Extracto
Metástasis conduce a un mal pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal, y hay una necesidad creciente de nuevas dianas terapéuticas. TMEM16A (ANO1, DOG1 o TAOS2) ha sido recientemente identificado como un canal de cloruro activado por calcio (CACC) y se dice que se sobreexpresa en varios tumores malignos; sin embargo, su expresión y función en el cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo poco clara. En este estudio, encontramos expresión de TMEM16A ARNm y proteínas en las células de alto potencial metastásico-SW620, HCT116 y LS174T, pero no en las células SW480 y HCT8 primarias, mediante RT-PCR, Western Blot y etiquetado de inmunofluorescencia. patch-clamp grabaciones detectan corrientes CACC regulados por Ca intracelular
2 + y el voltaje en las células SW620. Desmontables de TMEM16A por ARN de horquilla corto (ARNhc) dio como resultado la supresión del crecimiento, la migración y la invasión de las células SW620 como se detecta por MTT, la curación de heridas y transwell ensayos. Mecánica, el agotamiento TMEM16A fue acompañado por la desregulación de la fosfo-MEK, fosfato ERK1 /2 y la expresión de ciclina D1. Citometría de flujo El análisis mostró que las células SW620 se inhibieron de la G1 a la fase S del ciclo celular en el grupo de TMEM16A shRNA comparación con el grupo control. En conclusión, nuestros resultados indican que TMEM16A CACC está implicada en el crecimiento, la migración y la invasión de las células metastásicas de CRC, y proporcionan evidencia de TMEM16A como un posible objetivo de drogas para el tratamiento del carcinoma colorrectal metastásico
Visto:. Sui Y, Sun M , Wu F, Yang L, Di W, Zhang G, et al. (2014) La inhibición de la expresión TMEM16A suprime el crecimiento y la invasión de células de cáncer colorrectal humano. PLoS ONE 9 (12): e115443. doi: 10.1371 /journal.pone.0115443
Editor: Hong Wanjin, Instituto de Biología Molecular y Celular, Biopolis, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Junio, 2014; Aceptado: 23 Noviembre 2014; Publicado: December 26, 2014
Derechos de Autor © 2014 Sui et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81173109, 31471099, 31301179 y), China Fundación postdoctoral Ciencia (No. 2014M551198), y la salud la provincia de Jilin y Planificación Familiar Proyecto de la Comisión (núm 2014Q024). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en todo el mundo [1], [2], y la metástasis es un factor crucial para el mal pronóstico de los pacientes con CCR [3]. Las alteraciones de genes múltiples, tales como la activación de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores, están implicados en la progresión del epitelio normal del colon en el adenoma y en el adenocarcinoma maligno [4], [5] Sin embargo, existe información limitada acerca de los cambios moleculares que conferir a la metástasis del cáncer de colon [6], [7]. Por lo tanto, es necesario identificar los genes relacionados con metástasis y sus vías moleculares, que pueden proporcionar nuevas dianas para el tratamiento del CCR metastásico
.
La banda cromosómica 11q13 amplificación es una de las regiones amplificadas con mayor frecuencia en tumores malignos humanos , tales como cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) y de mama, de vejiga y cáncer de esófago [8]. El análisis de la expresión diferencial de genes localizados en esta región condujo a la identificación de los
TMEM16A
, que también se llama
ANO1 gratis (anoctamin-1),
DOG1 gratis ( descubierto en tumores de estroma gastrointestinal proteína 1),
ORAOV2 gratis (cáncer oral sobreexpresa 2) y
TAOS2 gratis (y la secuencia 2 se sobreexpresa amplificada por tumor) [9], [10], [11] , [12], [13]. TMEM16A se compone de 26 exones y contiene ocho segaments transmembrana con los extremos N- y C-terminales se enfrentaron al citoplasma y un circuito de reentrada situado entre TM5 y TM6 posiblemente formando la región del poro [14].
