nivel apenas detectables de Mitostatin endógena (Figura 1A). Es de destacar que 1542NPTX células, que expresan Mitostatin, son la contraparte "normales" de los
células malignas Mitostatin-negativas 1542CP 3TX
A:. Western blot: Mitostatin se expresa diferencialmente en células de cáncer de próstata humana líneas. La carga de proteína fue confirmada por reprobing la membrana con anticuerpo de beta-actina. B: transferencias de Western que muestra la expresión de Mitostatin en PC3, DU145 y líneas celulares LNCaP utilizados en este estudio
A continuación, nos hemos centrado en la investigación de la función biológica de Mitostatin en células de cáncer de próstata PC3 por transfección de forma estable. y las células LNCaP con una construcción de expresión de cDNA Mitostatin V5-etiquetados y células PC3 y DU145 con una construcción de ADNc antisentido. También colocamos la secuencia de codificación Mitostatin en un vector retroviral auto-inactivación bajo el control de un promotor inducible Drosophila HPS70 para infectar las células DU145. Se obtuvieron cinco clones de forma estable sobre-expresión de Mitostatin (PC3 B2, DU145 Mitostatin, LNCaP B1A, LNCaP y LNCaP B3A A3A) y dos clones que mostraron disminución de los niveles de proteína Mitostatin endógeno (PC3 y DU145 M2 M2) (Figura 1B). En tres ensayos de formación de colonias independientes, todas las líneas celulares Mitostatin sobreexpresan mostraron una disminución en el número y tamaño de las colonias después de 15 días (Figura 2 A-C), en comparación con ya sea el parental o las células transfectadas-V5. DU145 Mitostatin, que es también el clon con la expresión más alta de Mitostatin comparación con la expresión celular parental (4,2 veces de incremento, cfr Figura 1B), mostró la mayor inhibición de la formación de colonias (Figura 2 B). De interés, las células que expresan una construcción antisentido Mitostatin mostraron bien un número similar (DU145 M2, Figura 2 B) o superior (PC3 M2, figura 2A) de las colonias en comparación con las células transfectadas parentales o simuladas.
Mitostatin sobre-expresión en cáncer derivado líneas celulares de próstata [PC3, a; DU145, B; y LNCaP, C] se redujo la capacidad para formar colonias después de 15 días, mientras que las células con depleción de la proteína endógena Mitostatin mostraron una similar (DU145 M2) o superior (PC3 M2) el número de colonias en comparación con células parentales. Columnas, promedio por plato a partir de experimentos por triplicado;
bares, SEM. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
Mitostatin La sobreexpresión inhibe la migración de células de cáncer de próstata
Está bien establecido que la decorina y Hsp27 participan en la celda migración. El primero ha sido demostrado que ejercen un efecto anti-migratoria en diversas líneas celulares que involucra diferentes vías de señalización [16] - [19], mientras que el segundo está implicado en la reorganización de la actina cuando las células forman lamellipodia [20]. Ya que anteriormente hemos descubierto Mitostatin en las células de decorina-sobre-expresión y ha demostrado que Mitostatin inhibe la expresión y la fosforilación de Hsp27 en líneas celulares de cáncer de próstata [13], hemos tratado de determinar si Mitostatin puede regular la migración celular en células de cáncer de próstata. En consecuencia, se realizó
in vitro
ensayos de migración utilizando los diversos Mitostatin con sobreexpresión o empobrecido-Mitostatin las células del cáncer de próstata. En todas las líneas celulares ensayadas, Mitostatin sobre-expresión inhibe la capacidad de las células para migrar (Figura 3A), indicando que Mitostatin regula negativamente la migración de las células de cáncer de próstata. En Mitostatin-sobre-expresión de los clones LNCaP el efecto inhibidor de Mitostatin sobre la migración se correlaciona directamente con la cantidad de proteína (
es decir
:. Clon A3A LNCaP con la más alta expresión Mitostatin fue el más lento en el ensayo de migración). Por el contrario, las células de cáncer de próstata en el que endógena Mitostatin se redujo reguladas por cualquiera de estas estrategias antisentido (PC3 y DU145 M2 M2) o Mitostatin siRNA (células PC3) mostraron aumento de la motilidad celular (Figuras 3A).
