Extracto
En nuestro cuerpo, las células están expuestas continuamente a las fuerzas físicas que puede regular diferentes funciones celulares tales como la proliferación celular, la diferenciación y la muerte . En este trabajo, se emplearon dos estrategias diferentes para mecánicamente las células cancerosas estrés. El cáncer y las poblaciones de células sanas se trataron con la tensión mecánica entregada por una microbomba (fabricado por nanolitografía de rayos X de profundidad) o por estímulos de onda de ultrasonido. Se observó una baja regulación específica de clase Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) I moléculas de expresión en la membrana de células de cáncer en comparación con los diferentes tipos de células sanas (células fibroblastos, macrófagos, dendríticas y linfocitos), la estimulación de las células con las fuerzas en el rango de nano -Newton, y presiones entre 1 y 10 bar (1 bar = 100.000 Pascal), dependiendo de los dispositivos utilizados. Por otra parte, el análisis de espectroscopia de Raman, después del tratamiento mecánico, en el rango de entre 700-1800 cm
-1, indica una variación de la concentración relativa de análisis de clase I. PCA MHC también se realizó para distinguir el control y las células dentro de las diferentes líneas de células estresados. Estos cambios fenotípicos inducidos mecánicas aumentan la inmunogenicidad del tumor, según lo revelado por el aumento de la susceptibilidad relacionada con Natural Killer (NK) las células citotóxicas reconocimiento
Visto:. La Rocca R, R Tallerico, Talib Hassan A, G Das, Tadepally L, M Matteucci, et al. (2014) regula a la baja la tensión mecánica de MHC de clase I Expresión del Cáncer Humano membrana celular. PLoS ONE 9 (12): e111758. doi: 10.1371 /journal.pone.0111758
Editor: Laurent Kreplak, Universidad de Dalhousie, Canada |
Recibido: 17 Abril, 2014; Aceptado: 30 de septiembre de 2014; Publicado: December 26, 2014
Derechos de Autor © 2014 La Rocca et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. El trabajo de Ennio Carbone ha sido apoyado por una Tecnología Internacional del Cáncer de la UICC Transferencia de becas, conceder AIRC-CI 10189 y 15521. conceder AIRC Rossana es Tallerico un post Doctorado otorgado por las becas trienales "Luciana Selce" firc. Giovanni Cuda ha sido apoyado por PON01_02834 Prometeo (Ministerio de Educación e Investigación) y PONa3_00435 Biomedpark @ UMG (Ministerio de Educación y la Investigación). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En la naturaleza, las células están continuamente expuestos a esfuerzos físicos, biológicos y químicos. En el pasado, se tomaron los cambios físicos que se producen en tejidos patológicos en cuenta por los médicos como indicadores de diagnóstico valiosos. El estrés físico está implicado en la fisiopatología de varias enfermedades humanas, tales como la inflamación y el cáncer. En ambas condiciones, una alteración en el ambiente químico-física de la matriz extracelular (ECM) se asocia con la patogénesis de estas enfermedades. Por otra parte, las fuerzas físicas juegan un papel significativo en la progresión metastásica. En los últimos años, nuevas herramientas, como la microscopía de fuerza atómica, se han desarrollado para analizar los cambios en las células elasticidad relacionados con los cambios físicos en el compartimiento de la matriz extracelular [1]. Además, para determinar la cantidad de una célula puede ser deformada, un dispositivo llamado "camilla óptica" se desarrolló [2]. A diferencia de otras herramientas, la camilla óptico se basa en una trampa óptica de doble haz [3], [4] en la que dos oponente y el láser idéntica vigas trampa una célula en el medio. Este método puede ser usado para medir las propiedades elásticas y contráctiles de muchas células, ya que se sabe que la capacidad de la célula para contrato es muy importante para la migración y la proliferación [5]. Además, la elasticidad y contractilidad de las diferentes células tumorales pueden cambiar con la progresión de la enfermedad, con un aumento de la elasticidad de la canceroso en comparación con las células sanas [6]. Una relación entre la rigidez y el ECM tumor transformación se ha descrito [7]. Se ha demostrado que las fuerzas isométricas de ECM mediada son detectadas por las integrinas, que regulan la fosforilación de quinasas mecano-transductor, tales como ERK y Rho [8]. También se ha demostrado que el incremento de las fuerzas exógenas conducen a un aumento de la tasa de proliferación celular e inducir cambios fenotípicos similares a tumores. Por último, el cáncer de mama inflamatorio se sabe que ejercen una carga mecánica debido a los cambios de ECM, que puede conducir a un mayor potencial metastásico [9].