TMEM16A ha sido recientemente mostrado ser un canal de cloruro activado por calcio [14], [15], [16] y se expresa ampliamente en varios tejidos, incluyendo los epitelios de secreción, el músculo liso, las neuronas sensoriales y otros tejidos [17], [18]. TMEM16A desempeña muchos papeles fisiológicos importantes en el control del transporte epitelial de fluido, contracción del músculo liso vascular, la producción de saliva y el tracto gastrointestinal de la motilidad [19], [20], [21], [22]. La desregulación de TMEM16A causa enfermedades humanas, incluyendo la fibrosis quística, la hipertensión, las enfermedades pulmonares y diarrea [23], [24], [25]; octavos de final de TMEM16A es letal embrionaria debido a traqueomalacia [26]
.
La expresión de TMEM16A es hasta reguladas en varios tipos de cáncer, incluyendo CECC y de esófago, cáncer de mama y de próstata. Su sobreexpresión también se correlaciona con el desarrollo de metástasis a distancia y el mal pronóstico de pacientes con cáncer con HNSCC [27], [28], [29]. Recientemente, TMEM16A se ha encontrado para promover la tumorigénesis HNSCC y la invasión a través de la activación de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) vía de señalización. Además, TMEM16A ha informado de contribuir a la progresión del cáncer mediante la inducción de la activación de epitelial receptor del factor de crecimiento (EGFR) y la proteína quinasa dependiente de calmodulina II (CAMK II) y, posteriormente, la activación de AKT y la señalización MAPK en el cáncer de mama y HNSCC [30] , [31]. Aunque TMEM16A se expresa de forma ubicua en los tumores del estroma gastrointestinal [32], su papel en la metástasis CRC es poco investigado.
En el presente estudio, hemos demostrado por primera vez la expresión de TMEM16A canales de cloro activados por calcio (CaCCs) en diferentes metastáticos posibles líneas celulares de cáncer colorrectal. Además, investigó el papel de TMEM16A en las células SW620 metástasis y su posible mecanismo molecular mediante el uso de ARN de horquilla corta in vitro.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
El carcinoma colorrectal humano líneas celulares HCT8, SW480, SW620, se obtuvieron células HCT116 y LS174T de la American Type Culture Collection (ATCC). SW480 y SW620 se cultivaron en Medio L15 (Sigma, EE.UU.). HCT8 y HCT116 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma, EE.UU.). células LS174T se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Sigma, EE.UU.). Fisher tiroides de rata (FRT) y células FRT transfectadas establemente con TMEM16A humana se obtuvieron de Alan Verkman (Universidad de California, San Francisco, CA, EE.UU.) [33] y se cultivaron en medio F12 de Coon modificado. Todos los medios se complementaron con suero bovino fetal al 10%, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y 95% de aire.
extracción de RNA y RT-PCR
ARN total fue extraído de las células utilizando TRIzol reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con las introducciones del fabricante. La concentración, la pureza y la integridad del ARN se midieron usando un espectrofotómetro NanoDrop2000 (Thermo Scientific). Quinientos nanogramos de RNA total se transcribieron inversamente en ADNc utilizando la transcriptasa inversa con el kit de reactivos PrimeScriptTM RT (Takara). El producto de cDNA se utilizó como molde para la amplificación por PCR en un volumen total de 30 l, y las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s; 60 ° C durante 30 s; y 72 ° C durante 60 s. Para la amplificación TMEM16A cDNA, se utilizaron los siguientes cebadores: cebador con sentido, 5 '-AACGGGA CCATGCACGGCTT-3'; cebador antisentido, 5 '-TGTTGTGGTGGTTGCACGGC-3'. Los productos de PCR (424 pb) se analizaron por electroforesis en gel de agarosa, y β-actina sirvió como control endógeno para normalizar los datos de expresión.
Western Blot
Las células se lavaron dos veces con hielo solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) y se disolvió en tampón de lisis (NaCl 150 mM, Tris 20 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5, 1% de Triton X-100 y suplementado con PMSF 1 mM). Después de la cuantificación de proteínas, las muestras que contienen 100 mg proteínas fueron desnaturalizados y electroforesis utilizando 10% SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de PVDF. Después de bloquear con 5% (w /v) de leche sin grasa y lavado con solución salina tamponada con Tris-Tween solución (TBST), las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpo policlonal primario anti-TMEM16A (Abcam, ab53212; 1:100 ) y el ratón anti-β-actina de anticuerpos (Señalización celular; 1:500), respectivamente. Todos los demás anticuerpos primarios se adquirieron de Cell Signaling Technology. Después del lavado, las transferencias se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma; 1:5,000) durante 1 h a temperatura ambiente y se visualizaron usando un kit de quimioluminiscencia (Amersham, Little Chalfont, Reino Unido) en película de rayos X (Millipore Corporation , Billerica, EE.UU.).