y sobre B: Mitostatin sobre-expresión de los clones demostraron una reducción de las propiedades migratorias en comparación con las células parentales. La migración se evaluó mediante la migración (A) y los ensayos de curación de heridas (B). Las células con baja regulación de la proteína endógena Mitostatin (PC3 M2, PC3 Mitostatin shRNA y DU145 M2) mostraron un comportamiento maligno aumentado. Los datos se expresan como porcentaje de la migración
frente
células parentales.
Columnas
, imágenes representativas de los triplicados de tres experimentos independientes;
bares, SEM. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
A continuación, se determinó la capacidad de los Mitostatin para inhibir la migración de células de cáncer de próstata utilizando un
in vitro
"wound- la curación "ensayo de la motilidad [21]. En contraste con las células parentales y las células control PC3 V5 (datos no mostrados), las células PC3 B2 sobre-expresión de Mitostatin mostró una disminución sustancial en la migración en el área denudada, tanto a las 4 y 8 horas después de la herida (Figura 3B). Se realizó el mismo experimento en las células LNCaP y DU145 y observó que en todas las líneas celulares. Esencialmente, Mitostatin sobre-expresión induce una disminución de la motilidad celular en comparación con las células parentales o transfectadas simuladas (datos no mostrados).
Mitostatin sobreexpresión inhibe la adhesión Invasion and Cell
La adquisición por las células cancerosas de un fenotipo invasivo es un paso crítico para la progresión tumoral. filtros de Matrigel recubiertos son ampliamente utilizados para examinar la migración invasiva a través de una matriz extracelular tridimensional [21]. En consecuencia, se realizó
in vitro
invasión ensayos que evalúan la capacidad de las células de cáncer de próstata para invadir a través de Matrigel en medio que contiene suero al 5%. Mitostatin sobre-expresión inhibe la invasión celular en todas las líneas celulares ensayadas (Figura 4A). En LNCaP que sobreexpresan clones el efecto inhibidor de la proteína sobre la migración se correlaciona directamente con la cantidad de proteína (LNCaP A3A tenía la capacidad de invadir más bajo). Por otra parte, se observó un aumento de la invasión de células PC3 en M2 y M2 clones antisentido DU145 y PC3 células Mitostatin siRNA
A:. Mitostatin inhibe las propiedades invasivas de las células del cáncer de próstata. Las células con baja regulación de la proteína endógena Mitostatin (PC3 M2, PC3 Mitostatin shRNA y DU145 M2) mostraron un comportamiento maligno aumentado. B: Mitostatin sobreexpresión afecta la capacidad celular para adjuntar a la laminina. Los datos se expresan como porcentaje de la migración
frente
células parentales.
Columnas
, imágenes representativas de los triplicados de tres experimentos independientes;
bares, SEM. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
La adhesión a la matriz extracelular es una característica intrínseca de un fenotipo invasivo y metastásico y células que migran forman adjuntos transitorios a la matriz extracelular. En particular, la laminina-1 es el componente principal de Matrigel. Por lo tanto, hemos realizado ensayos de adhesión y se sembraron las distintas células de cáncer de próstata Mitostatin sobreexpresan o empobrecido-Mitostatin sobre placas recubiertas con laminina. Las células se dejaron adherir a la laminina durante 2 horas y después se calculó el número de células unidas. El número de células que se adhirieron a la laminina fue significativamente menor en las células que sobre-expresan Mitostatin en comparación con células parentales en DU145 y líneas celulares PC3 (Figura 4B), indicando que Mitostatin inhibe la adhesión celular a la laminina. De acuerdo con esta conclusión, las células PC3-agotado Mitostatin mostraron un aumento de la capacidad de adherirse a la laminina (Figura 4B). Por otro lado, la ausencia de diferencias significativas en la adhesión celular a la laminina observado en las células LNCaP podría explicarse en parte por su capacidad adhesiva baja documentada
in vitro
[22], [23].
en conjunto, nuestros resultados sugieren que Mitostatin no sólo inhibe la capacidad migratoria de las células de cáncer de próstata, sino también la capacidad de invadir una matriz tridimensional compleja, como Matrigel, y para adherirse a sustratos laminina.