Sobre esta base, la hipótesis de que el estrés mecánico o bien podría afectar a la expresión de antígenos celulares o inducir la expresión de moléculas de estrés inducible como ligandos del receptor NKG2D [10] capaces de primer efector citotóxico de linfocitos funciones celulares.
En los últimos años, el descubrimiento de inmunorreceptores que reconocen proteínas inducibles estrés han ampliado nuestro conocimiento sobre cómo se prepara el sistema inmunológico [11], [12]. Estas observaciones han fomentado el interés en dispositivos de suministro de tensión controlada que podría provocar un fenotipo tumoral inmunogénica capaz de provocar una respuesta inmune, especialmente cuando el tumor ya ha sido editado por linfocitos citotóxicos [13].
Células
asesinas naturales están linfocitos citotóxicos potentes capaces de reconocer las células cancerosas recién explantados [14] - [16] y de forma espontánea a Lyse determinadas dianas de tumores [17] - [19]. Están reguladas por un delicado equilibrio entre los receptores inhibitorios, el reconocimiento de moléculas auto MHC de clase I, y la activación de los receptores para moléculas inducibles por estrés [20]. las células NK tienen la capacidad de identificar y destruir las células infectadas por virus y malignas sin dañar las células normales. La regulación de las células NK se conoce poco, hasta finales de 1980 cuando se propuso [21] la hipótesis de "falta de auto". De acuerdo con esta hipótesis, la baja regulación de moléculas MHC de clase I durante la infección viral o transformación maligna desencadena la activación de NK.
A continuación nos preguntamos si el tratamiento de las células cancerosas resistentes a NK por el estrés mecánico podría inclinar la balanza entre el inhibidor y la activación de moléculas de tumor que expresa en favor de estos últimos, que conduce a la activación de células NK. En este trabajo, hemos utilizado dos procedimientos diferentes para el cáncer mecánicamente el estrés y las células normales bajo condiciones controladas. Se compararon los efectos biológicos de los estímulos mecánicos entregados ya sea por un dispositivo de microbomba diseñados expresamente para este fin [22], a los proporcionados por un equipo de impulso de ondas de choque. La variación en moléculas MHC de clase I antes y después de la tensión mecánica se controló tanto por medio de espectroscopia de Raman (en combinación con análisis de componentes principales (PCA)) y por medio de mediciones citotóxicos. El objetivo final de nuestro estudio era entender si las fuerzas mecánicas aplicadas podrían inducir y /o modular características de células biológicas pertinentes, como su inmunogenicidad. Por otra parte, hemos explorado la posibilidad de utilizar de forma adoptiva manipulaciones mecánicas toswitch un fenotipo resistente a las células NK en un tumor una susceptible.
Materiales y Métodos
dispositivo
microbomba
Para suministrar tensión mecánica a poblaciones de células tumorales, se utilizó una microbomba descrito previamente [22] (S1A Fig.) fabricado por medio ofdeep técnica de la litografía de rayos X (DXRL) para tratar específicamente las células eucariotas sin destruirlos. Se hizo hincapié en Tres millones de células /ml mecánicamente durante 1 hora a 48 ciclos y la fuerza de la presión máxima aplicada fue de alrededor de 10 bares. Esto se evaluó mediante la medición de la prevalencia de la bomba mediante el uso de agua como un fluido. Después se recogieron las células en unos tubos de 15 ml y se analizaron mediante citometría de flujo y la espectroscopia Raman micro.
dispositivo de ondas de choque
Las ondas de choque se aplican en ortopedia y son ondas acústicas esencialmente con una mecánica efecto. Cuando las ondas de choque pasan a través de un fluido, crear diferencias de presión responsables de la formación de burbujas de gas (cavitación) que son afectados por las ondas de choque posteriores y se deforman hasta la implosión. colapso asimétrico de la burbuja provoca la formación de un chorro de agua "corriente en chorro". Este fenómeno mejora aún más el efecto mecánico de la onda de choque causando micro-lesiones cuyo tamaño es una función del número de impulsos y flujo de energía. Para el tratamiento de líneas de células tumorales se utilizó el
Swiss DolorClast dispositivo gratis (Electro Médico Sistema-EMS, Italia) con una pieza de mano de alta energía (S1 B Fig.).