inmunofluorescencia análisis
tinción de inmunofluorescencia se llevó a cabo para localizar la expresión de TMEM16A. células de cáncer colorrectal se cultivaron durante la noche en cubreobjetos de vidrio preferidas (Fisher, EE.UU.) y se fijaron durante 15 minutos en 4% de paraformaldehído (PFA) (v /w). Las células se aclararon después 3 veces con PBS durante 5 min, se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 /PBS durante 20 min y después se incubaron durante 1 h en 3% de solución de BSA /PBS de bloqueo. Para detectar TMEM16A, se incubaron las células a 37 ° C durante 3 h con el anticuerpo monoclonal anti-DOG1 humano de ratón (zhongshanjinqiao, China; 1:50), seguido por la exposición a un anticuerpo secundario conjugado con Cy3 anti-ratón IgG (Sigma; 1 :1,000) a 37 ° C durante 1 h. Para visualizar los núcleos, las células se tiñeron con DAPI (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.; 40,6- diamino-2-fenilindol), y los cubreobjetos fueron montados en portaobjetos con solución antifade (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) . Fluorescente imágenes fueron examinados y fotografiados bajo un microscopio confocal (Olympus, Tokio, Japón).
grabaciones de patch clamp
células de cáncer colorrectal humano se sembraron en cubreobjetos de vidrio, y patch clamp grabaciones se realizaron utilizando un amplificador EPC10 (HEKA, Lambrecht /Pfalz, Alemania) en combinación con Patchmaster (HEKA) a temperatura ambiente. Las pipetas se prepararon a partir de vidrio de borosilicato capilar usando un extractor de micropipeta (PC-10, Narishige, Japón) y luego pulidas al fuego, con un microforge (MF-900, Narishige, Japón). La resistencia de las pipetas en la solución del baño era 2-5 mO. Las células se perfundieron con una solución de baño que contenía: NaCl mM 145 mM, KCl 5, MgCl 2 mM
2, mM CaCl 1
2, glucosa 5 mM, HEPES 5 mM y sacarosa 20 mM (pH 7,4 con NaOH) . Para la configuración de célula completa, el Ca cero
2 + solución intracelular contenía lo siguiente: 146 mM de cloruro de N-metil-D-glucamina (NMDG-Cl), mM MgCl 2 EGTA y 8
2, 5 mM HEPES mM (pH 7,4 con NMDG). El alto Ca
2 + solución de la pipeta contenía mM Ca 5
2 + -EGTA en lugar de EGTA (libre de Ca
2 + aproximadamente 25 mM). Diferentes soluciones libres [Ca
2 +] se prepararon mezclando el cero-Ca
2 + y soluciones de alta Ca
2 +. La célula se sujetó a partir del potencial de retención (0 mV) a voltajes entre -100 a +100 mV en incrementos de 20 mV. Para la configuración de dentro a fuera, la solución de la pipeta contenía: 140 mM NMDG-Cl, MgCl 2 mM
2, 5 mM CaCl
2 y HEPES 10 mM (pH 7,4 con NMDG); y la solución de perfusión contiene: 150 mM NMDG-Cl, MgCl 2 mM
2, mM EGTA 10 mM, Tris 8 y HEPES 10 mM (pH 7,4 con NMDG). Después de la resistencia del sello alcanzó & gt; 40 GΩ, la membrana se cortó, y el potencial de membrana se mantuvo a -50 mV. Los datos se filtraron a 100 Hz con un filtro Bessel de ocho polos (LPF-8, Warner Instruments, LLC, Hamden, CT, EE.UU.), y se digitaliza usando un ordenador a una velocidad de muestreo de 500 Hz. ácido niflúmico (NFA) se adquirió de Sigma-Aldrich. Todos los experimentos de parches de dentro a fuera se realizaron utilizando una solución de sistema exanguinoperfusión rápida (SF-77B, Warner Instruments). El tiempo muerto del cambio solución fue de 30 ms, y se realizó el análisis de datos para las grabaciones que contienen células enteras en un solo canal utilizando el software Igor como se describe anteriormente [34].