Mitostatin la sobreexpresión inhibe el crecimiento independiente del anclaje y la tumorigenicidad
Para investigar más a fondo la hipótesis de que Mitostatin puede desempeñar un papel directo en la carcinogénesis de próstata, se realizaron ensayos de crecimiento independiente de anclaje y un
in vivo
tumorigenicidad Los ensayos en ratones desnudos. células PC3 B2 con alta expresión Mitostatin no forman colonias, mientras que PC3 M2 con bajo nivel Mitostatin mostró un aumento del número de colonias (Figura 5A). Además, la mayoría de las colonias en los PC-3 M2 células eran más grandes que los de las células de control (datos no mostrados). En las células LNCaP (Figura 5A-B), la reducción en el número y la dimensión de las colonias directamente correlacionados con los niveles de expresión Mitostatin
A:. Los datos a partir de cultivos por triplicado de PC3 y LNCaP parental, y V5 clones PC3, PC3 B2, PC3 M2, LNCaP V5, LNCaP B1A, LNCaP B3A, y LNCaP A3A chapada en agar blando generar colonias más grandes de 0,2 mm de diámetro. Clones que sobre-expresan Mitostatin mostraron una disminución de la capacidad de formar colonias, mientras que el clon Mitostatin regulada hacia abajo, PC3 M2, mostró un mayor número de colonias en comparación con células parentales. Se contaron las colonias después de 21 días. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01. B: colonias representativas de los padres células LNCaP (izquierda), LNCaP B1A (en el centro), y LNCaP A3A (derecha) se muestran después de 21 días (aumento x 200) guía
In vivo
experimentos mostraron que los xenoinjertos derivados de las células Mitostatin-sobre-expresan LNCaP fueron significativamente menores que las provocadas por las células de los padres LNCaP y LNCaP células de control V5 (Figura 6A-B). Los tumores derivados de LNCaP y LNCaP B1A B3A alcanzaron un volumen medio de 50% y 25% más pequeño que los tumores derivados de células parentales. El análisis inmunohistoquímico de los tumores y de inmunotransferencia embebidos en parafina análisis de xenoinjertos de tumores congelados (Figura 6C-D) mostró una expresión de alto Mitostatin en LNCaP y LNCaP B1A b3a xenoinjertos, en comparación con el nivel basal de expresión se muestra en la Mitostatin células parentales. Mitostatin expresión en las células transfectadas se confirmó adicionalmente mediante análisis inmunohistoquímico usando la etiqueta de anticuerpos anti-V5 (Figura 6C)
A:. xenoinjertos establecidos por sub inyección cutánea de LNCaP, LNCaP V5, LNCaP B1A y las células LNCaP en b3a atímicos (BALB /c
nu /nu
) se cultivaron durante 65 días. B: El volumen del tumor en los animales inyectados con células que sobreexpresan Mitostatin fue marcadamente disminuyó en comparación con los tumores en los animales inyectados con células de control. El gráfico ilustra la distribución de tamaños de los tumores formados en ratones BALB /c
nu /nu
ratones a través de 65 días. *:
P Hotel & lt; 0,05. C, D: inmunohistoquímica e inmunoblot análisis de la expresión Mitostatin en LNCaP y xenoinjertos de tumores derivados. La inmunohistoquímica se realizó utilizando tanto anti-V5 (paneles superiores) y anti-Mitostatin (paneles inferiores) anticuerpos. Barra de escala:. 50 micras
En conjunto, estos hallazgos indican que Mitostatin está directamente involucrado en una forma dependiente de la dosis en el control de uno de los más poderosos
in vitro
propiedades de las células malignas , como el crecimiento independiente del anclaje, así como
in vivo
tumorigenicidad. Por lo tanto, Mitostatin es un regulador negativo clave del fenotipo transformado en el cáncer de próstata.