Las células cancerosas se cultivaron en placas de Petri y se trata con ondas de choque (500 disparos) aplicar un flujo de energía de 1 bar. Después del tratamiento las células se recogieron y se analizaron, y los datos obtenidos se compararon con los controles respectivos.
Las células aislamiento y cultivo
Para los experimentos de tensión mecánica que utilizan diferentes tipos de líneas celulares. Las células primarias 59c Mel, Mel 42a, 42b Mel, Mel 66b, 137a y Mel Mel 103b se obtuvieron de piel no melanoma recién extirpado células metastásicas con pocos pasajes in vitro, respectivamente, de los pacientes 59, 42, 66, 137 y 103. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito de acuerdo con la Declaración de Helsinki y el Comité de Ética de la Universidad de Heidelberg II (0198,3 /2002). PBL de donantes sanos y las células NK purificadas relacionados se generaron en consecuencia con el Comité de Ética de la Universidad de la Magna Grecia de Catanzaro (49/2003). El estudio fue aprobado por el Comité de Ética UMG (49/2003). línea humana carcinoma renal de células (293T), la línea celular linfoblastoide B humana (IM9), y de fibroblastos de células se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Linfocitos de sangre periférica (PBL) se obtuvieron de donantes sanos de Ficoll-Paque (Biochrom AG, Berlín, Alemania) centrifugación en gradiente de densidad se recogieron las muestras humanas en consecuencia con el Comité de Ética de la Universidad de la Magna Grecia de Catanzaro (49/2003). Las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 y en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Sigma Aldrich, St. Louis) y penicilina (100 UI /ml) y estreptomicina (100 mg /mL ) (Sigma Aldrich, St. Louis) y se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera. Los macrófagos y células dendríticas (DC) se obtuvieron a partir de células mononucleares de sangre. Los macrófagos se generan a partir de monocitos adherentes en el plato. Se establecieron las células dendríticas (DC) a partir de monocitos suplementadas durante 7 días con 50 de granulocitos /ml de factor /ng macrófago estimulante de colonias (GM-CSF) (Santa Cruz Biotechnology, Texas, EE.UU.) y 1.000 U /ml de IL-4 [23] .
se obtuvieron
asesinas naturales en la purificación de células
Las células NK como se describe [24]. Brevemente, los linfocitos NK humanos se purificaron a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), obtenidas de donantes sanos por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque, utilizando el kit de aislamiento de células NK y Vario MACS para el agotamiento de las células no NK (Miltenyi Biotec). Las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, suero humano 3%, penicilina (100 UI /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) y se utilizaron para el ensayo de citotoxicidad. la pureza de las células NK fue de al menos 95%.
Espectroscopía Raman
microsonda Raman espectros se excita por láser de IR cercano con la línea de láser de 830 nm a temperatura ambiente (TA) en la geometría de retrodispersión a través de un objetivo de 100X (
NA
= 0,95) de Leica microscopio (Modelo - DMLM). Todos los datos fueron recogidos con una potencia de láser de 70-130 mW. La potencia del láser siempre se eligió de tal manera para evitar cualquier daño de la célula. no se espera que esta potencia del láser para causar un aumento significativo de temperatura de la muestra debido al coeficiente de absorción extremadamente baja de células a 830 nm. Además, las condiciones de células fueron verificadas a través de óptica de imagen antes y después de las mediciones. Varias células de cada línea celular se probaron en el intervalo de 700 a 1800 cm
-1 por mediciones de mapeo de puntos, que recogen varios espectros en una ubicación diferente que cubre toda la superficie de la célula. Para cada línea celular 5 células fueron escogidos al azar para la asignación de puntos. a continuación, se recogieron los espectros Raman de las diferentes células de cada uno de las líneas de células y se utiliza para el análisis estadístico (Spectra no muestran significativa diferentes entre sí [25], [26]). Se realizó el análisis estadístico (con error de desviación estándar) de 10 espectros Raman para cada línea celular. Es de destacar que apuntar que las mediciones de control y células estresadas de cada línea celular se realizaron en el mismo día para evitar cualquier variación en la respuesta instrumental. alisado espectral se realizó para todos los espectros Raman individuales utilizando el software PS9 alambre de 2.0 suministrado con el espectrómetro Raman Renishaw. El ajuste de la curva de los espectros se llevó a cabo utilizando la función de Gauss y de Lorentz combinado.