ARN de interferencia
TMEM16A /ANO1 corto horquilla RNA (shRNA) y control negativo shRNA plásmido se construyeron mediante GeneChem Co., Ltd. (Shanghai, china). El sitio para la orientación ARNsi de la TMEM16A humano /gen ANO1 (GenBank NM_018043) era como sigue:#1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA (1077-1095 nt); y#2, CGAAGAAGA TGTACCACAT (837-855 nt). La interferencia de ARN se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
proliferación de las células de ensayo
tasas de proliferación celular se midió usando el ensayo MTT. Brevemente, se sembraron 5000 células en cada placa de 96 pocillos durante 24 h, transfectadas con TMEM16A shRNA o revueltos shRNA y se incubaron adicionalmente durante 1, 2, 3 y 4 d, respectivamente. Se añadió a cada pocillo, y las células se incubaron adicionalmente durante 4 h; reactivo MTT (500 mg /ml 10 l). Posteriormente, se añadió 150 DMSO l para disolver los cristales de formazán. El número de células viables se cuantificó mediante la absorbancia medida a 570 nm con un lector de microplacas (Thermo Scientific, EE.UU.).
in vitro
cicatrización de heridas
movilidad celular se evaluada mediante un ensayo in vitro cero herida. Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos hasta confluencia, raspadas con una punta estéril, 200-l y se lavaron dos veces con PBS. Después de la incubación con medio L15 que contiene 1% de suero bovino fetal, las células se fotografiaron a 0 h, 24 h, 48 h o 72 h bajo un microscopio invertido (Olympus, Tokio, Japón) con un aumento de 100 x. Estos experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Las distancias entre los bordes de la herida se midieron con una regla graduada, y la amplitud cero relativa se determinó en una proporción de anchura media en las células de tratamiento frente a la amplitud media de las células de control
migración celular y la invasión ensayos.
in vitro actividades
cáncer de migración e invasión celular en se evaluaron en cultivos polarizados, como se ha descrito anteriormente, con modificaciones [23]. células SW620 se cultivaron en medio L15 con 10% de FBS hasta confluencia en placas de 6 pocillos, transfectadas con el TMEM16A shRNA o revueltos shRNA durante 24 h, y luego se tripsinizaron, se lavaron y se contaron. Para la migración celular, 1 × 10
5 células en 200 l de medio con FBS al 1% se sembraron en la cámara transwell inserto superior que contiene un filtro de policarbonato (diámetro 6,5 mm, poros de 8 micras; Corning Costar, Corning, NY , ESTADOS UNIDOS). se añadió medio L15 (600 l) con 10% de FBS (quimioatrayente) a la cámara inferior, y las placas se incubaron durante 72 horas a 37 ° C en 5% de CO
2. Para la invasión de células, los cultivos polarizados se revistieron con Matrigel. Las células que no migran se retiran de la parte superior de los filtros transwell por raspado. Las células penetraron fueron fijadas con paraformaldehído, se tiñeron con azul de Coomassie y se contaron bajo un microscopio invertido (100 aumentos). El número de células representó actividad de migración.
análisis del ciclo celular
Después de la transfección de las células con TMEM16A o revueltos shRNAs para 3 d, las células se separaron usando tripsina, se resuspendieron en medio de crecimiento y se contaron. Entonces, 1 × 10
6 células se lavaron con PBS y se fijaron durante la noche con 70% (vol /vol) de etanol a 4 ° C. Después de lavar dos veces con PBS, las células se tiñeron con una solución que contiene 50 g /ml de PI y 100 mg /ml de RNasa A durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Las células teñidas se analizaron mediante citometría de flujo (Beckman Coulter, Epics XL).
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante el estadístico SPSS (versión 17.0) con la de Student de dos colas
t-test
.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los datos se expresan como la media ±
SD
.