Mitostatin expresión está disminuida en los carcinomas de próstata avanzado
Hemos demostrado recientemente que Mitostatin se expresa de forma ubicua en tejidos humanos normales, pero sus niveles se atenúan notablemente en los estadios avanzados de mama y cánceres de vejiga [13]. Para investigar la expresión Mitostatin en los cánceres de próstata, se evaluó por QRT-PCR análisis 10 muestras de cáncer y normales de la misma mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC) tres microarrays de tejidos compuestas de 293 especímenes, incluyendo 124 cánceres de próstata y 43 homólogos normales. Mitostatin niveles de mRNA fueron significativamente las reguladas en la contraparte canceroso (Figura 7A;
P = 0,029
). Estos datos se confirmó además por IHC. Mitostatin se expresa principalmente en el citoplasma de la capa de células basales del epitelio de próstata normal (Figura 7B) y se observó una fuerte positividad en el llamado atrofia de la glándula prostática (Figura 7C). Todas las lesiones pre-neoplásicas (
es decir
: PIN) mostraron una leve a moderada Mitostatin inmunotinción (Figura 7D), mientras que la mayor parte del adenocarcinoma mostraron sea muy focal (Figura 7E, F) o ninguna tinción en absoluto ( la Figura 7G). Como era de esperar, las células musculares y el endotelio de los vasos sanguíneos mostraron una positividad moderada Mitostatin. De interés, cinco casos neoplásicas tenían positividad exclusivamente nuclear. En total, 44 de las 124 muestras de tumor eran totalmente negativo (~ 35%), 65 mostraron una positividad leve a medio (52,4%) y sólo 15 muestras mostró fuerte positividad Mitostatin (12,1%). En el análisis univariante, una disminución de la puntuación de inmunohistoquímica Mitostatin correlacionado con las fases del tumor (
P = 0,046
), aumento pT (
P = 0,040
), y el volumen del tumor (
P =
0,045). No hay parámetros clínico-patológicos como resultado de forma independiente estadísticamente significativo asociado a Mitostatin expresión en el análisis multivariante. . Estos resultados corroboran la idea de que la pérdida de Mitostatin través de mutaciones o degradación de la proteína podría contribuir a la progresión del cáncer de próstata en la medida en las muestras de cáncer de próstata evaluadas anteriormente se derivan de los pacientes con cáncer de próstata avanzado
R: pliegue relativa de los niveles de mRNA Mitostatin en muestras de tejido de próstata normal (n, negro), y Gleason muestras de cáncer de próstata 7 (K, gris brillante). Mitostatin mostró una baja regulación consistentes en tejidos de cáncer (
P = 0,029
). Columnas, imágenes representativas de los triplicados; bares, Dakota del Sur. B-G: La detección inmunohistoquímica de Mitostatin en la próstata humana. proteína Mitostatin se localiza en el citoplasma de normal (B) y las glándulas prostáticas atrófica (C). Se observaron niveles más altos de proteína Mitostatin en PIN lesiones (D) y en algunos tumores (E). F: Además de una tinción débil, Mitostatin fue también detectado en los núcleos en algunos casos de adenocarcinoma. G: expresión Mitostatin está presente en una glándula atrófica (flecha negro) en contraste con las glándulas neoplásicas negativos de los alrededores. Barra de escala: 50 micras
Discusión
Aunque el cáncer de próstata es uno de los tumores malignos más comunes, se sabe muy poco sobre los mecanismos moleculares que determinan la transformación maligna del epitelio prostático.. Durante la progresión del cáncer de próstata, las células tumorales se hacen más móviles y adquieren capacidad invasiva. La mayoría de las muertes por cáncer de próstata no se deben a que el tumor primario, sino más bien a metástasis secundarias a órganos distantes. Por esta razón, es de importancia fundamental para estudiar los mecanismos que impulsan la invasión del cáncer de próstata y metástasis. El 12q región cromosómica se ha demostrado que ser eliminado en una gran variedad de tumores sólidos avanzados [3] - [12], por lo tanto, lo que sugiere la presencia, en esta región, de uno o más genes supresores de tumores implicados en el proceso de progresión del cáncer.