Análisis de Componentes Principales
En la última década las técnicas multivariantes han sido ampliamente empleada para el análisis de grandes conjuntos de datos Raman [27] , [28]. Entre estas técnicas, análisis de componentes principales (PCA) ha demostrado ser uno de los más robustos y fiables métodos [29], [30]. Cuando PCA se aplica a espectros Raman, Raman cada frecuencia se considera como una variable cuyo valor cambia a través de los espectros grabada valor, por lo que todo el conjunto de datos constituye un
N
espacio dimensional donde
N es
el número de frecuencias medidas (
N
es típicamente muy grande). El objetivo principal de PCA es la dimensionalidad de reducción sin pérdida de información. Esto se logra a través de la diagonalización de la matriz de covarianza de espectros: definen los vectores propios de una sola dimensión (1D) ejes en el
N
-espacio y los valores propios correspondientes expresar la cantidad de varianza total explicada por cada vector propio. Los vectores propios son los llamados componentes principales (PCs), mientras que los valores propios se nombran huellas latentes. El primer componente principal es el eje 1D largo de la cual se toma la mayor cantidad de varianza en cuenta (es decir, el eje con el mayor valor latente); el segundo componente principal es el eje (ortogonal a la primera), que representa la mayor varianza residual (es decir, el eje con el segundo más grande latente), y así sucesivamente para los siguientes componentes. De esta manera, a partir de un
N
variables- conjunto de datos que se reducen a un conjunto de datos pocas variables, sin perder la parte significativa de la información. análisis de componentes principales se realizó utilizando el software desarrollado por P. Candeloro et al. [31].
inmunofluorescencia ensayo
Después de cada tratamiento, se recogieron las células en tubos y se incubaron con suero humano durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron tres veces en PBS 1X y posteriormente se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C, con los siguientes mAbs: W6 /32 (anti-MHC de clase I, IgG2a; BioLegend, San Diego, CA); clon BAM 195 (anti-MICA, IgG1) y mAb 6D4 (anti-MICA /B, IgG1), fueron amablemente proporcionados por Veronika Groh (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA); M295 (anti-ULBP1, IgG1), M310 (anti-ULBP2, IgG1), M550 (anti-ULBP3, IgG3) y M478 (anti-ULBP4, IgG1) fueron amablemente regalo de D. Cosman, (Amgen Inc. de Seattle, WA ); mAb L95 (anti-PVR, IgG1) y mAb L14 (anti-Nectin-2, IgG2a) proporcionado amablemente por A. Moretta (Universidad de Génova, Génova, Italia). Después de lavar dos veces, las células se tiñeron con el secundario de cabra FITC mAbs anti-IgG de ratón (Jackson Immuno Research, Baltimore, EE.UU.) durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad. Luego, las células se lavaron de nuevo dos veces y se analizaron por citometría de flujo FACSCalibur (BD Bioscience, San Diego, CA, EE.UU.). Para la tinción intracelular, las células fueron fijadas en Cytofix y se permeabilizaron por Cytoperm (BD Biosciences). Las células se tiñeron con los anticuerpos monoclonales específicos seguidos de anticuerpos IgG anti-ratón conjugado con FITC (Jackson Immuno Research, Baltimore, EE.UU.) y se analizaron. Los resultados fueron analizados utilizando la célula Quest (BD Biosciences) o FlowJo versión de software 9.3.1.