Resultados
Expresión de TMEM16A en líneas celulares de CRC
En este estudio, se detectaron por primera vez
TMEM16A
los niveles de ARNm por RT-PCR en las líneas celulares de cáncer de colon HCT8, SW480, SW620, HCT116 y células LS174T. Como se muestra en la Fig. 1A, un fragmento de 424 pb del ser humano
TMEM16A
se amplificó a partir SW620, HCT116 y células LS174T y células FRT-positivo de control transfectadas de forma estable con
TMEM16A
, pero no de HCT8, SW480 células humanas y control negativo células null-FRT. El análisis por inmunotransferencia usando el anticuerpo policlonal anti-TMEM16A identificó una banda de proteína de aproximadamente 110 kDa en SW620, HCT116 y las células LS174T (Fig. 1B). Por el contrario, banda de proteína TMEM16A estaba ausente en SW480, HCT8 y nula células FRT-control negativo. Además, examinó la expresión y localización subcelular de la proteína en las células TMEM16A CRC utilizando la tinción de inmunofluorescencia. etiquetado de inmunofluorescencia reveló que TMEM16A fue altamente expresado en la membrana celular y plasma de SW620, HCT116 y las células LS174T (S1 Fig.), mientras que TMEM16A apenas se observa en HCT8 y células SW480 (Fig. 2). Se seleccionó un modelo isogénicas celular (líneas de células SW480 y SW620) de transición metástasis CRC humano para su posterior estudio.
A, RT-PCR revela expresión TMEM16A mRNA en SW620, células HCT116 y LS174T, pero no en HCT8 y células SW480. B, la expresión de proteínas en TMEM16A HCT8 y SW480, SW620, HCT116 y las células LS174T se detectó mediante transferencia Western. células FRT nulos actúa como control negativo. Las células transfectadas con FRT humana TMEM16A sirven como control positivo.
Las células fueron cultivadas en cubreobjetos y se tiñeron con anticuerpos anti-TMEM16A. Columna de la izquierda, anti-TMEM16A inmunofluorescencia (Cy3, rojo). columna Media, tinción con DAPI para visualizar los núcleos. columna derecha, se combinaron imágenes son compuestos de anti-TMEM16A inmunofluorescencia y tinción DAPI (200 ×).
La expresión funcional del canal TMEM16A en las células CRC
Para validar la expresión funcional de el canal TMEM16A en las líneas celulares de CRC, se realizó de células enteras patch clamp grabaciones de las células SW480 y patch clamp grabaciones de dentro a fuera de las células SW620. Higo. 3A muestra una familia de corrientes en respuesta a los pasos de voltaje de estímulos en presencia de 1 mM Ca de una célula SW480. La curva de corriente-tensión (Fig. 3B) mostró que el potencial de inversión (V
rev) de esta corriente es de aproximadamente -50 mV, pero el V
rev del canal de cloruro se estimó en aproximadamente 0 mV utilizando la ecuación de Nernst de acuerdo con el Cl extracelular e intracelular
-. Este resultado demuestra que las corrientes registradas desde la célula SW480 no son de los canales de cloruro.
A, las corrientes de células enteras representativos en las células SW480 se activa por 1 M Ca. Las corrientes se registraron a un potencial de mantenimiento de 0 mV seguido de pulsos tensiones entre ± 100 mV en etapas de 20 mV. B, la curva de tensión y corriente desde el panel A indica que las corrientes no son de los canales de cloruro. C, A traza actual mandatario inscrito de un parche de dentro a fuera de una célula SW620. Una corriente CACC se obtuvo con 1 mM Ca
2 +, como se indica. Las líneas discontinuas representan la corriente cero. El voltaje de la membrana se mantuvo a -50 mV; y desviaciones al alza representan la apertura del canal. D, A traza actual estable después de una corriente CACC desde el panel C deteriorado. E, A continua corriente de grabación que muestra la activación de CaCCs y aplicaciones de rampas de tensión en ausencia (A y C) o presencia (b) de Ca. rampas de voltaje: +50 a -100 mV durante un tiempo de 2000 ms. F, las curvas de tensión y corriente desde el panel E muestra las características típicas de rectificación hacia el exterior CaCCs. Nota Se observó que la conductancia mínimo en ausencia de Ca. G y H, CaCCs corrientes se redujeron por separado por 100 M NFA y 50 mM T16Ainh-A01.
Dentro de salida experimentos de patch clamp de células SW620 manifiesta que la corriente de membrana era dependiente de calcio y la tensión , que son características típicas de CaCCs endógenos (Fig. 3C-F). Además, las corrientes detectadas fueron fuertemente inhibidas por el Cl
- bloqueante de los canales de ácido niflúmico (NFA) (Figura 3G.) Y el inhibidor específico de TMEM16A T16Ainh-A01 (Fig 3H).