Hemos identificado previamente el gen Mitostatin, localizado en 12q24.1, en el proceso de detección de genes de crecimiento detenido inducidos por la decorina proteoglicanos ricos en leucina [13]. Decorina es un miembro de la pequeña familia de genes de proteoglicanos ricos en leucina que recientemente se ha convertido en un foco en varias áreas de la investigación del cáncer [20]. Esta proteína soluble está implicada en una serie de procesos celulares, incluyendo el montaje de la matriz, la fibrilogénesis, y el control de la proliferación celular [18], [24] - [33]. La decorina se ha demostrado que inhibe la migración [16] - [19], [34], invasión [18], y la tumorigenicidad [19], [29], [33], [35], [36] de una amplia variedad de células transformadas. Por otra parte, la decorina induce la apoptosis a través de la activación de caspasa-3 [36], [37]. Por lo tanto, es plausible, que las proteínas de decorina inducida podrían ser efectores de la acción supresora de tumor de este proteoglicano.
Hemos demostrado anteriormente que Mitostatin se expresa de forma ubicua en tejidos humanos normales. Sin embargo, sus niveles de proteína se atenúan notablemente en los estadios avanzados de mama primario y neoplasias uroteliales [13]. Además, demostró que Mitostatin sobre-expresión afecta negativamente el crecimiento celular e induce la muerte celular en líneas celulares de cáncer de vejiga [13], lo que sugiere que Mitostatin podría comportarse como un gen supresor de tumor clásica en otras formas de malignidad. En el presente estudio se utilizaron tres líneas celulares de carcinoma de próstata ampliamente utilizado, a saber, PC3 y las células resistentes a la castración DU145, y las células dependientes de andrógenos LNCaP, y transgénico utilizado y la estrategia inmunológica para identificar la función de Mitostatin en estas células. Nuestros resultados confirmaron nuestra predicción de Mitostatin que pertenece a la familia de genes supresores de tumores en la medida en la sobreexpresión de la formación de colonias inhibido Mitostatin, mientras que la supresión de endógeno Mitostatin hizo que los efectos opuestos.
migración celular y la invasión son componentes fundamentales de la metástasis de células tumorales . Como aumento de la migración celular y la invasión son características del fenotipo metastásico, y por lo tanto una medida de la agresividad, el estudio actual proporciona resultados que implican Mitostatin como una proteína importante para la determinación de un fenotipo celular agresiva. De hecho, Mitostatin sobre-expresión de los clones mostró una disminución significativa en la motilidad, y
viceversa fotos: por la regulación negativa endógena Mitostatin, ya sea con estrategias de siRNA antisentido o que desencadenó el resultado opuesto. Un papel directo en la promoción de Mitostatin la migración celular es también evidente en nuestros estudios de cicatrización de heridas, confirmado en todas las líneas celulares analizadas.
Nuestros resultados demuestran que Mitostatin regula tanto la motilidad celular y la capacidad de las células de cáncer de próstata para invadir a través de una matriz 3D a través de un mecanismo aún no se ha dilucidado. Mitostatin altera las propiedades de adhesión celular a la laminina, que es el primer paso necesario para invadir la membrana de Matrigel. Este hallazgo es consistente con el papel que desempeña la decorina como un regulador negativo de la adhesión celular a la laminina [19]. Otros genes supresores de tumores han sido demostrado que afectan a múltiples características células cancerosas (migración, invasión, crecimiento, predisposición a estímulos apoptóticos) que actúa sobre importantes complejos de proteínas celulares [38] - [40]. Por lo tanto, nuestros esfuerzos futuros se centrarán en la identificación de los socios de la proteína Mitostatin y en el estudio de las posibles señales implicadas en la cascada Mitostatin biología.