Ensayo de citotoxicidad
Para los ensayos de citotoxicidad del tumor o las células sanas como objetivo y los linfocitos NK como efector se utilizaron células. Después del tratamiento la tensión mecánica, las células diana se incubaron con el CFDA fluorescente (diacetato de carboxifluoresceína, Life Technologies, NY, EE.UU.) durante 30 min a 37 ° C, después se lavaron dos veces y se incubaron con las células NK durante tres horas en incubadora a 37 ° C y 5% de CO
2. Los detalles del protocolo se describen desde McGinnes et al [32]. El citómetro de flujo se utilizó para analizar las muestras.
Tiempo real
Total de los ARN celulares de cuatro células de melanoma primarios diferentes y dos células sanas se aislaron utilizando Trizol (Life Technologies).
En pocas palabras, 1 g de ARN total fue transcrito invertir usando el kit de transcripción inversa Superíndice III (Life Technologies) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante; los ADNc fueron amplificados utilizando iTaq universal SYBER Green Supermix (BioRad, Segrate (MI), Italia) en presencia de cebadores específicos como se describe anteriormente [33]. Se utilizaron los siguientes cebadores: MHC-I-FW, 5'-CCTTGTGTGGGACTGAGAGG -3; MHC-I-RV, 5'-CAGAGATGGAGACACCTCAGC -3 '. La expresión de gen de mantenimiento gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó para normalizar las muestras, y la cuantificación relativa de HLA de clase I se realizó la aplicación de la 2
-ΔΔCt método [34]. Se utilizaron los siguientes cebadores: GAPDH-FW, 5'-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3 ', GAPDH-RV-5' TCACGCCACAGTTTCCCGGA -3 '
Western Blot Las
La secreción de moléculas MHC de clase I. en el medio acondicionado se confirmó por análisis de transferencia Western. Para la transferencia Western, las células cultivadas en placas de 100 cm se lavaron con solución salina 0,1 M tamponada con fosfato (pH 7,4) (Life Technologies) y, después de eso, se añadieron 2 ml de RPMI libre de suero. Después del tratamiento de estrés, se cosechó el medio. Las células de concentración de proteínas para cada medio tensionado muestra se midió por triplicado utilizando la proteína de fijación de colorante (Bio-Rad) con albúmina de suero humano (Life Technologies) como curva estándar.
Para cada punto experimental, 50 g de células -cultura proteínas del medio fueron transferidos a tubos estériles que contienen acetona fría (20%, w /v) y se precipitó por 30 min en hielo seguido de centrifugación a 15.000 rpm durante 15 min a 4 ° C.
El sobrenadante se decantó, y el sedimento se lavó con acetona fría seguido de la eliminación de toda la acetona. El sedimento se solubilizó posteriormente en LB [31,25 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), 1,25% de SDS, 6,25% de glicerol, 0,06% de azul de bromofenol, y 5% h-mercaptoetanol], resuelto por SDS-PAGE, y se transfiere a membranas de nitrocelulosa.
Después de la adición de la mezcla de bloqueo [5% (w /v) de leche en PBS (pH 7,4) y 0,05% de Tween 20], la membrana se incubó con una dilución 1:100 de ratón anti anticuerpo -HLA, clon W6 /32 (BioLegend,). La señal se detectó con rábano picante anti-ratón de anticuerpo conjugado con peroxidasa secundaria (1:5000; Santa Cruz Biotechnology). La membrana fue desarrollado por reactivos de detección de transferencia Western de quimioluminiscencia-mejorados de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Santa Cruz Biotechnology)
.
La membrana se incubó con solución de tinción con rojo Ponceau S (Sigma-Aldrich) para asegurar de carga de gel uniforme. Un control interno no se utilizó porque es básicamente imposible encontrar una proteína de "limpieza" en las células medio libre de suero que se podrían utilizar como una referencia constante. Ponceau S se puede utilizar ventajosamente más de detección de actina de calidad o control de carga igual en transferencia de Western; por otra parte, tiene una ventaja adicional, es decir, que no se basa en una única proteína para la normalización o control de carga. Esto evita la posibilidad de que las proteínas de "mantenimiento" que se utiliza para este propósito pueden variar en realidad en algunas condiciones o que estén saturados en los niveles de carga necesaria para la detección de productos de baja expresión o que no son detectables como en nuestro ejemplo [35 ].