. TEME16A también añadió inhibidor específico T16Ainh-A01 a las células SW620 y SW480 separado, y se observa el cambio de crecimiento de estas células después de 24 h. Los resultados demostraron que T16Ainh-A01 podría disminuir específicamente la proliferación de células SW620, pero no SW480 células (Fig. 4).
Las células se trataron con diferentes concentraciones de T16Ainh-A01 para 24 h y la viabilidad celular se midió por ensayo de MTT. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (n = 3).
Desmontables de TMEM16A inhibe la proliferación de células SW620
Para revelar las funciones de TMEM16A en células de cáncer de colon, transfectadas dos secuencias TMEM16A shRNA (# 1 y#2) en las células SW620 para silenciar la expresión de TMEM16A. Western blot resultados mostraron que TMEM16A shRNA#1 causó la reducción de 63,4% en la expresión de proteínas TMEM16A y TMEM16A shRNA#2 causó reducción de 71,7%, en comparación con el control shRNA. TMEM16A caída condujo a un cambio significativo en las corrientes de cloruro activadas por calcio de células enteras y la densidad mediante inmunofluorescencia (Fig. 5).
A, el análisis de transferencia Western de la expresión de proteínas en las células SW620 TMEM16A que fueron transfectadas con shRNA#1 y#2. B, El gráfico de barras resume el nivel de expresión relativa de proteína TMEM16A desde el panel A. Expresión de la proteína TEMEM16A se normalizó con el nivel de expresión de β-actina (n = 3). C, imágenes immunofluence representativos de células SW620 se muestran tras TMEM16A está caída por shRNA#1 y#2 shRNA, en comparación con el control shRNA (200 ×). D, El gráfico de barras que resume los picos de corriente registrados a 100 mV de tensión en las células SW620 después TMEM16A fue derribado, en comparación con el control shRNA. ** P & lt; 0,01. Todos los datos se muestran como media ± desviación estándar. E, las corrientes de células enteras se registraron a partir de células SW620 transfectadas con el control shRNA, shRNA#1 y#2 en una explotación potencial de 0 mV seguido de pulsos tensiones entre ± 100 mV en etapas de 20 mV.
para investigar los efectos de TMEM16A sobre la proliferación de células SW620, se utilizaron dos secuencias shRNA para interferir la expresión de TMEM16A. MTT análisis mostró que TMEM16A caída suprime en gran medida el crecimiento celular de una manera dependiente del tiempo en comparación con el control shRNA-expresando células SW620
in vitro gratis (Fig. 6).
A, El crecimiento de SW620 células fue inhibida por TMEM16A shRNA#1 y#2 en comparación con el grupo de control (media ± SD, n = 3; * P & lt; 0,05). B, inmunotransferencias representativas confirmando desmontables de TMEM16A. Ctrl, control.
represión de la migración y la invasión de las células SW620 silenciando TMEM16A endógena
Para observar adicionalmente los efectos de TMEM16A sobre la motilidad celular, se realizó la cicatrización de heridas después de los ensayos de silenciamiento TMEM16A endógeno. imágenes de curación de heridas demostraron que el cierre de heridas de las células TMEM16A shRNA#1 y#2 fue más lento que en el control de las células tratadas con shRNA después de rascarse las células (Fig. 7). Este resultado mostró que la desregulación de TMEM16A retraso en la cicatrización en comparación con el control.
A, la migración de células SW620 se evaluó mediante un ensayo de cicatrización de heridas en presencia de TMEM16A shRNA#1 y#2 shRNA, en comparación con control de shRNA. Imágenes representativas de cierre de la herida se tomaron a las 0 h, 24 h, 48 hy 72 h después de la herida bajo un aumento de 100x. B, se muestran los gráficos de barras del panel A. Los valores son las medias ± SD; n = 3; ** P & lt; 0,01. Ctrl, control.