Para investigar un posible papel directo en la transformación de Mitostatin células de la próstata se realizaron ensayos de crecimiento independiente de anclaje y un
in vivo
tumorigenicidad en ratones desnudos. Ambos estudios confirmaron el papel de Mitostatin como un regulador negativo de la transformación. En ambos experimentos expresión Mitostatin correlaciona bien con la agresividad de las células cancerosas.
En este estudio se observó una reducción en la expresión Mitostatin en dos líneas celulares de cáncer de próstata (derivado 1542CP
3TX y 1532CP
2TX ; 16,7% de las líneas celulares de cáncer de derivados) y en ~ 35% de una serie de 124 cánceres de próstata. De interés, en muestras normales, la capa epitelial prostática superior fue consistentemente negativos para epítopos Mitostatin, mientras que la capa inferior mostró una fuerte positividad, lo que sugiere la presencia de un compromiso celular diferente en la expresión Mitostatin. A positividad fuerte siempre se observó en el llamado atrofia de la glándula prostática (un proceso común típicamente, pero no se encuentra exclusivamente en pacientes de mayor edad), mientras que se observó una positividad moderado en todas las lesiones pre-neoplásicas, con una disminución en el cáncer de próstata más avanzado etapas. En los tumores de próstata primarios, Mitostatin baja regulación se asoció estadísticamente con etapas avanzadas del tumor y el aumento de tamaño (o extensión directa) del tumor primario en el examen patológico (
es decir
: PT), lo que confirma nuestra observación anterior en la mama y cáncer de vejiga [13]. Estos resultados sugieren que la baja regulación de Mitostatin durante las últimas etapas de la tumorigénesis de próstata podría promover la progresión del cáncer. No se encontró ninguna correlación entre la expresión Mitostatin y otros parámetros clínicos utilizados para evaluar el mal pronóstico del cáncer de próstata, tales como el grado de Gleason, aunque este punto aún no se ha investigado en una serie mayor de casos.
En conclusión, la Este estudio proporciona la primera evidencia de que Mitostatin podría desempeñar un importante papel como supresor tumoral en el desarrollo de tumores de próstata y la progresión a través de sus efectos inhibidores sobre la migración celular, invasión, crecimiento independiente de anclaje, y
in vivo
tumorigénesis. Por otra parte, el nivel de Mitostatin disminuye en etapas avanzadas de cáncer de próstata primarios. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la hipótesis de que Mitostatin actúa como un
de buena fe
supresor de tumores y sugieren que más investigaciones de Mitostatin como un marcador clínico útil para el diagnóstico y el pronóstico de los tumores de próstata están garantizados.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y Generación de clones estables
líneas celulares de cáncer de próstata derivada 2220, 2221, 11609, 11610, 11611, TSUP, 1532CP
2TX, 1535CP
1TX, 1542CP
3TX, LNCaP, DU145 y PC3 y de próstata inmortalizada líneas celulares derivadas normales 1535NPTX, y 1542NPTX se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se mantuvo como se recomienda. Las células se transfectaron como se describe anteriormente [13], [41] (datos S1), y seleccionado en medio suplementado con G418, ya sea (400 g /ml) o puromicina (0,75 g /ml) durante 3 semanas
. Mitostatin silenciamiento génico
El silenciamiento génico de Mitostatin humana se consiguió mediante estrategias de siRNA utilizando validados SureSilencing Mitostatin siRNA y control plásmidos (SuperArray Bioscience Corp, Frederick, MD). células PC3 se transfectaron con vehículo (agua tratada con DEPC), Control de siRNA (codificado), o siRNA dirigido contra Mitostatin (100 pmol /L) utilizando reactivo Oligofectamine ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo los protocolos del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células PC3 se mueren de inanición en medio libre de suero (SFM) durante 12 horas y luego se procesaron y analizaron para la migración y la invasión como se describe a continuación. La expresión de la proteína Mitostatin se detectó mediante análisis de inmunotransferencia (Figura S1).