ATM /ATR señalización análisis cascada
el etopósido (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se disolvió en DMSO y se añadió a la concentración final de 5 mM durante 1 h. Lisados de células enteras se prepararon a partir de células recién recogidas mediante el uso de un tampón de lisis (20 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 10 mM, 0,5% Nonidet P-40, NaCl 400 mM) suplementado con mezcla de inhibidor de proteasa (Calbiochem, Merck Darmstadt , Alemania), PMSF 0,5 mM y ortovanadato de sodio 2 mM. Los lisados se incubaron en hielo durante 15 minutos y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 min. La concentración de proteína de los sobrenadantes se determinó por el ensayo de Biorad (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Para las inmunotransferencias, las muestras se cargaron en tampón de Laemmli en 6% o 10% de Tris-glicina geles de SDS /PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se hibridaron con los anticuerpos apropiados a dilución 1:1000. Las transferencias se desarrollaron por un aumento de quimioluminiscencia (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemania). Anticuerpos: ratón anti-phosphoAtm (Ser 1981) de conejo anti-phosphoChk1 (Ser 345), de conejo anti-phosphoChk2 (Thr 387), de conejo anti-fosfo JNK (Thr183 /Tyr185) (Cell Signaling, Nueva York, NY, EE.UU.), conejo anti -p53 y el ratón anti-MCM7 (Santa Cruz).
El análisis estadístico
Todos los resultados se presentan como media ± SEM. El nivel de significación se determinó por Mann - Whitney. Un valor de p = 0.05 *, ** y p≤0,001 p≤0,0001 **** fue considerado estadísticamente significativo. Los datos se expresan como pliegue cambio respecto al control, establecido como 1.
Resultados
Para entender los efectos potenciales del estrés mecánico sobre la inmunogenicidad de células, el cáncer y las células sanas se destacaron mecánicamente con una microbomba dispositivos y las ondas de choque.
los cambios inducidos por el estrés microbomba entregadas fueron analizados por espectroscopia Raman. mediciones Raman se realizaron para las respectivas celdas (59c Mel, Mel 42a, 103a y 293 Mel línea de células T) en la solución de PBS en el rango espectral entre 700 a 1800 cm
-1. espectros Raman con barra de error la desviación estándar para las células de control (no acentuadas) y células estresados mecánicamente en solución de tampón PBS se muestran en la Fig. 1. espectros Raman de estas células son similares a la característica espectros Raman de la mayoría de las células vivas. Todos los espectros muestran diferentes picos a aproximadamente 780, 850, 1003, 1125, 1445, y 1660 cm
-1. bandas típicas en estos espectros (Fig. 1) están asociados a la conformación de nucleótidos (600-800 cm
-1), la geometría molecular del esqueleto y vibraciones relacionadas con el fosfato (800-1200 cm
-1), nucleótidos ( 1200-1600 cm
-1), y CC y CH
x modos debido a las proteínas y los lípidos [36]. Las vibraciones de amidas, tales como la banda I de amida (debido a C = O de estiramiento, 1650-1700 cm
-1) y la banda de amida III (debido a la CN de estiramiento, y NH flexión, sobre 1250 cm
- 1) en las proteínas son fácilmente distinguibles [37]. La amida I bandas en el rango entre 1650-1700 cm
-1 dar también información muy importante sobre el estado de confirmación de la estructura secundaria (α-hélice, β-hoja y la estructura espiral aleatoria) de las proteínas. Aminoácidos diferentes se pueden reconocer de forma explícita en alrededor de 1003, 1011 y 1032 cm
-1 en los espectros Raman [37].
Los espectros Raman para el control e hizo hincapié en las líneas celulares de cáncer (Mel 59c (A), Mel 42a (B), Mel 103b (C) y 293T (D)) con la barra de error la desviación estándar. Los espectros se realizaron antes y después de la tensión mecánica con microbomba.