A continuación examinó el papel de los TMEM16A en la metástasis de las células SW620. la migración transwell y ensayos de invasión de las células desmontables TMEM16A se llevaron a cabo. En el ensayo de migración transwell, el número de células transfectadas con TMEM16A shRNA que penetraron la membrana en gran medida disminuyeron en comparación con células SW620 transfectadas con el control negativo. Los resultados también mostraron que las células SW620 transfectadas con TMEM16A shRNA#1 y#2 mostraron un deterioro significativo de la capacidad migratoria. Del mismo modo, la función correspondiente de TMEM16A shRNA#1 y#2 para la capacidad invasiva también se observó en un ensayo paralelo invasiva (Fig. 8).
A, Migración (sin Matrigel) y la invasión (con Matrigel) de células SW620 se suprimen significativamente por desmontables de TMEM16A comparación con el grupo control a través de transwell ensayos de penetración. Las células no migradas se rasparon con un hisopo de algodón. Las células que penetraron los filtros transwell se tiñeron con azul de Coomassie. se muestran imágenes representativas. B y C, gráficos de barras del panel A se muestran. Los valores son las medias ± SD; n = 3; ** P & lt; 0,01. Ctrl, control.
El agotamiento de TMEM16A inhibe la activación de MAPK señalización
Para dilucidar los mecanismos moleculares por los cuales TMEM16A afecta el crecimiento y la metástasis CRC humana, hemos explorado la correlación de TMEM16A con la ciclina D1 y MAPK vía de señalización. Como se muestra en la Fig. 9, desmontables de TMEM16A significativa disminución de la expresión de ciclina D1 y la fosforilación de MEK y ERK1 /2, mientras que no afecta a la MEK, total o niveles de ERK1 /2 de expresión.
Western blot resultados muestran una inhibición de TMEM16A llevó a una disminución de fosfo-MEK, fosfato ERK1 /2 y ciclina D1. Ctrl, control.
El agotamiento de TMEM16A causado el retraso del ciclo celular procesión
Se midió además la distribución del ciclo celular por citometría de flujo para investigar el posible mecanismo de regulación celular TMEM16A en CRC proliferación. Como la fig. 10 mostraron un aumento en el número de células en G0 /G1 y fase de disminución en el número de células en G2 /M se observó fase después de TMEM16A endógena fue derribado. El porcentaje de células en fase G1 en TMEM16A-shRNA células#1 (50,3% ± 1,83) y TMEM16A-shRNA#2 células (51,8 ± 1,13) fueron significativamente mayores que en las células de control (33,95 ± 2,05) (P & lt; 0,01). Estos resultados verificaron que TMEM16A caída causó retardo de la progresión del ciclo celular en las células SW620 de detención de las células en la fase Go /G1, lo que causó la inhibición del crecimiento de células TMEM16A shRNA
.
A, B y C, de citometría de flujo análisis de la distribución del ciclo celular de las células SW620 transfectadas con control de shRNA, TMEM16A shRNA#1 y#2, respectivamente, para 72 h. D, gráficos de barras que muestran el porcentaje relativo de células en las fases indicadas del ciclo celular después de desmontables de TMEM16A. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar; n = 3; * P & lt;.. 0,05
En conjunto, nuestros resultados demuestran que el agotamiento de TMEM16A suprime la activación de MAPK y la progresión retardada del ciclo celular de señalización
Discusión
TMEM16A proteínas se encontraron recientemente para formar Ca
2 + activados por Cl
- canales que fueron transitoriamente activadas por el calcio intracelular [15], [16], [26], [35]. Estos canales tienen un papel importante en el epitelio Cl
- secreción, contracción del músculo liso y la señal olfativa transducción [17], [36], [37], [38], [39]. Estudios anteriores mostraron que TMEM16A es frecuentemente sobreexpresado en varios tumores malignos, incluyendo CECC, cáncer de esófago y tumores del estroma gastrointestinal (GIST) [28], [36], [40]. Sin embargo, la expresión de TMEM16A en CRC sigue siendo poco clara.