Formación de Colonias y Ensayos de Migración
Las células se sembraron a una densidad de 400 células /placa de 100 mm. En el día 15, las células fueron fijadas en formol al 10% [100% de formaldehído es de 37%, por lo que es un 3,7% formalina al 10%,
es decir
: PBS-formaldehído] y se tiñeron con cristal violeta para el recuento de colonias [21] . Las células se mueren de inanición de suero durante 24 horas. Las células (2,5 × 10
4 en 200 l) y después se sembraron en cámaras de Boyden (cámara superior) (BD Biocoat, Bedford, MA). cámaras inferiores contenían 500 l de cualquiera de SFM o 1% o 5% de suero. Después de 10 horas, las células migraron fueron contados bajo el microscopio después de la fijación y tinción de azul de Coomassie como se describe [42], [43].
migración, invasión y Ensayos de adhesión
Las células fueron sembradas en placas de 35 mm en medio que contiene suero hasta sub-confluencia y después se transfirieron a SFM. Después de 24 horas, las placas se rayan con una punta desechable delgada para generar una herida en la monocapa de células [42]. Las células se incubaron durante 72 horas adicionales en 1% o 5% medio que contiene suero y se analizaron y se fotografiaron con una célula M microscopio vivo Zeiss Axiovert 200 (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY) usando el software de adquisición y análisis Metamorph Image (Universal Imaging, Downingtown, PA) en el Centro Kimmel Cancer Center de Microscopía confocal Core. invasión de la célula a través de una matriz extracelular tridimensional se evaluó mediante un ensayo de invasión de Matrigel usando BD Matrigel Invasion Chambers (BD Biocoat) con membranas de filtro 8,0-micras tal como se describe anteriormente [42], [43]. Para los ensayos de adhesión, placas de 96 pocillos, recubiertas con laminina de ratón (BD Biocoat), se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con albúmina de suero bovino 1% (BSA) (Sigma, St. Louis, MO), para bloquear la unión no específica. 100.000 células /pocillo se sembraron por triplicado y se dejaron adherir durante 2 horas a 37 ° C, las células y no adherentes se eliminaron entonces con dos lavados. Las células adherentes se tiñeron con CyQUANT NF Cell kit Ensayo de proliferación (Invitrogen) y la absorbancia se leyó a 490 nm. Los niveles de fondo de la adhesión de células en pocillos recubiertos con BSA solo se restaron de los valores obtenidos para la laminina.
crecimiento independiente de anclaje y tumorigenicidad Ensayos
Para el ensayo de agar blando, las células se suspendieron en 0,2% de agarosa en medio DMEM FBS 10%, en placas a una densidad de 10
3 células en un plato de 60 mm recubiertos previamente con 0,4% de agarosa, y se mantuvo a 37C °. En el día 21, las colonias de & gt; 0,2 mm de diámetro se contaron y se analizaron [21]. Los ensayos de carcinogénesis realizados se llevaron a cabo esencialmente como se describe [44], en virtud de los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo de Thomas Jefferson. Inmunodeficientes, atímicos desnudos (BALB /c
nu /nu
) los ratones fueron inyectados por vía subcutánea en los flancos posterior con 2 × 10
6 células en 200 l de matriz de membrana basal Matrigel (BD Biosciences). El crecimiento tumoral se controló diariamente durante 65 días.
declaraciones de ética
Todos los pacientes que participaron en el estudio QRT-PCR dieron su consentimiento informado por escrito.