La variación de la concentración relativa de proteína en diferentes células se calculó mediante el uso de ajuste de estas dos regiones de bandas de proteínas a alrededor de 1440 y 1650 cm
-1. Higo. 2 muestra, para varios tipos de células, la variación en la intensidad relativa de la membrana celular de proteína /lípido (1440 cm
-1) y α-hélice (1,650 cm
-1) banda antes y después de la aplicación de tensión mecánica . Se observó una clara disminución de la cantidad de proteínas y su estructura secundaria α-hélice en el tratamiento de células tensión mecánica.
área normalizada de la banda centrada en torno a 1440 (arriba) y 1670 cm
-1 (hacia abajo) para todas las líneas celulares, que muestra la variación de la concentración de proteína y el contenido α-hélice relativa sobre la superficie celular.
Una imagen muy clara puede ser revelado a partir de la variación de la estructura secundaria después de emplear la tensión mecánica. Se muestra la reducción de la α-hélice de estructura secundaria de la banda de amida I para todas las células con la tensión mecánica. Esta tendencia no se observa claramente en Mel 42a celdas para las que el espectro es muy ruidoso (fig. 1B). Además, en el análisis profundo, se encuentra que la 59c Mel y 293 células T se comportan de manera similar. Todas las líneas celulares investigados muestran una estructura secundaria disminución en la tensión mecánica. El enfriamiento de la estructura α-hélice y un incremento de la fluorescencia de fondo, así puede ser observado claramente. Estas alteraciones en los espectros Raman son consistentes con nuestra informado anteriormente conclusiones acerca de la detección de MHC de clase I por espectroscopia Raman [38].
Además, análisis de componentes principales (PCA) se realiza para discriminar el subrayado con las células control de cada uno de las líneas celulares. PCA, un análisis estadístico, reduce la dimensionalidad del conjunto de datos multidimensional, manteniendo la característica de todos los espectros [31]. Los puntos de dimensión reducida de cada espectro es descrito por un número limitado de variables, llamadas componentes principales (PC). Estos ordenadores incorporan la mayor parte de la información espectral. Higo. 3 representa el análisis de componentes principales (PC1 vs PC2, PC3 y PC2 vs vs PC1 PC3) de todas las líneas celulares en el rango de 700 a 1800 cm
-1. Los bloques rellenos son para las células de control, mientras que los bloques vacíos están asociados al estrés células. Las células de estrés pueden estar bien distingue de las células de control y, además, cada uno de las líneas celulares se pueden encontrar en-agrupados claramente en la figura. Estos resultados revelan una manera interesante e importante distinguir entre las células y también si se han perturbado las células externamente
análisis de PCA en las células de control y de tensión para diversas líneas celulares.; Mel 42a, 59c Mel, Mel 103b y 293T. a) PC1 vs PC2, b) vs PC2 PC3 y c) vs. PC1 PC3.
Para confirmar que la tensión mecánica induce una baja regulación de MHC de clase I en las células superficiales , hemos realizado un ensayo inmunofenotipo para todos los diferentes tipos de células.
Después de un tratamiento de alimentación 1 bar, se observó por ondas de choque, MICROPUMP y una clara reducción de los niveles de MHC de clase I en la membrana de las células tumorales (Fig. 4A), mientras que no se observaron cambios en las células a las células sanas, fibroblastos, macrófagos, linfocitos y dendríticas, se destacaron (Fig. 4B). Los análisis estadísticos se realizaron en células tumorales (de melanoma y células IM9 líneas, fig. 4C) y las células sanas (de fibroblastos, macrófagos, células dendríticas y linfocitos, fig. 4D).