Nuestro hallazgo proporciona la primera evidencia de que TMEM16A se amplifica y se expresa altamente en SW620, células HCT116 y LS174T pero no en HCT8 y las células SW480. Se encontró que la proteína TMEM16A fue de aproximadamente 110 kD y dentro de la membrana celular y plasma de SW620, HCT116 y las células LS174T, que es coherente con los informes anteriores [39], [41]. línea celular de cáncer de colon SW480 se origina de adenocarcinoma primario de colon de un paciente varón de 50 años de edad, y las células SW620 se derivan de un ganglio linfático mesentérico metastásico del mismo paciente. Así las células SW620 tienen un alto potencial de metástasis en comparación con células SW480 [42]. LS174T y HCT116 tienen un mayor potencial de metástasis que HCT8 células [43], [44], [45]. Estos resultados demuestran que la regulación de TMEM16A se asoció con mayor potencialidad de metástasis en las cinco líneas celulares de CRC. Los autores especulan que la alteración de la expresión TMEM16A se asoció con la adquisición de propiedades más agresivos en las líneas celulares de CRC, que induce tumores se vuelvan metastásico. Relación entre la expresión y la progresión tumoral TMEM16A CRC tiene que investigarse más a fondo en más líneas celulares de CRC y en otro estudio clínico.
Debido a su característica isogénica, líneas de células SW480 y SW620 sirven como un modelo valioso para el estudio de la genética alternancias en el cáncer de colon progresión metastásica [46]. Por lo tanto, elegimos este par de modelo de células para su posterior estudio.
pruebas electrofisiológicas validado que funciona como TMEM16A CaCCs en las células SW620. En primer lugar, la corriente depende de la concentración de ion de calcio en el citoplasma y de tensión (Fig. 3C-F). Por otra parte, tanto el cloruro de bloqueadores de los canales de la NFA y TMEM16A-inhibidor específico T16A
inh-A01 [47] se puede suprimir con eficacia las corrientes registradas a partir de un parche de células SW620 (Fig. 3G, H). Curiosamente, se observó que después de un parche de células fue extirpada, la corriente CACC disminuye rápidamente al principio y luego se volvió relativamente estable (Fig. 3C, D). Este fenómeno demuestra que otras proteínas, tales como la calmodulina o quinasa dependiente de calmodulina, podrían estar involucrados en la regulación de TMEM16A CaCCs en las células SW620.
Hay pruebas de que los canales de cloro contribuyen a la tumorigénesis y progresión tumoral [48] , [49], [50], [51]. CaCCs TMEM16A Recientemente se han reportado para promover el crecimiento y la metástasis en el CECC, cáncer de próstata y cáncer de mama [27], [30], [31]. De acuerdo con estos resultados, se encontró que TMEM16A caída dio lugar a la supresión de la proliferación, la migración y la invasión de las células SW620. Nuestros datos proporcionan evidencia de que TMEM16A probablemente contribuye a la tumorigénesis y metástasis en el alto potencial metastásico-CRC. inhibidores moleculares pequeños que pueden disminuir la expresión de TMEM16A puede servir como nuevos fármacos terapéuticos para el CCR metastásico.
Hasta la fecha, el mecanismo por el cual TMEM16A afecta el cáncer de colon se mantuvieron relativamente sin explorar. Numerosos estudios mostraron que la vía de ERK no sólo controla la proliferación celular y la supervivencia, pero también influye en la migración de células tumorales, invasión y la progresión [52], [53], [54]. Los estudios recientes informaron que TMEM16A promueve la tumorigénesis HNSCC y la progresión del cáncer mediante la activación de MAPK vía de señalización [30]. Por lo tanto, nos hemos centrado en el estudio de la relación entre TMEM16A y MEK-ERK1 /2 vía en el CCR. Los cambios en esta vía se investigaron después de la expresión TMEM16A se inhibió utilizando el Western Blot. Nuestros resultados demuestran que desmontables de TMEM16A inhibió significativamente la activación de MEK y ERK1 /2. Sobre la base de este resultado, se investigó adicionalmente la expresión de la ciclina D1, una proteína reguladora del ciclo celular que está asociado con pERK1 /2 expresión. Los resultados mostraron que la expresión de la ciclina D1 se asocia positivamente con pERK1 /2 y TMEM16A expresión. Además, la citometría de flujo (FCM) ensayos mostraron que la progresión del ciclo celular de G1 a la fase S se inhibió, lo que era coherente con la desregulación de la expresión de ciclina D1 después de TMEM16A se agotó. Estos resultados proporcionan una posible explicación para la inhibición observada de la proliferación celular, la migración y la invasión de CRC cuando TMEM16A fue suprimida e indicó que TMEM16A contribuye al crecimiento y la metástasis de CRC posiblemente mediante la regulación de la vía MAPK.
En conclusión