Panel A muestra la disminución de la MHC moléculas de clase I de expresión en las células cancerosas (5 melanoma y una líneas de células linfoblastoides) después del tratamiento tensión mecánica por medio de la microbomba (parte superior) y las ondas de choque (parte baja) en comparación con las células no tratadas. Panel B informa sobre el efecto del estrés mecánico sobre algunas células sanas (fibroblastos y macrófagos) de la clase I del MHC con los dos tratamientos mencionados. El control isotópico relacionados IMF dio la misma señal en paralelo de todas las líneas celulares utilizadas, por lo tanto, se han omitido. Panel C representa los valores estadísticos de disminución pliegue de la MHC-I realizó en células de melanoma (n = 4 experimento separado con microbomba y n = 4 experimento separado con ondas de choque; p & lt; 0,05) y IM9 células (n = 10 experimento separado con ondas de choque; p & lt; 0,0001). La disminución pliegue de MHC-I se deriva de la mediana de intensidad de fluorescencia (MFI) de las moléculas de MHC-I antes y después del tratamiento de las líneas celulares de melanoma y IM9. El panel D muestra los valores estadísticos obtenidos a partir de diferentes experimento (n = 3) para cada tipo de células sanas. Los fibroblastos y de los PBL se destacó con la microbomba mientras que los macrófagos y células dendríticas fueron tratados con ondas de choque. El valor reportado en el panel D no es estadísticamente significativa.
Las otras moléculas inmunogénicas analizados, tales como MICA, MICB, ULBPs, PVR y Nectin-2, no mostró cambios significativos entre el control y las células estresadas con ondas de choque (S2 Fig.). Para comprender el efecto de la disminución de la expresión de MHC de clase I en subrayado mecánicamente inmunogenicidad células tumorales, ensayos funcionales se realizaron utilizando tanto las ondas de dispositivos, microbomba y de choque. En este documento, las células NK susceptibilidad de las células diana tumorales estresados mecánicamente se comparó con los controles no acentuadas por ensayos de citotoxicidad clásicos. Se observó un aumento claro y reproducible en la susceptibilidad NK después de tratamiento de estrés mecánico. La gama de aumento de porcentaje de lisis NK sobre las células tumorales fue de entre 30 a 70% (Fig. 5A-E), mientras que las células sanas, es decir, de fibroblastos (Fig. 5F), no respondieron al tratamiento tensión mecánica. Los resultados muestran que la tensión mecánica mejora el reconocimiento NK para el tumor con significación estadística (Fig. 5G-H), pero no para las células sanas. El estrés mecánico cambia el fenotipo tumoral de ser resistentes a NK NK susceptible. Este cambio en la susceptibilidad NK se correlaciona con la pérdida de la I-MHC de clase específica de tumor. Las moléculas de MHC de clase I son los ligandos inhibidores más potentes para los receptores de NK. El MHC de clase I regulación a la baja en las células tumorales a desencadenar la respuesta NK en consecuencia con el "Missing auto hipótesis" [21]. Los datos aquí recogidos indican que un derramamiento de MHC-I se produce después de la tensión mecánica de la superficie de las células tumorales, este no es el caso para las células sanas. Nuestro descubrimiento indica un efecto inmunológicamente relevante de la tensión mecánica sobre la sensibilidad del tumor al ataque citotóxico
reconocimiento de las células NK de objetivos diferentes de células tumorales en diferentes E /T (efector /diana) por cantidad. 59c, 42a, 66b ( líneas de células de melanoma), 293T (carcinoma de riñón) y IM9 (líneas lymphoblastoidcell) antes () y después (negro) la tensión mecánica gris. El Mel 42a, 66b Mel, células de fibroblastos (paneles B, E, y F) fueron tratados con la microbomba, el 59c Mel, IM9, se hizo hincapié en las células T 293 (paneles A, C y D) con las ondas de choque. A medida que las células diana saludables, en este caso se muestran los fibroblastos. experimentos representativos se informaron para cada tipo de célula. Los paneles G y H muestran las estadísticas derivadas de tres ensayos funcionales diferentes, utilizando linfocitos NK como células efectoras (E) y células IM9 y el melanoma como objetivos (T). Las células diana IM9 se trataron con las ondas de choque (panel G: n = 3, p = 0,0325), mientras que las células diana de melanoma se destacó con la microbomba (panel H, n = 3, p = 0,0186). E ratio de /T 12/1, p & lt;. 0.05
El aumento de la citotoxicidad de células observado en ensayos clásicos de citotoxicidad NK no se debió por la muerte de células diana pasiva inducida por tratamientos de estrés mecánico, sino más bien por NK activo